천마 및 표고버섯 첨가 전통간장의 숙성기간별 품질특성 및 항산화 활성

본 실험에서 간장은 장흥할매 조선간장(Free world village, Jangheung, Korea, 2011)을 사용하였고, 표고버섯은 경남 합천군에서 재배된 건조 표고절편(지름 3~5 cm)을 사용하였으며 천마는 경동시장(Hanbangchoen, Seoul, Korea) 에서 구입한 천마를 100 mesh 입도로 분쇄하여 사용하였다.

간장, 표고절편 및 천마를 auto clave(VS-1321, Vision Sci, Seoul, Korea)로 멸균하고 방냉한 후 시료를 제조하였으며, 간장 500 mL, 표고절편 15 g 및 간장 500 mL, 표고절편 15 g, 천마 30 g를 혼합 비교구로 하였고, 5, 10, 15, 20, 25, 30일 간격으로 채취하여 3,000 rpm에서 30분 원심분리 (Supra 25K, Hanil Science Industrial, Gangneong, Korea) 한 후 상등액을 취하여 4℃에 보관하며 기간별 품질 특성을 알아보았다.

식염은 Mohr(16)법에 따라 간장 5 mL를 250 mL로 희석 하고 이 중 10 mL를 삼각플라스크에 취하여 5% K2CrO4 1 mL를 넣고 0.1 N AgNO₃을 가하여 적갈색이 15초간 사라 지지 않을 때까지 소요된 질산은 용액의 양으로 산출하였다.

간장의 pH는 pH meter(HM-30P, DKK-TOA, Tokyo, Japan)로 3회 측정하였다. 총산도는 간장 5 mL에 증류수 50 mL를 가하여 희석한 후 교반하며 자동적정기(TitroLine Easy, SCHOTT, Tokyo, Japan)로 0.1 N NaOH를 가하여 pH 8.3이 될 때까지의 소요된 양을 산출하여 acetic acid의 양으로서 총산량을 측정하였다.

간장의 총당은 phenol-H₂SO₄법(17)에 따라 간장 0.1 mL 를 증류수로 100 mL가 되도록 정용한 후 여과한 시료액 1 mL에 5% 페놀 용액 1 mL 및 진한 황산 5 mL를 가하고 30분간 실온 정치시킨 후 470 nm에서 흡광도를 측정하였으 며, maltose(Sigma, St Louis, MO, USA)를 이용하여 표준검 량곡선을 작성하고 총당 함량을 계산하였다.

환원당은 dinitrosalicylic acid(DNS)법(18)으로 측정 하였 다. 증류수로 50배 희석한 시료 1 mL에 DNS 시약 3 mL를 가한 후 100℃ 수조에서 5분간 중탕 가열하고 얼음 수조에 서 냉각한다. 발색된 반응액에 증류수 25 mL를 첨가한 후 550 nm에서 흡광도를 측정하여 glucose(Sigma, St Louis, MO, USA)를 이용하여 0.2~2 mg/mL의 농도범위에서 작성 한 표준검량곡선에 따라 환원당 함량을 정량하였다.

총 폴리페놀 함량 측정을 위해 Folin-Ciocalteu's법(19)을 변형하여 측정하였다. 시료액 1 mL에 1 N 폴린-시오칼토 페놀 시약(Folin-Ciocalteu's Phenol reagent) 2 mL를 넣고 혼합하여 실온에서 5분간 반응시키고, 반응 용액에 35% Na₂CO₃ 2 mL를 넣고 실온에서 30분간 정치한 후 750 nm에 서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도는 갈산(gallic acid) 을 이용하여 작성된 표준곡선을 이용하여 검량선을 작성하 여 총 페놀 함량을 계산하였다.

총 플라보노이드 함량은 Davis 변법(20)을 이용하였다. 페놀 화합물 시료액 제조와 동일하게 시료액을 제조하였으 며 추출물 1 mL에 diethylene glycol 10 mL 및 1 N NaOH 1 mL를 가하고 잘 혼합한 후 30℃에서 1시간 반응시킨 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다.

시료의 전자공여능은 1.1-diphenyl-2-pycrylhydrazyl(DPPH, Sigma)을 이용한 방법(21)으로 측정하였다. 시료액 1 mL에 0.2 mM DPPH 용액 1 mL를 잘 혼합하여 25분간 실온에 방치하고 multiplate spectrophotometer(EL×800TM. BioTek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 515 nm에서 흡광도를 측 정하고 아래와 같이 계산하여 나타내었다.

전자공여능(%)=(1-시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡 광도)×100

Protease 활성은 Anson의 방법(22)을 변형하여 측정하였 다. 조효소액 1 mL에 기질로 0.6% hammarsten casein 1 mL를 첨가하여 30℃에서 10분간 반응시킨 후 10% trichloroacetic acid(TCA) 2.5 mL를 첨가하여 반응을 정지시 켰다. 30분간 반응액을 정치하여 단백질을 침전시킨 후 상 징액을 2 mL를 취해서 0.55 M Na₂CO₃ 5 mL를 첨가하고, 2/3 N Folin reagent 1 mL를 첨가하여 30℃에서 30분간 반응 시켰다. 660 m에서 흡광도를 측정하였으며, 1 unit은 1분 동안 위의 조건에서 1 μmole의 tyrosine을 생성하는 효소의 양으로 하였다.

본 실험은 독립적으로 3회 이상 반복 실험을 실시하였다. SPSS(17.0, SPSS Inc, Chicago, IL, USA)을 이용하여 분산분 석 하였으며, 결과는 평균±표준편차로 나타내었다.

천마 및 버섯 첨가 간장의 식염 측정 결과는 Fig. 1과 같다. 기간에 따라 간장 식염 함량의 차이가 증가하는 것을 볼 수 있었다. 전통 간장 16.38~16.47%, 버섯 간장은 16.73~18.02%, 천마 첨가 간장은 15.99~17.55%, 표고버섯 및 천마 첨가군 간장은 16.03~16.91%로 숙성 될수록 증가 하는 경향을 보였다. 이는 숙성 기간이 증가할수록 간장 내 수분의 증발이 일어나 식염도가 증가한다고 보고된 결과 와 일치하였다(9,23). Chang(24)은 재래식 간장의 염도는 26.6~28.%로 본 연구에 비해 상당히 높은 것을 알 수 있다. 하지만, 18점의 재래식 간장에서 염도가 19.8~30.8%의 범 위였다고 하였는데(25), 본 실험 결과와 유사한 범위를 보였 다. 이는 간장을 만들 때 넣는 소금의 농도에 따라 염도의 차이가 생기는 것으로 사료된다.

Fig. 1. Changes in the pure salinity contents of the soy sauce containing Gastrodia elata Blume and oak mushroom (Lentinus edodes) dur ing fermentation for 30 days. Each value represents mean±SD, n=3. TK : Traditional Kanjang MK : Mushroom Kanjang GK : Gastrodia elata Blume Kanjang GMK : Gastrodia elata Blume Mushroom Kanjang

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간장 시료의 기간에 따른 pH변화는 Fig. 2과 같다. pH는 전통간장 5.78~5.91, 버섯 간장 4.6~5.16, 천마 첨가 간장은 4.32~5.24, 표고버섯 및 천마 첨가군 간장은 4.69~5.18로 전통간장을 제외하고 숙성기간이 증가함에 따라 낮아지는 경향을 보였으며 천마 첨가 간장이 가장이 큰 변화 양상을 나타내었다. 재래식 조선간장의 pH는 5.11~6.98(25), 또는 pH 5.52~6.26(26)인 것으로 보고되어 있는데 본 실험의 간 장은 더 산성화 된 것을 알 수 있다. 이는 천마나 표고버섯에 함유된 당이 발효됨으로서 생성된 유기산의 증가에 따른 것으로 추정된다(27). 또한, 본 연구 결과와 유사하게 전통 간장과 마늘을 첨가한 간장에서도 숙성기간에 따라 pH가 감소하는 양상을 보였다(28). 총산도는 숙성기간에 따라 증가하였으며, 이것은 숙성기간이 길어짐에 따라 간장의 총산도가 증가하였다는 보고와 일치하였다. (29,30).Fig. 3

Fig. 1. Changes in the pH contents of the soy sauce containing Gastrodia elata Blume and oak mushroom (Lentinus edodes) during fermentation for 30 days. Each value represents mean±SD, n=3. TK : Traditional Kanjang MK : Mushroom Kanjang GK : Gastrodia elata Blume Kanjang GMK : Gastrodia elata Blume Mushroom Kanjang

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Fig. 3. Changes in the acidity contents of the soy sauce containing Gastrodia elata Blume and oak mushroom (Lentinus edodes) during fermentation for 30 days. Each value represents mean±SD, n=3. TK : Traditional Kanjang MK : Mushroom Kanjang GK : Gastrodia elata Blume Kanjang GMK : Gastrodia elata Blume Mushroom Kanjang

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천마 및 버섯 첨가 간장의 총당의 함량 분석 결과는 Fig. 4와 같다. 기간에 따른 총당의 변화에서는 전통간장에 비해 모두 높았으며 천마간장은 15일까지 가장 높은 값을 나타 냈지만 그 이후를 기점으로 급격히 감소하는 경향을 보였 다. Shin 등(27)은 전통간장에서 102.28 mg/mL을 보였는데 본 실험에선 46.08~47.25 mg/mL로 절반의 값을 보였다. 그러나 천마버섯간장에서는 74,32~93.20 mg/mL로 전통간 장에 비해 1.5배정도 증가한 값을 보였고 천마간장에 비해 서도 높았으며 기간이 지날수록 큰 차이를 보이지 않다가 25일을 기점으로 상승하는 모습을 보였다. 이는 천마에서 maltose, fructose, glucose, sucrose 등의 유리당이 검출되었 다는 Choi 등(31)의 보고와 표고버섯 분말을 첨가한 된장의 유리당의 함량이 높은 것으로 나타났다는 Choi 등(15)의 보고를 종합하여 보았을 때 천마와 표고버섯으로부터 유래 된 당의 영향이 있는 것으로 판단된다.

Fig. 4. Changes in the total sugar contents of the soy sauce containing Gastrodia elata Blume and oak mushroom (Lentinus edodes) dur ing fermentation for 30 days. Each value represents mean±SD, n=3. TK : Traditional Kanjang MK : Mushroom Kanjang GK : Gastrodia elata Blume Kanjang GMK : Gastrodia elata Blume Mushroom Kanjang

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환원당은 염기성 용액에서 알데하이드 또는 케톤을 형성 하는 당의 일종으로 과당, 포도당, 엿당 글리세르알데하이 드 등이 있으며, 간장의 숙성 중에 유입된 미생물에 의해 생성된 amylase가 메주 중의 전분질을 분해하며 생성된다 (32). 환원당의 함량 분석 결과는 Fig. 5와 같은데 천마 첨가 간장의 환원당이 전통간장에 비해 높은 값을 보였지만 25 일 이후로 감소하는 것을 볼 수 있다. 환원당의 감소는 숙성 기간 동안 일어나는 젖산 발효 또는 알코올 발효에 환원당 이 기질로 이용되기 때문이라고 알려져 있어(32) 천마 첨가 로 인해 간장의 발효에 영향을 준 것으로 판단된다.

Fig. 5. Changes in the reducing sugar contents of the soy sauce containing Gastrodia elata Blume and oak mushroom (Lentinus edodes) dur ing fermentation for 30 days. Each value represents mean±SD, n=3. TK : Traditional Kanjang MK : Mushroom Kanjang GK : Gastrodia elata Blume Kanjang GMK : Gastrodia elata Blume Mushroom Kanjang

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Son 등(23)에 따르면 개량메주로 만든 간장에서 환원당 함량은 2.8~3.7%로 본 실험에서 2.5~2.8%의 control과 유사 한 값을 보였다. 천마 간장에 비해 천마 버섯 간장이 높은 것은 천마와 버섯에서 나온 maltose, fructose, glucose, sucrose 등의 함량에 의해 총당과 비슷한 경향으로 상승한 것으로 사료된다.

단백질 분해 효소인 protease 활성의 결과는 Fig. 6과 같 다. Protease은 메주중의 고분자 펩타이드(peptide)를 저분 자 펩타이드로 분해하여 유리아미노산을 용출하며, 숙성도 를 판단하는 중요 성분이자 영양학적 가치를 부여하는 역할 을 한다(28). Control인 전통간장을 제외한 모든 간장에서 기간이 지날수록 상승을 하였으며 15일을 기점으로 급격히 증가하는 것을 알 수 있었는데 그 중 천마간장이 13.08 unit 로 가장 높은 것을 볼 수 있다.

Fig. 6. Changes in the protease activity contents of the soy sauce containing Gastrodia elata Blume and oak mushroom (Lentinus edodes) dur ing fermentation for 30 days. Each value represents mean±SD, n=3. TK : Traditional Kanjang MK : Mushroom Kanjang GK : Gastrodia elata Blume Kanjang GMK : Gastrodia elata Blume Mushroom Kanjang

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대조구는 1.60 U/mL로 Kim (33)의 control의 0.87 U/mL 비해 2배 이상 높게 나왔으며 천마간장 및 천마 버섯간장의 경우 6~8배 이상 높은 값을 보인 것을 볼 수 있다. 천마와 버섯을 첨가한 간장의 protease 활성이 높게 나타난 것으로 보아, 천마 및 버섯이 간장 내 미생물 활성에 영향을 주어 protease 활성이 증가한 것으로 생각되며, 숙성과 조미료적 인 성질을 부여함과 동시에 유리 아미노산 함량에도 많은 영향을 준 것으로 판단된다.

천마 및 버섯 첨가 간장의 총 페놀 함량 변화는 Fig. 7과 같다. 천마간장의 총 페놀 함량은 15~20일 사이에서 급격히 증가하여 90.23 mg/mL로 높은 값을 보였으나 25일 이후로 점차 감소하는 것을 볼 수 있었다. 천마 버섯 간장은 초기에 46.93 mg/mL로 가장 높았으나 숙성이 될 수록 점차 감소하 다 증가하는 경향을 보였다. Park 등(34)의 보고에 따르면 비 발효천마와 발효천마의 총 페놀 함량은 각각 108.65 mg/mL, 389.99 mg/mL로 나타났으며 본 연구에서는 91.14 mg/mL로 상대적으로 낮은 값을 보였다. 천마를 첨가한 간 장이 control이나 버섯 간장에 비해 총 페놀 함량이 높은 것은 천마의 페놀성 물질인 p-hydroxybenzyl alcohol, p-hydroxybenzaldehyde, vanillyl alcohol, vanillin 등의 증가 로 인해 폴리페놀 함량도 높아 진 것으로 판단된다(34).

Fig. 7. Changes in the total polyphenol contents of the soy sauce containing Gastrodia elata Blume and oak mushroom (Lentinus edodes) dur ing fermentation for 30 days. Each value represents mean±SD, n=3. TK : Traditional Kanjang MK : Mushroom Kanjang GK : Gastrodia elata Blume Kanjang GMK : Gastrodia elata Blume Mushroom Kanjang

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천마 및 버섯 첨가 간장의 총 플라보노이드 함량 변화는 Fig. 8에 나타냈다. 총 플라보노이드 함량 변화는 총 폴리페 놀 측정과 비슷한 경향을 보였는데 대조구에 비해 실험구가 모두 높게 나왔다. 그중 천마 간장이 15일 이후로 점차 증가 하여 25일 째 404.44 mg/mL의 높은 함량을 보였으며 그 이후로 감소함을 알 수 있었다.

Fig. 8. Changes in the total flavonoid contents of the soy sauce containing Gastrodia elata Blume and oak mushroom (Lentinus edodes) dur ing fermentation for 30 days. Each value represents mean±SD, n=3. TK : Traditional Kanjang MK : Mushroom Kanjang GK : Gastrodia elata Blume Kanjang GMK : Gastrodia elata Blume Mushroom Kanjang

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천마 및 버섯 첨가 간장의 전자공여능은 Fig. 9와 같다. DPPH 활성에서 재래식 간장을 제외한 모든 실험구에서 숙성이 될 수록 활성이 높아졌으며 천마간장 58.4%, 천마 버섯간장이 72.71%, 버섯간장이 76.46%의 가장 높은 활성 을 보였다. Heo 등(35)의 보고에 따르면 생천마 추출액의 DPPH 활성은 약 40%를 나타냈으며 천마를 첨가한 실험군 이 대조군에 비해 높은 활성을 보여 주었다고 하였다. 또한 Liu와 Mori(36)는 천마가 in vitro와 in vivo에서 항산화제로 탁월한 효과를 나타낸다 하였으며 이는 천마에 함유된 gastrodin, gastrol, gastrodigenin 등과 같은 폴리페놀류 (37~39)에 의한 것으로 생각된다. 표고버섯을 첨가한 간장 의 DPPH는 70~80%로 위 실험 결과와 유사한 값을 보였으 며 숙성기간이 경과할수록 증가하다가 20일을 기점으로 감소하는 경향을 보이는 것을 볼 수 있는데 이는 항산화 물질이 숙성초기에 양조간장 속에 많이 존재함을 알 수 있다.(28)

Fig. 9. Changes in the DPPH contents of the soy sauce containing Gastrodia elata Blume and oak mushroom (Lentinus edodes) during fermentation for 30 days. Each value represents mean±SD, n=3. TK : Traditional Kanjang MK : Mushroom Kanjang GK : Gastrodia elata Blume Kanjang GMK : Gastrodia elata Blume Mushroom Kanjang

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