서 론
우리나라의 전통주는 일제 강점기부터 약 100년 동안 자유롭게 제조할 수 없어서 산업화와 전통주 관련 연구가 매우 부족한 실정이다. 그러나, 최근 한국 문화의 세계화 추세와 한류의 영향으로 국내외적으로 전통 민속주에 대한 관심이 높아지고 있으며, 전통주를 복원하려는 노력이 시 도되고 있다(1).
기존의 전통 발효주는 구전되거나 가정용으로만 주조되 어 표준화된 제조방법이 없고, 전통 발효주의 맛과 풍미를 결정하는 맛, 향, 색 및 영양 발현에 대한 개별적인 고려가 없어 단일한 맛과 저장 기간을 보장하는 전통주의 제조가 어려운 실정이다.
현재 우리 술을 세계 주류 시장에서 경쟁력을 갖춘 전통 술로서 상품성을 높이기 위해서는 전통누룩 및 물료의 특이 성에 적합한 누룩의 고품질 대량생산 기술개발 연구가 이루 어져야 하며, 이와 같은 문제점을 해결하기 위해서는 누룩 의 미생물학적 측면과 효소학적 측면에서 보다 체계적인 연구 개발 필요성이 제시된바 있다(2).
전통주 제조에는 다양한 미생물이 관여하며 이러한 미생 물의 종류 및 활성 등에 따라 술의 품질이 결정되고, 그 중에서 다양한 종류의 사상균이 쌀의 전분질을 당분으로 전환시키는 역할을 한다(3-5).
1945년 이전의 누룩 사상균에 대한 연구에서 연구 빈도 가 높은 사상균은 Absidia sp., Aspergillus oryzae, Rhizopus sp., Endomyces sp., Aspergillus glaucus, Monascus purpures, Pencillum glaucum 등이 있고, 1945년 이후에는 한국 전통 누룩으로부터 Absidia, Rhizopus, Circinella, Actinomucor, Aspergillus, Cladosorium 및 Botryotrichum속의 7속 17종의 사상균이 분리 동정되었다(6-9).
전분의 구조는 α-D-glucose가 α-1,4 glucoside 결합만으로 선형 구조인 amylase와 α-1,4 및 α-1,6 glucoside 결합의 가지 구조로 이루어진 amylopectin이 있는데, 조밀하게 배열된 결정부분은 α-amylase 효소의 작용을 받기 어려우나 비결 정부분은 효소의 작용이 비교적 용이하며, 발효과정 동안 효소의 작용으로 가수분해되어 glucose나 maltose 등의 단 순 당으로 분해된다(10-12).
전분은 그 종류에 따라 입자구조, 내부 형태 및 표면의 특징이 다르고, X-선 회절도에 의해 곡류 전분은 A형, 괴경 과 열매 전분은 B형 그리고 근경과 두류 전분은 C형으로 그 결정구조가 구분이 되는데 B형 전분은 효소의 작용을 쉽게 받지만 A형과 C형은 효소에 대한 저항성이 큰 것으로 알려져 있다(13-15). 따라서 양조에 많이 사용되는 곡류의 A형 전분 이용률을 높이고, 양조 관련 미생물과의 관련성을 검증하기 위한 균주 선택 및 발효조건에 대한 연구가 필요 하다.
양조를 위한 누룩 제조시 사용되는 균주들은 각각의 특 성이 있는데, Rhizopus 속은 누룩으로부터 쉽게 분리되며 소맥분의 증자여부에 관계없이 생육 및 효소생성도 높으 며, Aspergillus는 증자한 쌀에서 생육력이 높으며 강력한 당화효소를 생성하는 것으로 알려져 있다(16). 이처럼 전분 의 효소적 가수분해는 전분의 종류와 사용되는 균주의 특성 에 크게 영향을 받는다.
따라서 전분의 특이적 기질에 맞는 효소를 생산할 수 있는 균주를 선택하여 맞춤형 균주를 연구하는 것은 매우 중요한 일이라 하겠다. 이에 본 연구에서는 쌀 전분의 사상 균별 누룩에 따른 발효적성 확인을 위해 7종의 곰팡이로 누룩을 제조하고 당화력, 액화력, 단백질 분해력 비교하였 고, 누룩별 약주의 품질특성을 측정하여 쌀 전분의 맞춤형 사상균을 검토하고 쌀을 주원료로 이용하는 우리나라 전통 약주의 품질개선을 목적으로 하였다.
재료 및 방법
본 실험에 사용한 양조용 원료 쌀은 2013년 전남 농업기 술원에서 재배한 한아름 품종을 사용하였고, 양조용수는 정수기(CHP-8800, Coway Co., Ltd, Korea)의 냉수를 100℃ 로 가열한 후 22～25℃로 냉각하여 사용하였다. 누룩 제조 용 통밀은 2012년 수확한 보성 농업협동조합제품을 분쇄하 여 사용하였고, 곰팡이는A. kawachii KCCM 32819, A. niger KCCM 32005, Rhizopus japonicus KCCM 11604, R. oryzae KCCM 11272, R. oryzae KCCM 11273, R. oryzae KCCM 11276, Mucor rouxii KCCM 60148 총 7종을 한국미생물보 존센터에서 분양 받아 사용하였으며, 시판누룩은 송학곡자 (Major genus : Aspergillus)제품을 사용하였다. 효모는 송천 효모(배양효모, 100g당 효모수 400억 이상, Saccharomyces cerevisiae)제품을 구입하여 사용하였다.
곰팡이 균주를 달리한 seed koji 제조는 각 곰팡이를 멸균 생리식염수 10 mL가 들어있는 시험관에 첨가하여 150 rpm 으로 10분간 진탕시킨 후 이를 PDA배지에 도말하여 28℃ 에서 3일간 배양시켰다. 통밀은 거칠게 분쇄하여 110℃에 서 15분간 고압증기로 살균한 다음, 정제수 30%를 첨가하 고 잘 혼합한 후 배양시킨 각 곰팡이에 접종하고 28℃에서 3일간 배양시켜 seed koji 를 제조하였다. 제조된 seed koji 는 Fig. 1과 같다.
누룩의 제조는 So(17)의 방법을 참고하여 Fig. 2와 같이 제조하였다. 즉, 분쇄한 통밀에 110℃에서 15분간 고압증기 로 살균하고, 정제수 30%를 가하여 seed koji로 제조된 A. kawachii KCCM 32819, A. niger KCCM 32005, R. japonicus KCCM 11604, Rhizopus oryzae KCCM 11272, R. oryzae KCCM 11273, Rhizopus oryzae KCCM 11276, M. rouxii KCCM 60148를 각각 단독 접종하여 성형 없이 30℃에서 24시간 1차 배양하였다. 성형한 후 30℃, 습도 85%에서 48시간 2차 배양한 다음 30℃에서 수분함량이 10%내외가 되게 건조시켰다.
누룩별 주모 제조는 쌀 500 g을 수세하여 5시간 물에 침지하고, 1시간 물 빼기를 한 후 분쇄하여 물 750 mL를 첨가하여 죽으로 제조한 후 상온까지 방냉하였다. 균주별 로 각각 제조한 누룩 100 g에 주모 총량에 대한 젖산 0.5%, 전 배양한 효모액 S. cerevisiae 50 mL를 첨가하여 주모를 제조하여 23℃에서 3일간 발효시켰다.
1단 담금은 쌀 2 kg을 수세하여 5시간 동안 물에 수침하 고, 1시간 동안 체에서 물기를 제거하고 1시간 동안 증자한 후 30℃로 냉각하였다. 2 kg씩 증자한 쌀에 각각의 균주별 누룩 400 g, 물 3 L와 함게 제조한 주모를 혼합하여 24±1℃ 에서 3일간 발효시켰다. 2단 담금은 쌀 10 kg을 1단 담금과 동일한 방법으로 제조한 후 물 15 L와 함께 1단 담금한 술과 혼합하여 24±1℃에서 8일간 발효시켰다
누룩의 전분 당화력 측정은 국세청기술연구소 주류분석 규정(18)에 따라 각 누룩에 1% NaCl 용액을 가하여 30℃에 서 3시간 침출시킨 액 또는 희석액을 시험용액으로 하고, 2% 전분액을 기질로 하였다. 기질용액 50 mL와 초산염완 충액 30 mL를 55℃ 수욕조에서 10분간 방치하였다. 시험용 액 10 mL를 가해주고 1시간 후 0.5 N NaOH를 가하여 효소 작용을 중지시킨 다음 상온으로 방냉하고 물로 100 mL로 정용하였고, 100 mL로 정용한 액의 10 mL와 시험용액 대신 물을 취하여 동일하게 처리한 대조액 10 mL를 각각 취하여 환원당을 측정하였다. 환원당 측정은 Fehling용액 10 mL, 물 40 mL, 포도당 표준용액 10 mL를 가해주고 끓여주면서 포도당표준용액으로 적정하였다. 황산동의 청색이 거의 없 어지면 메틸렌블루시액 4∼5방울을 더 가하여 적정을 계속 하였고, 종말점은 메틸렌블루의 청색이 없어지는 점으로 이 때 소비된 포도당표준용액의 소비 mL수를 S라 하였다. 따로 Fehling용액 10 mL, 물 40 mL, 대조액 10 mL 및 포도당 표준용액 10 mL를 사용하여 같은 방법으로 공시험을 행하 고 이때 소비된 포도당표준용액의 소비mL수를B로하였다.
2 : Factor(20/10)로서 포도당표준용액(2 mg/1 mL)과 사용된 표준용액 10 mL의 양에서 산출된 수치임
W : 시험용액 10 mL에 함유된 검체의 양(g)
1 : 반응시간(시간).
누룩의 액화력 측정은 국세청기술연구소 주류분석규정 (18)에 따라 각 누룩에 0.5% NaCl용액을 가하여 실온(20℃ 이하)에서 3시간 침출시켜 여과 후 효소용액으로 하고 pH 5.0으로 보완한 1% 녹말용액을 기질용액으로 하였다. 녹말 용액 10 mL를 40℃에서 예열한 후 효소용액 0.5 mL를 작용 시켜 작용혼합용액 중에서 0.5～1분마다 0.1 mL씩 요오드 용액 10 mL에 가하고 녹말요오드 반응색조를 분광광도계 (HP 8453, Hewlett Packard, Germany. wavelength 670 nm)로 비색하여 투과율(T)이 66%가 되는 반응시간을 구하고 비교 용액은 물 10 mL에 효소액 0.5 mL를 가한 후 0.1 mL를 요오드용액에 가한 것을 투과율(T) 100%로 하였다. 종점 전후의 반응시간을 비례 계산하여 T(66%)가 될 때까지의 시간을 측정하였으며, 액화력은 다음 식에 의해 계산하였다.
누룩의 단백질 분해력은 Anson(19) 개량법에 따라 pH 5.0로 조정한 0.6% casein용액을 기질로, 누룩침출액을 효 소액으로 하여 40℃에서 10분간 반응 시켰다. 이 때 생산되 는 Folin 발색성 비단백성 물질의 양을 Folin 비색법(20)으 로 측정하여 누룩 1 g이 1분 동안 생성되는 tyrosine을 mg으 로 나타내었다.
곰팡이 균주에 따른 누룩으로 담금한 약주의 pH는 술덧 여액 20 mL를 취하여 pH meter(Orion 940. U.S.A)로 측정하 였고, 총산 함량은 Huh 등(21)의 방법에 따라 시료를 원심분 리하여 상등액 10 mL를 취해 0.1N NaOH 용액으로 적정한 후 0.009를 곱하여 lactic acid로 환산하였다.
곰팡이 균주에 따른 누룩으로 담금한 약주의 ethanol 분 석은 술덧을 여과하여 여액 1 μL를 GC에 주입하였으며 외부 표준법으로 계산하였다. GC분석조건은 Carbopack B/ 5% Carbowax 20 M 3 M(L)×4 mm(ø)을 사용하여 오븐온도 는 60℃에서 150℃까지 5℃/min속도로 상승 시켰고 주입기 와 검출기의 온도는 각각 220℃와 250℃, carrier gas는 N2를 사용하였다.
결과 및 고찰
곰팡이 균주를 달리한 누룩의 당화력 측정 결과는 Fig. 3과 같다. 균주별 당화력은Rhizopus oryzae KCCM 11272으 로 제조한 누룩에서 3,647.72 SP/g으로 가장 높았고, 그 다음 으로 Rhizopus japonicus KCCM 11604로 제조한 누룩은 3,551.9 SP/g, R. oryzae KCCM 11273으로 제조한 누룩은 3,287.86 SP/g, R. oryzae KCCM 11276으로 제조한 누룩이 2,832.78 SP/g의 순으로 높은 당화력을 보였다. 시판 누룩과 본 연구에서 제조한 누룩의 당화력은 본 연구에서 제조한 누룩 중 A. kawachii KCCM 32819, A. niger KCCM 32005 및 M. rouxii 60148 로 제조한 누룩이 약간 낮았고, 그 외 누룩은 시판 누룩의 당화력 보다 높았다. 시판 누룩과 유의 적 차이를 볼 때 본 연구에서 사용된 7종의 곰팡이 중 R. oryzae KCCM 11272와R. japonicus KCCM 11604로 제조한 누룩 2종이 유의적 차이가 있었다. 속별 당화력은 Aspergillus 속 및Mucor 속보다Rhizopus 속이 높은 당화력 을 보였는데 이는 So(17)의 전통 누룩 미생물들로 제조한 개량누룩의 특성에서 Rhizopus속이 Aspergillus 속보다 당 화력이 높았다는 결과와 일치하였다.
균주별 누룩의 액화력을 측정한 결과는 Fig. 4와 같다. 전분의 액화제로 작용하는 α-amylase의 활성을 균주별로 보면 시판 누룩과 비교해R. japonicus KCCM 11604로 제조 한 누룩과M. rouxii KCCM 60148로 제조한 누룩이 유의적 차이를 보였다. 속별 액화력은Rhizopus속으로 제조한 누룩 이Aspergillus속으로 제조한 누룩 보다는 높은 활성을 보였 으나, Mucor속으로 제조한 누룩의 α-amylase활성은 R. japonicus로 제조한 누룩을 제외하고는 활성이 낮았다. Kim 등(3)은 균별 액화력 측정 결과 Aspergillus속과Mucor속의 활성이 높다고 보고하였는데 본 연구에서는 Rhizopus속과 Mucor속의 활성이 높았다. 이러한 결과는 누룩 제조시에 사용된 재료로 Kim 등(3)은 밀기울을 사용하였고, 본 연구 에서는 통밀을 그대로 분쇄하여 사용해 균주별 영양 요구성 에서 배양 재료들의 영양성분 차이로 인해 나타난 결과로 판단된다.
균주별 누룩의 단백질 분해력을 측정한 결과는 Fig. 5와 같다. 균주별 단백질 분해력은 시판누룩과 비교해 R. japonicus KCCM 11604로 제조한 누룩과 R. oryzae KCCM 11272 및R. oryzae KCCM 11273으로 제조한 누룩이 유의적 으로 높았다. A. niger KCCM 32005으로 제조한 누룩의 경우 당화력 및 액화력은 다른 균종에 비해 낮은 활성을 보였으나, 단백질 분해력은 A. kawachii KCCM 32819와 M. rouxii KCCM 60148로 제조한 누룩에 비해 유의적으로 높았다. 속별 단백질 분해력은 Rhizopus 속이 Aspergillus 속과 Mucor 속에 비해 유의적으로 높았다. So(17)의 전통 누룩 미생물들로 제조한 개량누룩의 특성에서 R. japonicus 로 제조한 누룩의 protease 활성이 높다고 보고된 바 있어 본 연구와 유사한 경향을 보였다.
누룩별 약주의 pH 및 총산 함량 측정 결과는 Table 1과 같다. pH는 시판누룩으로 담금한 약주가 4.14로 가장 높았 고R. japonicus KCCM 11604 균주로 제조한 누룩으로 담금 한 약주가 시판 누룩과 유의적 차이를 보이지 않았다. 그 외R. oryzae KCCM 11276 균주로 제조한 누룩으로 담금한 약주가 시판누룩 및R. japonicus KCCM 11604 균주로 제조 한 누룩으로 담금한 약주들과 유의적 차이가 적었다. 총산 함량은 R. oryzae KCCM 11273 균주로 제조한 누룩으로 담금한 약주가 가장 높은 함량을 보였고, 시판 누룩과 R. japonicus KCCM 11604 균주로 제조한 누룩으로 담금한 약주 2종이 유의적으로 가장 낮은 함량을 보였다. 이 2종의 약주의 경우 pH는 높고 총산 함량은 낮은 결과를 보여 다른 약주와 비교해 관능평가 기호도에서 차이가 예상된다.
A : Yakju made with commercialNuruk
B : Yakju made with Aspergillus kawachii KCCM 32819 Nuruk
C : Yakju made with Aspergillus niger KCCM 32005 Nuruk
D : Yakju made with Rhizopus japonicus KCCM 11604 Nuruk
E : Yakju made with Rhizopus oryzae KCCM 11272 Nuruk
F : Yakju made with Rhizopus oryzae KCCM 11273 Nuruk
G : Yakju made with Rhizopus oryzae KCCM 11276 Nuruk
H : Yakju made with Mucor rouxii KCCM 60148 Nuruk
곰팡이 균종을 달리한 누룩으로 약주 담금을 한 후 ethanol 함량을 측정한 결과는 Fig. 6과 같다. 발효가 끝나는 8일째 누룩별 약주의 ethanol 함량은R. oryzae KCCM 11272 누룩으로 제조한 약주가 15.28%로 가장 높았고, 다음으로 R. japonicus KCCM 11604 누룩으로 제조한 약주가 15.10% 이었으며, 이 두 시료구의 유의적인 차이는 없었다. A. niger KCCM 32005 누룩과M. rouxii KCCM 60148 누룩으로 제조 한 약주 경우 12.41%와 12.33%로 다른 시료구와 비교해 유의적으로 가장 낮았다. 균주 속별 ethanol 생성능은 Rhizopus 속의 균주가Aspergillus 속과 Mucor 속 보다 높았 다. Han(4)은 누룩 종류별 탁주의 ethanol 함량에서Rhizopus japonicus 누룩구가 가장 높았고, Aspergillus 속 누룩구와 Mucor 속 누룩구는 낮았다고 보고하여 본 연구와 일치하였 다. 이러한 결과를 효소 활성도와 비교할 때 활성도가 높았 던Rhizopus 속으로 담금한 약주가 ethanol 함량 또한 높게 나와 효소 활성도와 ethanol 함량의 연관관계를 확인 하 였다.
곰팡이 균종을 달리한 누룩으로 약주 담금을 한 후 관능 평가를 실시한 결과는 Table 2와 같다. 향은Rhizopus oryzae KCCM 11276 누룩으로 담금한 약주가 6.9로 가장 높은 기호도를 보였으나, A. kawachii KCCM 32819, R. japonicus KCCM 11604, R. oryzae KCCM 11272 및R. oryzae KCCM 11273로 담금한 약주들과 비교해 유의적인 차이는 없었다. 색은 시판 누룩으로 담금한 약주가 다른 시료구와 비교해 유의적으로 가장 높았고, 맛은 A. kawachii KCCM 32819 누룩으로 담금한 약주가 6.6가장 높았으나 R. japonicus KCCM 11604 누룩으로 담금한 약주와 유의적인 차이를 보이지 않았다. 종합 기호도는 R. japonicus KCCM 11604 누룩으로 담금한 약주가 5.7로 유의적으로 가장 높았다. A. niger KCCM 32005 누룩으로 담금한 약주의 경우 색, 향, 맛 및 종합기호도 모두 다른 누룩에 비해 낮은 기호도를 보였는데 이는 A. niger는 흑국균(22)으로서 약주 담금시 균의 색이 용출되어 기호도가 낮게 나타난 것으로 판단 된다.
A : Yakju made with commercialNuruk
B : Yakju made with Aspergillus kawachii KCCM 32819 Nuruk
C : Yakju made with Aspergillus niger KCCM 32005 Nuruk
D : Yakju made with Rhizopus japonicus KCCM 11604 Nuruk
E : Yakju made with Rhizopus oryzae KCCM 11272 Nuruk
F : Yakju made with Rhizopus oryzae KCCM 11273 Nuruk
G : Yakju made with Rhizopus oryzae KCCM 11276 Nuruk
H : Yakju made with Mucor rouxii KCCM 60148 Nuruk
요 약
쌀 전분의 사상균별 누룩에 따른 발효적성을 확인을 위 해 7종의 곰팡이로 누룩을 제조하여 당화력, 액화력, 단백 질 분해력을 비교하고, 누룩별 약주의 품질특성을 측정한 결과는 다음과 같다. 균주별 당화력은 R. oryzae KCCM 11272으로 제조한 누룩이 3,647.72 SP/g으로 가장 높았다. 시판 누룩과 본 연구에서 제조한 누룩의 당화력은 A. kawachii KCCM 32819와 A. niger KCCM 32005로 제조한 누룩 외 시판 누룩의 당화력 보다 높았다. α-amylase 활성은 R. japonicus KCCM 11604로 제조한 누룩이 가장 높았고, M. rouxii KCCM 60148로 제조한 누룩의 액화력 또한 높았 다. 단백질 분해력은 R. japonicus KCCM 11604로 제조한 누룩이 가장 높았다. 결과적으로 곰팡이 균주별 누룩의 당 화력, 액화력 및 단백질 분해력의 효소활성은Rhizopus 속 이Aspergillus 속 및 Mucor 속 보다 높았다. 누룩별 약주의 pH는 시판누룩으로 담금한 약주가 4.14로 가장 높았고 R. japonicus KCCM 11604 균주로 제조한 누룩으로 담금한 약주가 시판 누룩과 유의적 차이를 보이지 않았다. 총산 함량은 R. oryzae KCCM 11273 균주로 제조한 누룩으로 담금한 약주가 가장 높은 함량을 보였다. Ethanol 함량을 측정한 결과R. oryzae KCCM 11272 누룩으로 제조한 약주 가 15.28%로 가장 높았고, 다음으로 R. japonicus KCCM 11604 누룩으로 제조한 약주가 15.10%이었다. 균주 속별 ethanol 생성능은 Rhizopus 속의 균주가 Aspergillus 속과 Mucor 속 보다 높았다. 관능평가 종합 기호도는 R. japonicus KCCM 11604 누룩으로 담금한 약주가 5.7로 높은 기호도를 보였다. 누룩별 효소활성 측정 결과 Rhizopus 속 의 균주가 높은 활성을 보였고, 누룩별로 담금한 약주의 품질 특성 결과도 Rhizopus 속으로 제조한 누룩의 약주가 품질이 우수한 결과를 보여 쌀 전분의 발효에 적합한 곰팡 이는Rhizopus 속이라 판단되며, 그 중 R. japonicus KCCM 11604 균주로 누룩을 제조해 쌀약주를 담금할 경우 발효적 성이 우수할 것으로 판단된다.
