초미세 분쇄한 삼백초(Saururus chinensis) 추출물의 항산화, angiotensinconverting enzyme 및 xanthin oxidase 억제 활성

본 실험에서 사용된 시료는 건조 시킨 삼백초잎을 mixer 를 사용하여 분쇄하여 40 mesh를 통과한 분말을 일반분쇄 시료로 하였다. 초미세분쇄 시료는 삼백초잎을 한국생명공 학연구원 정읍 분원에 있는 10 L 용량의 초미세 분쇄 장치 (MKFS10-1, Koen 21 Co., Ansan, Korea)를 이용하여 시간 당 20 kg의 grinding 속도로 fine grinding(125 μm ISO mesh size, ASTM 140 mesh : 미통과 사이즈)와 ultrafine grinding(125 μm ISO mesh size, ASTM 140 mesh : 통과 사이즈)으로 나누어 시료로 사용하였다.

시료 1 g에 증류수 200 mL을 넣고 액이 100 mL이 될 때까지 가열한 후 냉각하고 ethanol 추출물은 시료에 100 mL의 60% ethanol을 가하고 homogenizer로 20,000 rpm에 서 1분간 균질화 시킨 후 24시간 동안 교반 추출하였으며, 추출액은 Whatman No.1 filter paper로 여과한 후 필요에 따라 rotary vacuum evaporator(Eyela NE, Tokyo, Japan)에서 농축하여 시료로 사용하였다.

Phenol성 화합물의 정량은 Kim 등의 방법(14)으로 측정 하였으며, 시료 1 mL에 95% ethanol 1 mL와 증류수 5 mL를 첨가하고 1 N Folin-Ciocalteu reagent 0.5 mL를 넣어 잘 섞어주고, 5분간 방치한 후, 5% Na₂CO₃ 1 mL를 가한 후, 흡광도 725 nm에서 1시간 이내에 측정하여 gallic acid를 이용한 표준곡선으로부터 양을 환산하였다.

DPPH(2,2'-diphenyl-1-picrylhydrazyl) radical에 대한 소 거활성은 Blois의 방법(15)에 준하여 측정하였다. 각 시료 0.5 mL에 60 μM DPPH 3 mL를 넣고 vortex한 후 15분 동안 방치한 다음 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 전자 공여능은 다음의 식으로 나타내었다.

ABTS〔2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)〕radical cation decolorization의 측정은 Pellegrin 등의 방법(16)으로 측정하였다. 즉, 7 mM ABTS 5 mL과 140 mM K₂S₂O₈ 88 μL를 섞어 어두운 곳에 16시간정도 방치한 용액 1 mL과 ethanol 88 mL를 혼합한 ABTS solution 1 mL과 시료용액 50 μL를 혼합하여 30초간 진탕한 후 2분 30초간 incubation하고 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS radical cation decolorization 효과는 percentage inhibition(%)으로 나타내었다.

PF는 Andarwulan과 Shetty의 방법(17)으로 측정하였다. 10 mg의 β-carotene/50 mL chloroform 용액 1 mL를 evaporator용 수기에 넣고 40℃ water bath에서 chloroform을 증발시킨 후, 20 μL linoleic acid, 184 μL Tween 40과 50 mL H₂O₂를 가하여 emulsion을 만들고, 5 mL의 emulsion을 시료용액 100 μL에 혼합하여 잘 섞어준 뒤 50℃에서 30분간 반응시켜 냉각시킨 다음, 470 nm에서 흡광도를 측정하였고 PF는 다음의 식으로 계산하였다.

TBARS는 Burge와 Aust의 방법(18)에 따라 측정하였다. 1% linoleic acid와 1% Tween 40으로 emulsion을 만들고 emulsion 0.8 mL와 시료 0.2 mL를 섞은 후 50℃ water bath에 서 10시간 반응시켰다. 반응 후 반응액 1 mL에 TBA/TCA 시약 2 mL를 가하고 15분간 boiling한 다음 10분간 냉각시 킨 후 15분간 1000 rpm으로 원심분리하여 실온에서 10분간 방치 후 상징액을 532 nm에서 흡광도를 측정하였다. TBARS값은 1 mL 반응혼합물에 대해서 생성된 1,1,3,3- tetraethoxypropane(TEP)의 μg으로 표시하였다.

ACE 저해효과 측정은 Cushman 등의 방법(19)으로 행하 였다. 즉, 반응구는 0.3 M NaCl을 함유하는 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 8.3)에 기질인 hippuryl-L-histidyl-Lleucine( HHL, Sigma, USA) 2.5 mM을 녹인 액 0.15 mL, ACE(0.25 unit/mL, Sigma, USA) 0.1 mL와 각 추출시료 용액 0.1 mL를 혼합하였으며, 대조구는 추출시료 대신 증류수 0.1 mL를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시키고, 1 N HCl 0.25 mL 첨가로 반응을 중지시킨 뒤 3 mL의 ethylacetate를 첨가하였다. Ethylacetate 층으로부터 용매를 증류시킨 잔사 에 2 mL의 증류수를 첨가하여 추출된 hippuric acid를 spectrophotometer를 사용하여 흡광도 280 nm에서 측정한 후 다음 식에 따라 저해율(%)을 구하였다.

Xanthin oxidase(XOase) 활성저해 측정법은 Stirpe와 Corte의 방법(20)에 준하여 측정하였다. 즉, 반응구는 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 7.5)에 xanthine 2 mM을 녹인 기질액 3 mL에 효소액 0.1 mL와 추출용액 0.3 mL를 넣고 대조구에는 추출용액 대신 증류수를 0.3 mL 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시키고 20% trichloroacetic acid (TCA) 1 mL를 가하여 반응을 종료시킨 다음 원심분리하여 단백질을 제거한 후 반응액 중에 생성된 uric acid를 흡광도 292 nm에서 측정하여 다음 식으로 저해율을 구하였다.

식중독의 원인균인 Staphylococcus aureus 표준균주인 KCTC 1039와 병원성 대장균인 Escherichia coli로서 표준 균주인 KCTC 1039, 충치원인균인 Streptococcus mutans로 서 표준균주인 KCTC 7965 및 위, 십이지장궤양 원인균인 Helicobacter pylori로서 표준균주인 ATCC 43504를 사용하 였고, St. mutans 및H. pylori 배양은 미호기성 조건을 유지 시켜주기 위해서 10% CO2 incubator를 이용하였고, incubator의 습도는 항상 95% 이상으로 유지하였으며, agar plate상에서 배양은 37℃로 48∼72시간 동안 실시하였다 (21).

항균력 측정은 paper disc법을 이용하여 측정하였다. 즉, 평판배지에 배양된 각 균주를 1 백금이 취해서 액체배지 10 mL에서 18∼24시간 배양하여 활성화시킨 후 다시 액체 배지 10mL에 균액을 0.1mL 접종하여 3∼6시간 본 배양한 후 평판배지 1개당 균수가 약 1×10⁷ cells되게 접종하여 멸균 면봉으로 균일하게 도말하였다. Disc diffusion method 에 의한 항균활성 검색은 최적배지 agar plate에 준비한 균 배양액 100 μL를 분주하여 멸균 유리봉으로 도말한 다음, 멸균된 지름 8 mm 크기의 disc paper를 올려놓고 0.45 μm membrane filter로 제균한 시료용액 100 μL에 phenolics 농도 가 50 μg/100 μL, 100 μg/100 μL, 150 μg/100 μL 및 200 μg/100 μL가 되도록 각각 분주하였다. 대조구로는 멸균수 100 μL를 흡수시켜 24시간 동안 배양하여, disc 주위의 clear zone 생성 유무와 직경을 측정함으로써 항균활성을 계산하 였다(22).

실험 결과는 3번 이상 반복하여 측정한 후 평균값으로 나타내었으며, 실험결과의 통계분석은 SAS(Statistical Analysis System, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)의 Duncan’s multiple range test를 이용하여 평균값간의 유의성 검정(p<0.05)을 하였다.

식물계에 널리 분포되어 있으며, 삼백초잎에도 많은 양 이 함유되어 있다고 알려진 phenolic compounds는 식물 2차 대사산물의 한 종류로 분자구조에 hydroxyl기를 가지고 있 기 때문에 단백질 등의 거대 분자들과 결합함으로서 여러 생리 기능을 가진다고 보고되어 있다(23).

초미세 분쇄 기술은 해당 물질의 표면적을 극대화시킴으 로 분해가 어려운 물질들의 용해도를 높이는 장점이 있다. 또한 상대적으로 유용성 물질인 phenolic 화합물의 추출 수율을 높이고 추출 또한 용이하게 된다. 이러한 초미세 분쇄 기술은 1차 가공처리 기술을 넘어서 한약재 추출물의 용해도를 증진시켜 체내 흡수율 증가시킴으로 기능성 식품 소재나 식의약 소재 등 고부가 가치소재로 전환을 기대할 수 있다(24,25). 따라서 삼백초잎으로 부터 생리활성에 관 여하는 phenolic compounds를 추출하기 위하여 일반분쇄, 미세분쇄 및 초미세분쇄 추출 등 추출방법을 달리하여 phenolic compounds의 용출량을 알아보았다. 그 결과 Table 1에서와 같이 물보다 ethanol을 이용하는 것이 효과적이며, 초미세 분쇄를 하였을 때 추출 수율이 증가하여 입자 크기 에 대한 추출수율이 입자가 작아질수록 추출수율이 높아져 약2.5배 높은 추출수율을 나타내었다. 유기용매로 추출하 는 것이 물을 용매로 하여 추출하였을 때 보다 높은 추출율 을 나타내어 삼백초 잎의 phenolic compounds가 극성용매 에서 용해도가 높은 것으로 확인되어 유기용매에서 phenolic compounds의 추출수율이 높다는 Shin의 결과(26) 와 유사하였다.

전자공여능 측정에 사용되는 2,2'-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)는 고유의 흡수 스펙트럼을 나타내지만, phenolic compounds와 같이 전자공여체와 반응하게 되면 전자 hydrogen radical을 받아 안정한 분자가 된다. 또한 공여된 전자는 비가역적으로 결합하여 그 수에 비례하여 진보라색 의 DPPH의 색깔이 점점 옅어지게 된다(27).

삼백초 잎 추출물을 이용하여 일반추출과 미세분쇄 및 초미세분쇄 후 추출 등 추출방법을 달리하여 추출한 추출물 들에 대하여 전자공여능을 측정한 결과 Table 2에서와 같이 일반분쇄한 시료추출물에서 69.8%의 전자공여능 억제효 과가 관찰되었고, 미세분쇄와 초미세분쇄 추출물에서는 각 각 70.7과 83.8%의 억제효과를 나타내어 입자크기가 작아 질수록 추출수율이 높아진다는 앞에서의 결과에 따라 분쇄 방법에 따른 추출수율의 증가에 기인하여 전자공여능 억제 효과가 높아진 것으로 판단하였다. Cho 등(28)이 진달래 추출물의 항산화 측정 결과, 열수 추출물과 ethanol 추출물 에서 각각 83.2, 89.7%의 전자공여능 억제효과를 나타낸다 고 보고한 것과 비교하면 삼백초의 초미세분쇄 추출물과 유사한 효과를 나타냄을 알 수 있었다. 추출물들의 hydrogen-donating antioxidant와 chain breacking antioxidant 모두를 측정할 수 있으며, 표준물질의 사용으로 추출물의 상대 비교가 가능하도록 ABTS⁺ free radical이 추출물속의 항산화 물질에 의해 radical 특유의 청록색이 탈색되는 것을 이용하여 일반추출과 미세분쇄 및 초미세분쇄 후 추출물의 항산화효과를 측정하였다(16). 그 결과 Table 2에서와 같이 일반추출물과 미세분쇄 및 초미세분쇄 후 추출물 모두 97% 이상의 높은 항산화효과를 나타내어 분쇄 방법에 따른 차이 는 거의 없었다. 이러한 결과로 보아 삼백초 물과 ethanol 추출물은 친수성 및 lipophilic 물질에 대한 항산화력이 우수 한 것을 알 수 있었다. 지용성 물질에 대한 antioxidant protection factor 측정을 위하여 일반추출과 미세분쇄 및 초미세분쇄 후 추출 등 추출방법에 따른 antioxidant protection factor를 측정한 결과 Table 2에서와 같이 일반분 쇄한 시료 추출물 보다 미세분쇄와 초미세분쇄 추출물에서 더 높은 PF값을 확인하였으며 50% ethanol 초미세분쇄 추 출물에서 1.8 PF로 높은 항산화력을 나타내어, 삼백초 추출 물의 지용성물질에 대한 항산화력도 비교적 우수하다고 판단되었다. 지질과산화물인 malondialdehyde의 함량은 Burge와 Aust의 방법(18)을 이용하여 측정하였다. 일반추 출과 미세분쇄 및 초미세분쇄 후 추출 등 추출방법을 달리 하여 제조한 추출물의 thiobarbituric acid reactive substance 를 측정한 결과 Table 2에서와 같이 일반분쇄한 시료 추출 물에서 74.5%(water extracts)와 79.2%(ethanol extracts)의 TBARS 억제효과가 관찰되었고, 미세분쇄와 초미세분쇄 추출물에서는 각각 81.2%, 88.7%와 86.7%, 91.3%의 억제효 과를 나타내어 입자크기가 작아질수록 추출수율이 높아지 며, 물추출물보다 ethanol 추출물의 효과가 더 우수한 것으 로 확인되었다.

Xanthine oxidase는 purine 대사에 관여하는 효소로서 xanthine 또는 hypoxanthine으로부터 urate를 형성하여 urate 가 관절에 축적되어 심한 통증을 동반하는 관절염인 통풍을 유발하는 효소이다(29). Xanthin oxidase는 분자상의 산소 를 수소 수용체로 이용하여 xanthine을 uric acid형으로 산화 하는 반응을 촉매하는 작용을 하므로 xanthin oxidase의 저 해 효과는 유리 라디칼의 생성 억제와 더불어 생물학적으로 중요한 의의를 가진다고 할 수 있다. 일반추출과 미세분쇄 및 초미세분쇄 후 추출 등 추출방법을 달리하여 추출한 삼백초잎 추출물들에 대하여 xanthin oxidase 저해 활성을 측정한 결과 Table 3에서와 같이 물 추출물의 경우 삼백초 는 7% 정도로 미세분쇄하지 않은 시료와 크게 차이나지 않았다. Ethanol 추출물의 경우 분쇄하기 전에 30.7%의 억 제율을 나타내는 것에 비하여 초미세분쇄 후 42.6%의 효소 억제 효과를 나타내어 초미세분쇄에 의한 활성 증대효과를 기대할 수 있었다. 이는 입자크기가 작아질수록 추출수율 이 높아진다는 앞에서의 결과에 따라 분쇄방법에 따른 추출 수율의 증가에 기인하여 xanthin oxidase의 억제역할을 수 행하는 물질의 용출이 높아진 때문인 것으로 판단하였다.

고혈압은 뇌혈관 질환, 심혈관 질환 등을 일으키는 대표 적인 원인으로 식생활의 서구화됨에 따라 급속도로 증가하 였다. 고혈압은 우리나라에서 암 다음으로 많이 발생되는 대표적 성인 질환으로 그 원인은 renin-angiotensin계가 중요 한 역할을 하고 있는 것으로 여겨지고 있으며, 여기에는 angiotensin converting enzyme(ACE)이라는 효소가 관여하 고 있는 것으로 알려져 있다. 생체 중에 존재하는 불활성형 의 angiotensin I 은 ACE에 의해 dipeptide가 떨어져 나감으 로써 혈관벽 수축작용이 있는 angiotensin II로 전환된다. 이 물질은 강력한 혈관수축작용을 가지고 aldosterone의 분 비를 촉진함으로써 물과 sodium의 배설을 억제하며, 또한 혈관이완작용을 갖는 bradykinin을 불활성화 시켜 혈압을 상승시키는 역할을 한다(30). 식물이 2차대사산물로 생산 하는 phenolic compound들은 종류에 따라서 이 효소의 작용 을 저해함으로써 고혈압의 치료가 가능하다고 알려져 있다 (31,32). 본 연구에서는 삼백초 잎 추출물의 일반추출과 미 세분쇄 및 초미세분쇄 후 추출 등 추출방법을 달리하여 ACE 저해활성을 측정하였다. 그 결과 Table 4에서와 같이 일반추출의 경우 물추출물에서는 활성이 나타나지 않았고 50% ethanol 추출물에서 24%의 억제율이 확인되었고, ethanol 추출물의 억제효과가 물추출물에 비해 상대적으로 우수한 억제 효과를 나타내었다. 또한 미세 분쇄보다 초미 세 분쇄 추출물이 우수한 고혈압 억제효과를 나타내어 초미 세 분쇄를 통한 ethanol 추출이 생리활성의 활용 측면에서 매우 유리할 것이라 판단되었다. 일반적으로 phenol 유래 화합물의 페놀성 수산기에 의해 단백질과 복합체의 침전물 을 형성하여 비경쟁적으로 효소를 저해함으로서 효소 불활 성화를 일으키는 것으로 보고되었다(31). 이러한 phenol성 화합물들은 ACE 저해작용에 의해 고 renin증 환자에서 뿐 만 아니라 정상인에서도 현저한 혈압강하 작용을 가지며, 고혈압 치료제로서 응용이 가능하다고 보고되었다(31-33).

삼백초 잎의 일반추출과 미세분쇄 및 초미세분쇄 후 추 출 등 추출방법을 달리하여 추출물의 항균활성을 측정하기 위하여 식중독균인S. aureus, E. coli와 충치균인St. mutnas, 위염균인 H. pylori를 사용하여, agar plate상에서 37℃의 incubator로 24∼48시간 동안 배양한 결과 일반추출과 미세 분쇄 추출물에서는 항균활성이 전혀 검출되지 않았고, 초 미세분쇄 추출물에서는 Table 5에서와 같이 50% ethanol 추출물에서S. aureus, E. coli에 대해서 아주 약한 항균효과 를 나타내었을 뿐 항균효과는 거의 관찰되지 않았다.