서 론
비만은 식이로부터 섭취하는 에너지와 생활 및 운동으로 소비되는 에너지 불균형에 따른 잉여 에너지가 지방으로 축적되어 발생하는데, 이 외에도 유전적, 환경적 요인 등 다양한 요인들이 복합적으로 작용하여 나타난다(1,2). 비만 은 그 자체로써도 심각한 문제이지만 심장혈관질환과 고지 혈증, 당뇨병 등 만성 퇴행성 질환의 위험요인이기 때문에 심각한 사회적 문제로 대두되고 있다. 특히 심혈관계 질환 은 매우 높은 유병률을 보이고 있는데, 서구화된 식단으로 의 변화는 동물성 식품의 지속적인 섭취증가를 가져온 반 면, 식이섬유의 섭취는 감소함으로써 지질대사의 이상으로 인한 비만, 고지혈증, 동맥경화, 심근경색 등 순환기계 질병 으로 인한 사망률이 급속히 증가하는 추세에 있다(3-5). 이 중에서 고지혈증은 심혈관계 질환과 가장 연관성이 높은 것으로 알려져 있으며, 혈중 콜레스테롤 및 중성지방 농도 를 정상 수준으로 유지하는 것은 건강을 위하여 중요한 요건이 된다. 이에 많은 선행 연구들은 혈중 지질 수준을 개선시킬 수 있는 식품과 영양소에 관심을 두고, 이를 함유 한 건강기능 식품 개발에 노력하고 있다(6).
더덕(Codonopsis lancelata)은 초롱과에 속하는 다년생 숙근초로써 inulin과 saponin, flavonoid 등의 성분을 많이 함유하고 있으며(7) 다른 산채에 비해 단백질, 탄수화물, 지방이 많이 들어 있고, 칼슘, 인, 철분 같은 무기질과 비타 민B1, B2가 풍부하다(8). 예로부터 한방에서는 사삼(沙蔘)이 라 하여 산삼에 버금가는 약효로 한방에서 폐 기운을 돋워 주고 가래를 없애주는 약재로 사용되어 강장, 해열, 거담, 해독 및 배농 등의 질병치료의 목적으로 사용되고 있다(9). 더덕은 껍질의 물 추출물의 항산화 효과(10), 항산화물에 의한 천식 억제효과(11), 더덕의 간 보호 효과(12), 더덕 물 추출물의 생체의 세포성 면역반응 항진효과(13),더덕 분획물의 항비만 효과(14), 더덕 분획물 중 n-hexane층의 멜라닌 생합성 저해효과(15), 더덕의 항균 효과(16) 등의 다양한 효능이 있음을 확인하였다. 실험에 사용한 섬더덕 은 바닷바람과 오염되지 않은 환경에서 재배되어 육지더덕 보다 육질이 연하고 향이 연하며, 조직이 부드럽고 맛과 영양이 풍부하다. 그로인해 육지더덕보다 더 우수한 효능 을 기대해 볼 수 있다. 따라서 본 연구에서는 C57BL/6J 마우스를 사용하여 고지방식이로 비만을 유발시킨 후 섬더 덕 추출물의 섭취에 따른 지질대사 개선 효과를 밝히고, 비만 환자를 위한 건강기능성 식품 소재로써 활용가능성을 제시하고자 본 연구를 수행하였다.
재료 및 방법
본 실험에서 사용한 섬더덕은 울릉옥천식품에서 2010년 10월에 구입하여 사용하였다. 시료를 열풍건조 시킨 후 건 식분쇄기(HMF-3250S, Hanil, Seoul, Korea)를 이용하여 분 쇄한 다음 50 mesh 체로 쳐서 추출에 사용하였다. 추출은 건조 시료 30 g에 60% 에탄올 10배의 양을 가하여 실온에서 12시간 교반추출 하여 추출수율은 44.80%가 나왔다. 추출 물은 원심분리 및 여과하여 농축 후 동결 건조하여 실험에 사용하였다.
생후 4주령(16～18 g)된 C57BL/6J mice계의 수컷 검은 쥐를 (주)오리엔트(Orient bio Co., Seoul, Korea)로부터 분양 받아, 1주간 Lab. chow pellet식이로 사육하여 적응기를 거 친 다음 정상식이군(ND)을 제외한 실험동물에 고지방식이 를 9주간 급여시켜 비만형 마우스로 유발시켰다. 고지방식 이 공급으로 비만에 의해 당뇨위험수치에 도달한 실험동물 에 한해 난괴법(randomized block design)에 의해 고지방식 이군(HFD), positive control로 사용된 0.05% metformin 첨가 군(PC), 2% 섬더덕 추출물 첨가군(UCL)으로 나누었으며, 당뇨를 유발시키지 않은 정상식이군(ND)을 포함하여 총 4군을 대상으로 5주 동안 동물실험을 수행하였다(Table 1). ND군은 정상식이(AIN76 normal diet)를 급여하였고 HFD 군은 고지방식이(high fat diet)를, UCL군은 고지방식이에 섬더덕 에탄올 추출물을 2% 수준으로 배합한 실험 식이를 공급하였으며 양성대조군으로는 0.05%의 metformin을 배 합하여 공급하였다(Table 2). 동물 사육실에 사육환경은 항 온(25±2℃), 항습(50±5%)을 유지시켰고, 12시간 간격으로 사육기간 동안 light cycle을 유지하여 개개의 stainless cage 안에서 사육하였다. 식이와 물은 자유 섭취시켰으며, 모든 실험 식이는 사육기간 동안 냉장 보관하였다. 식이섭취량 은 매일 일정한 시각에 측정해 급여량에서 잔량을 감하여 계산하였다.
| Group | Diet |
|---|---|
| ND | Normal diet1) |
| HFD | High fat die |
| PC | Hugh fat diet+metformin (0.05%) |
| UCL | High fat diet+Codonopsis lancelata 60% EtOH extract (2%) |
실험동물의 체중은 매주 같은 시간에 측정하였으며 실험 동물의 장기 및 지방조직의 중량은 희생 시에 채혈 후 즉시 적출하여 phosphate buffered saline(PBS) 용액으로 수차례 헹군 후 표면의 수분을 제거하여 칭량하여 그룹별로 비교하 였다.
실험이 완료 된 동물은 희생 전 12시간 동안 절식시킨 후 에테르를 흡입시켜 마취시킨 다음 복부 하대정맥으로부 터 혈액을 채취하였다. 혈액을 30분간 상온에 방치한 뒤 3,000 rpm, 4℃에서 15분간 원심 분리하여 적혈구와 혈장을 분리하였다. 실험동물의 장기조직은 채혈 후 즉시 적출하 여 PBS 용액으로 수차례 헹군 후 표면의 수분을 제거하여 칭량 후, 즉시 액체질소로 급냉시켜 -70℃에 보관하였다.
콜레스테롤 정량은 Allain의 효소법(17)을 응용한 정량용 kit(Asan kit, Asan Co., Seoul, Korea)로 측정하였다. 혈청 콜레스테롤은 cholesterol esterase에 의해 지방산과 유리 콜 레스테롤로 전환되며, 전환된 유리콜레스테롤에 cholesterol oxidase를 반응시키면 H2O2와 Δ4-cholestenon이 생성된다. 이 중 H2O2를 peroxidase 및 phenol, 4-amino-antipyrine과 혼합하여 적색으로 발색시킨 후, 500 nm에서 흡광도를 측 정하여 콜레스테롤 표준용액(300 mg/dL)과 비교하여 정량 하였다.
중성지방의 정량은 McGowan 등의 효소법(18)을 이용한 발색법 원리에 따라 중성지방 측정용 시약(Asan kit, Asan Co.)을 사용하여 측정하였다. 중성지질은 lipoprotein lipase (LPL)를 이용하여 글리세린과 지방산으로 분해시킨 후 ATP와 glycerol kinase (GK)를 첨가하여 L-α -phosphoglycerol로 전환시켰다. 여기에 O2, glycerophospho oxidase(GPO)를 첨가하여 반응시키면 H2O2가 발생하는데, 이에 peroxidase와 4-aminoantipyrin을 처리하여 적색으로 발색시킨 후 550 nm에서 흡광도를 측정하여 글리세롤 표준 용액(300 mg/dL)과 비교하여 정량하였다.
혈장 및 간조직의 HDL-cholesterol은 HDL-콜레스테롤 측정용 시약(Asan kit, Asan Co.)을 사용하여 측정하였다. 시료 100 μL를 취하여 인텅스텐 나트륨 500 μL과 염화마그 네슘 1 mg을 처리하면 인텅스텐산과 마그네슘 양이온의 작용으로 지단백질 중 apo B를 포함하는 LDL 및 VLDL이 침전된다. 이를 원심분리한 후 상징액에 남은 HDL 중의 총콜레스테롤과 같은 방법으로 발색반응 시켜 500 nm에서 흡광도를 측정하고, 콜레스테롤 표준용액(50 mg/dL)과 비 교하여 정량하였다.
심혈관계 질환의 위험도 판정에 사용되는 TC/HDL-cholesterol ratio는 아래와 같은 식을 사용하였고, atherogenic index(AI)는 혈장 중 total cholesterol 농도에서 HDL cholesterol을 뺀 값에 대한 HDL-cholesterol 농도의 비로 아래와 같은 식에 의해서 산출되었다.
TC/HDL-cholesterol ratio = [(total cholesterol)/(HDL-cholesterol)]
Atherogenic index = (total cholesterol-HDL cholesterol)/HDL cholesterol)
Western blot 실험을 위하여 실험동물의 간 조직을 ice cold-PBS(phosphate buffered saline)로 2～3회 잘 세척한 후 pH 8.0, 150 mM tris NaCl, 0.02% sodium azide, 0.2% SDS (sodium dodecyl sulfate), PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride) 100 μg/mL, aprotinin 50 μg/mL, 1% NP-40, 100 mM NaF, 0.5% sodium deoxycholate, 0.5 mM EDTA, 0.1 mM EGTA로 조성 된 RIPA buffer 200 μL를 넣어 균질화 하고 13,000 rpm에서 20분간 원심 분리하여 상징액을 분리 하였다. 20 μg으로 정량한 단백질은 sodium dodesyl sulfatepolyacryl-amidegel electrophoresis(SDS-PAGE)에 의 하여 분리되고, PDVF membrane으로 전이시켰다. 단백질 이 전이된 membrane을 5% skim milk가 포함된 TBST로 blocking한 후 TBST에 적당한 농도로 희석시킨 각각의 1차 항체(SREBP-1, PPARα, FAS, ACC, β-actin)로 4°C에서 밤 새 반응시킨 후 HRP conjugated 2차 항체로 실온에서 2시간 반응시켜 ECL solution을 이용하여 x-ray film에 현상하였다.
결과 및 고찰
실험 식이를 공급하기 전의 몸무게를 초기체중으로 측정 하였으며 최종체중은 희생 직전의 몸무게를 측정하였다. 실험 식이는 하루 당 약 3～5 g을 섭취하였으며 섬더덕 추출물을 공급한 군에서는 식이섭취량에 비해 몸무게가 감소하였다(Table 3). HFD군에서 실험 종료 전의 몸무게가 28.42 g에서 32.61 g으로 4.19 g증가하였고, PC군은 28.37 g에서 29.69 g으로 0.95 g증가하였다. UCL군에서는 몸무게 가 증가하지 않고 28.74 g에서 0.07 g정도 오히려 감소하였 다. 또한 식이섭취량에 비해 식이효율이 낮아 체중 증가 억제 효과가 있는 것으로 생각된다.
고지방식이와 섬더덕 추출물을 5주간 공급한 마우스의 장기 및 지방조직 무게를 비교한 결과는 Table 4와 같다. 고지방식이군에서 장기와 지방 무게가 증가한 것을 확인하 였으며, 섬더덕 추출물을 공급한 군에서 장기 및 지방의 무게가 전반적으로 감소함을 확인하였다. 그러나 유의적인 차이를 나타내지 않았으며 지방 무게에서만 유의적인 차이 를 나타냈다.
지방조직은 중성지방의 형태로 지방을 저장하고, 유리지 방산을 배출하여 간에 제공하는 역할을 함으로써 체내 지질 대사에서 중요한 역할을 한다(19). 본 연구에서 고지방식이 군은 정상군보다 백색지방에 해당하는 신장지방과 부고환 지방의 무게가 4배 이상 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었으며, 신장지방과 부고환지방의 무게는 섬더덕 추 출물을 공급한 군에서 고지방식이군보다 각각 0.40 g, 0.87 g 정도 감소된 것을 확인하였다(Table 4).
Park (20)의 고지방식이를 섭취한 흰쥐에서 숙성더덕추 출물이 혈청지질농도개선 효과에 미치는 영향이라는 연구 에서는 고지방식이에 의한 간, 비장, 신장의 장기 무게 변화 는 있었으나, 숙성더덕추출물 투여에 의한 유의성 있는 무게 변화는 관찰되지 않았다는 보고와 유사한 것으로 나타났다.
고지방식이를 섭취하는 동물에서 섬더덕 추출물의 공급 에 따른 혈장 내 지질함량의 결과는 Table 5와 같다. 혈장 내 중성지질 함량은 정상식이군의 경우 62.36 mg/dL이었 고, 이에 비해 고지방식이군에서는 223.27 mg/dL로 약 160% 증가하였다. 고지방식이군이 정상식이군보다 혈장 중성지방 함량이 현저히 높게 나타났는데 이는 Cohen 등 (21)의 보고와 유사한 결과이며, 반면 섬더덕 추출물을 공급 한 군에서는 160.69 mg/dL로 고지방식이군에 비해 28% 정도 감소하였다. 혈장 내 총 콜레스테롤 함량은 일반 식이 를 공급한 정상대조군에 비해 고지방식이만 공급한 대조군 에서 약 2배 이상의 함량을 보였으며 섬더덕 추출물을 공급 한 군에서는 고지방식이군에 비해 총콜레스테롤 함량이 약 43% 감소한 것을 확인할 수 있었다.
사포닌은 콜레스테롤과 직접 작용을 하여 콜레스테롤의 흡수를 막는 불용성 화합물을 만들기도 하고 담즙산과 작용 을 하여 변을 통한 담즙산의 배설을 증가시킴으로써 간접적 으로 콜레스테롤 대사에 영향을 미쳐 콜레스테롤의 수준을 저하시킨다(22,23)고 알려져 있다. 또한 Han 등(24)과 Kang 과 Joo는(25) 더덕과 인삼의 혈청 콜레스테롤 강하 효과를 더덕과 인삼의 성분 중 사포닌의 작용으로 설명하고 있다. 본 실험에서 섬더덕 추출물을 공급한 군에서 콜레스테롤이 유의적으로 감소한 것은 더덕 에탄올 추출물 중 사포닌의 작용 때문으로 생각된다.
HDL-콜레스테롤은 항동맥 경화 지표로써 조직의 콜레 스테롤을 간으로 운반하여 제거하는 역할을 하며, 특히 심 혈관계 질환자의 경우 낮은 HDL-콜레스테롤 수준을 나타 내는 것으로 보고되어 있다(26). HDL-콜레스테롤의 함량 은 고지방식이군에 비해 약 40% 증가함을 알 수 있었다. 따라서 섬더덕 추출물은 혈청 지질개선 효과에 기인하는 것으로 생각된다.
심혈관계 질환의 위험도 판정에 사용되는 수치인 TC/HDL-chloesterol ratio에 미치는 영향을 비교 관찰한 결 과, ND군은 2.27 index, HFD군은 5.63 index로 나왔으며, UCL군에서는1.57 index로낮은수치를나타냈다. Atherogenic index에 미치는 영향을 비교 관찰한 결과, ND군(1.28 index) 보다 UCL군(0.57 index)에서 낮은 수치를 나타냄을 알 수 있었다. 본 실험 결과, 마우스에 섬더덕 추출물을 공급함으 로써 중성지방과 총콜레스테롤의 수치를 유의적으로 감소 시켰으며 HDL-콜레스테롤 수치는 증가시켰다. 동맥경화 지수 또한 낮추어 주는 것으로 나타났다.
섬더덕 에탄올 추출물을 첨가한 식이가 지방 생성에 미 치는 영향을 알아보기 위하여 간 조직에서 PPARα, SREBP-1, ACC, FAS 단백질 발현정도를 살펴보았다(Fig. 1).
Lipogenesis가 일어나는 동안 SREBP-1과 fatty acid synthase (FAS)와 같은 지질 생성 관련 유전자의 발현이 증가한다(27,28). SREBP-1는 acyl-CoA carboxylase(ACC), FAS 및 SCD-1과 같이 지방산 합성을 조절하는 여러 유전자 의 발현을 제어함으로써 지방산 합성을 유도하게 된다(29).
본 연구결과 고지방식이군의 간 조직에서 PPARα, SREBP-1, ACC, FAS 단백질 발현은 증가한 반면, 섬더덕 에탄올 추출물을 첨가한 식이군에서 지방분해에 관여하는 PPARα의 경우 약간의 감소 수치를 나타내었다. 동물에서 체지방 조절에 결정적인 역할을 하는 SREBP-1과 간세포에 서의 중성지방 합성과 관련 있는 ACC, 지방산 합성효소 생산에 관여하는 FAS의 경우 모두 그 발현양이 고지방식이 군보다 각각 40%, 90%, 60%의 수치가 감소함을 알 수 있었 다. 섬더덕 추출물은 지방 생성 관련 단백질의 발현을 조절 하여 지방세포의 증식과 분화 기능을 억제함으로써 체내 지방 형성과 축적을 저해하는 것으로 생각되며, 본 결과는 섬더덕 추출물이 체중 감소에 기능성이 있음을 나타낸다.
요 약
본 연구는 섬더덕의 항비만 효능과 지질대사 개선효과를 알아보기 위해 C57BL/6J 4주령의 마우스에게 고지방식이 를 9주간 급여하여 비만을 유발한 후 섬더덕 추출물을 첨가 한 식이를 5주간 먹여 실험하였다. 체중은 고지방식이군에 서 유의적으로 증가하였으며, 섬더덕 추출물을 먹인 마우 스에서 유의적인 감소를 하였다. 식이효율 결과 또한 섬더 덕 추출물을 공급한 군이 고지방식이군보다 통계적으로 유의하게 낮은 것으로 나타났다. 장기 및 지방무게에서도 고지방식이군에서 무게가 증가한 것을 확인하였고, 섬더덕 추출물을 공급한 군에서 장기 및 지방의 무게가 전반적으로 감소한 것을 알 수 있었다. 혈장을 이용한 중성지방, 총콜레 스테롤, 고밀도콜레스테롤을 측정한 결과 섬더덕 추출물을 공급한 군에서 중성지방과 총콜레스테롤은 유의적으로 감 소하였고, 고밀도콜레스테롤은 유의적으로 증가함을 확인 할 수 있었다. 동맥경화 지수와 심혈관계 위험도 지수는 감소된 것을 확인할 수 있었다. Western blot을 통해 지방관 련 단백질 발현양상을 본 결과 지방분해에 관여하는 PPAR α의 경우 섬더덕 추출물을 급여함으로써 발현양이 증가하 였으며, 지방생성 관련 단백질인 SREBP-1, FAS, ACC의 경우 고지방식이군과 비교 시, 섬더덕 추출물을 공급한 군 에서 억제되었다. 이상의 결과로 섬더덕 추출물의 섭취는 체중 감소와 더불어 혈장 지질수준 개선에도 도움을 줄 수 있음을 제시하였다.
