국내 다소비 십자화과 새싹채소 추출물의 항산화 활성

본 연구에서 사용한 십자화과 새싹채소인 콜라비, 적무, 브로콜리, 배추, 유채, 무순 및 다채는 한국식품연구원으로 부터 제공받아 사용하였다. 이들 새싹채소의 항산화활성 평가를 위하여 다음의 방법에 따라 추출물을 제조하였다. 동결건조 후 분쇄된 새싹채소의 100배에 해당하는 80% 에탄올을 가한 후, 실온에서 18시간 이상 일정 속도로 교반 하여 추출하였다. 그 후 추출액은 여과지(Whatman filter paper No. 4)를 이용하여 2회 여과한 후 하루 동안 정치시킨 뒤 다시 한 번 여과하였다. 그 후 회전식 감압농축기 (EYELA N-000, Tokyo, Japan)를 이용하여 농축시킨 뒤, 동결건조기(FD5510 SPT, Ilshin, Seoul, Korea)를 이용하여 동결건조 하여 추출물을 제조하였다.

마우스 유래 지방세포 3T3-L1 세포주는 American type culture collection(ATCC, CL-173, Manassas, VA, USA)로부 터 분양받아 사용하였다. 실험에 사용된 시약인 folin & ciocalteu's phenol reagent, sodium nitrite, aluminium chloride, sodium hydroxide, catechin, 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl(DPPH), potassium persulfate, 6-hydroxy- 2,5,7,8-tetramethlychroman-2-carboxylic acid(Trolox), 2,2'- azobis (2-methylpropionamidine) dihychloride(AAPH), 3- isobutyl-1-methylxanthine(IBMX), nitrotetrazolium blue chloride(NBT), dexamethasone(DEX), quercetion, ascorbic acid, gallic acid, N-acetyl-L-cysteine(NAC), trichloroacetic acid(TCA), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt(ABTS), potassium ferricyanide, sodium carbonate, 2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine(TPTZ), potassium persulfate, insulin, acetic acid 등은 Sigma(sigma-aldrich Co., St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였고, Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM), bovine serum(BS), fetal bovine serum(FBS), phosphate-buffered saline(PBS), penicillinstreptomycin( P/S) 및 trypsin-EDTA는 Gibco(Gaithersburg, MD, USA)로부터 구입하였으며, XTT{2,3-bis(2-methoxy- 4-nitro-5-sulfophenyl)-2H- tetrazolium-5-carboxanilide innersalt)} assay kit는 WelGene(Seoul, Korea)로부터 구입하였고, fluorescein sodium salt는 Junsei(Junsei Chemical Co., Tokyo, Japan)로부터 사용하였다.

총 페놀 함량은 Folin-Ciocaluteau의 방법(8)을 변형하여 측정하였다. 1 mg/mL의 농도로 제조한 시료 1 mL, 10% Folin-Ciocaltueu's reagent 1 mL과 2% sodium carbonate 용 액 1 mL을 혼합하여 1시간 반응 시킨 후 microplate reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하 여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. Tannic acid를 이용하 여 표준검량선을 작성하였고, 이로부터 시료의 총 페놀 함 량(mg tannic acid equivalent/g)을 산출하였다.

총 플라보노이드 함량 측정은 Moreno 등(9)의 방법을 변형하여 측정하였다. 1 mg/mL의 농도로 제조 한 시료 1 mL에 4 mL의 double distilled water(DDW)와 0.3 mL의 5% sodium nitrite를 첨가하여 5분간 반응 하였다. 0.3 mL의 aluminum chloride를 첨가하고 6분간 반응시킨 후 1 M의 sodium hydroxide 2 mL을 넣었다. DDW로 총 부피를 10 mL로 맞춘 후 microplate reader를 이용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 catechin을 사용하였 으며, 시료의 총 플라보노이드 함량은 작성된 표준곡선을 이용하여 catechin에 상응하는 양(mg catechin equivalent/g) 으로 환산하였다.

DPPH free radical 소거능은 Abdille 등(10)의 방법을 변형 하여 시료의 항산화활성을 비교하였다. 시료 0.2 mL과 etanol에 녹인 0.4 mM DPPH 시약 0.8 mL을 혼합 후 25℃ 암소에서 10분간 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하 였다. 다음 식에 의하여 DPPH free radical 소거능을 나타내 었다.

DPPH radical scavenging activity (%) =

동결건조 된 7종의 새싹채소 추출물을 75 mM phosphate buffer(pH 7.4)에 녹여 peroxy radical의 생성과 소멸에 의한 fluorescent의 감소율을 측정하였다. Peroxy radical의 생성 을 위해 AAPH를 사용하였고, 표준물질로 trolox를 사용하 여 Ou 등(11)의 방법을 응용하여 ORAC value를 평가하였 다. Black well plate에 시료 25 μL와 40 nM fluorescein 150 μL을 첨가하고 측정 직전에 37℃에서 15분간 정치하고 150 mM AAPH 25 μL를 첨가한 후 fluorescence microplate reader(Spectramax GEMINI EM, Molecular Devices)를 이용 하여 485 nm에서 전자여기 후 535 nm에서 방출되는 조건으 로 37℃에서 90분간 3분마다 fluorescence의 감소율을 측정 하였다. 표준물질인 trolox를 이용하여 the area under the curve(AUC)를 구하고 이로 표준검량선(y=1.1713x+0.266) 을 작성하여 시료의 peroxy radical 저해능을 정량하였다.

3T3-L1 지방세포에 대한 십자화과 새싹채소 추출물의 세포독성 평가는 Hanks와 Brent(12)의 방법을 변형하여 XTT assay kit를 이용하여 측정하였다. 3T3-L1 지방세포는 실험 전날 1×10⁶ cell 농도로 96-well plate에 seeding 하고 시료를 100 μg/mL 농도로 처리하여 24시간 동안 37℃ CO₂ incubator에서 배양하였다. 그 후 XTT 및 PMS(NMethylphenazonium methyl sulfate) reagent를 37℃에서 완 전히 해동 시켜 1 mL의 XTT와 20 μL의 PMS reagent를 혼합하여 working solution을 조제하였다. 이를 96-well medium 부피의 20%가 되는 양 만큼을 각각의 well에 첨가 하여 혼합하였다. CO₂ incubator에서 4시간 동안 배양 후, microplate reader를 이용하여 690 nm 흡광도 값에서 450 nm의 흡광도 값을 뺀 결과 값으로 세포독성을 계산하였다.

3T3-L1 전지방세포는 24-well plate에 각각 1×10⁶ seeding 한 후, BS(10%) 및 P/S(1%)를 함유한 High glucose DMEM (89%)에서 100% confluence 될 때까지 CO₂ incubator에서 배양하였다. 2일 후 지방세포 분화유도 물질(10 μg/mL insulin, 1 μM DEX, 0.5 mM IBMX)과 FBS(10%) 및 P/S(1%) 를 함유한 DMEM으로 전지방세포를 지방세포로 분화유도 하였다. 지방세포 분화(day 0)시 DMEM에 새싹채소 7종 추출물을 각각 100 μg/mL의 농도로 처리하였고, 이때 시료 의 효과를 관찰하기 위하여 음성 대조군(negative control)에 는 아무것도 처리하지 않았으며, 양성 대조군(positive control)에는 항산화제인 NAC(5 mM)를 처리하여 비교하였 다. 지방세포의 분화는 분화유도 물질을 처리한 후, 2일마 다 지속적으로 10 μg/mL insulin, 1% P/S, 10% FBS가 함유된 배지에 각각의 시료를 처리하여 배양하였다.

분화 과정에 따른 지방세포의 ROS 생성량을 측정하기 위하여 먼저 24-well plate에 배양 및 분화 된 3T3-L1 세포의 배양액을 제거한 후 멸균된 PBS를 이용하여 2회 세척, 0.2% NBT reagent 0.2 mL를 첨가하여 CO₂ incubator 안에서 90분 간 반응시킨 뒤 하루 정도 충분히 말린 plate에 DMSO와 1 N KOH를 7:3의 비율로 처리하고, 동량의 증류수를 추가 하여 dark blue formazan을 모두 용출시켰다. 그 후 microplate reader를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하 였다.

모든 실험은 세 번 이상 반복하였으며, 결과의 통계처리 는 SAS(9.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 이용하여 분석하였다. 유의성 분석은 one-way ANOVA 검정을 실시 하고 Duncan의 다중검정법(Duncan's multiple range test)으 로 유의성은 p<0.05 수준에서 검정하였다.

페놀 화합물은 벤젠고리의 탄소에 phenolic hydroxyl (-OH)기가 결합되어 있는 물질이다. 페놀성 화합물은 식물 계에 널리 분포되어 있는 2차 대사산물의 하나로서 다양한 구조와 분자량을 가진다. 페놀 화합물은 -OH기를 통한 수 소 공여와 페놀 고리 구조의 공명 안정화에 의해 항산화활 성을 가지며 항암 및 항균 효과 등의 생리활성을 가지는 것으로 알려져 있다(14-16). 페놀계 화학물질 중 플라보노 이드는 C₆-C₃-C₆의 기본골격을 가지고 있다. 과채류에는 anthocyanines, catechin, eicatechin, kaempferol, luteolin, myricetin, naringenin, phloridzin 및 quercetin 등 다양한 종류 의 플라보노이드들이 존재한다.

본 연구에서 십자화과 새싹채소 7종 추출물의 총 페놀과 총 플라보노이드 함량을 분석 한 결과는 Table 1과 같다. 무순 추출물의 총 페놀 함량이 24.40±1.24 mg TAE/g으로 가장 낮은 브로콜리 새싹 추출물(18.30±0.80 mg TAE/g)에 비해 약 1.3배 높은 것으로 나타났다. 콜라비 새싹 추출물의 총 페놀 함량이 23.97±0.46 mg TAE/g으로 높게 나타났으며 유채 새싹 추출물(22.17±0.18 mg TAE/g), 적무 새싹 추출물 (21.83±0.34 mg TAE/g), 다채 새싹 추출물(20.68±0.11 mg TAE/g), 배추 새싹 추출물(19.02±0.51 mg TAE/g) 및 브로콜 리 새싹 추출물 순으로 총 페놀 함량을 나타냈다. 총 플라보 노이드 함량의 분석 결과, 무순 추출물이 15.30±1.35 mg CE/g으로 가장 높은 결과를 나타냈고, 유채와 콜라비 새싹 추출물이 각각 13.34±0.58 및 13.08±0.37 mg CE/g으로 높은 값을 나타내었다. 총 페놀의 경우 무순과 콜라비 새싹 추출 물이 유의적 차이가 없었지만 총 플라보노이드의 경우 무순 추출물이 유채와 콜라비 새싹 추출물 보다 유의적으로 높게 나타났다. 플라보노이드는 페놀성 화합물로, 시료간의 유 의성 차이가 비슷한 경향을 나타내는 경우가 많으며, 서양 민들레의 부위별 추출물의 총 페놀 함량과 총 플라보노이드 함량을 분석한 Chon 등(17)의 연구와 같이 두 함량 사이의 상관계수(R²)가 0.9770(p<0.05)으로 매우 높아, 본 연구 결 과와 유사한 경향을 보였다.

식품 내 구성성분의 항산화활성은 식품 내에 들어있는 항산화물질의 함량을 측정하여 산화에 대항하는 능력을 측정하거나, 식품의 섭취 후 생체 내부에서 얼마나 항산화 활성을 갖는지에 대한 능력을 측정하여 알 수 있다(18,19). 이는 전자전달에 의한 항산화활성 측정법과 수소전자의 전달에 의한 항산화활성 측정법으로 나뉜다. 전자 전달에 의한 항산화활성을 측정하는 방법에는 대표적으로 DPPH radical 소거능 측정법이 있으며, ascorbic acid 및 tocopherol, polyhydroxy 방향족 화합물, 방향족 아민류에 의해 전자나 수소를 받아 환원되어 안정한 분자를 형성하게 될 때, 보라 색이 탈색되어지는 원리를 이용하여 다양한 천연소재로부 터 항산화물질을 탐색하기 위해 많이 이용되고 있다. 비교 적 짧은 시간 내에 간단하게 항산화능을 측정할 수 있어 널리 사용되고 있는 방법이다(20). 수소전자의 전달에 의한 항산화활성 측정법은 항산화물질의 free radical 소거능을 측정하는 방법으로, ORAC assay가 대표적인 예이다.

본 연구에서는 십자화과 새싹채소 7종 추출물을 이용하 여 전자전달을 이용한 항산화활성 측정과 수소전자의 전달 을 이용한 항산화활성 측정 두 가지를 함께 진행하여 새싹 7종 사이의 항산화활성을 비교·분석 하였다(Fig. 1). DPPH radical 소거능의 경우 각 시료의 소거능을 측정한 후 대조군 의 흡광도를 50% 감소시키는데 필요한 시료의 농도 (inhibition concentration 50, IC₅₀)로 나타내었다. 그 결과 콜라비 새싹 추출물(IC₅₀=1.95 mg/mL)이 가장 높은 DPPH 라디칼 소거능을 보였고 적무(IC₅₀=2.90 mg/mL)와 무순 (IC₅₀=3.09 mg/mL) 새싹 추출물 순으로 나타났다. ORAC value의 경우 콜라비 새싹 추출물이 79.03 mM TE/g으로 가장 높은 항산화활성을 나타내었고, 그 뒤로 배추 새싹 (69.94 mM TE/g), 무순(62.36 mM TE/g) 추출물의 순서로 나타났다. 이상의 결과를 볼 때, 콜라비 새싹 추출물의 경우 DPPH radical 소거능과 ORAC 효능 평가에서 모두 높은 항산화활성을 나타내었고, DPPH는 적무 새싹 추출물이, ORAC은 배추 새싹 추출물이 각각 두 번째로 항산화활성이 높게 나타났다. 무순 추출물 또한 DPPH radical 소거능과 ORAC 효능이 우수한 것으로 나타났다.

Fig. 1. DPPH radical scavenging activity (A) and ORAC value (B) of Brassica spp. sprout vegetables. ORAC values expressed as trolox equivalents (mM TE/g). Each bar represents the mean±SD of triplicate determinations, n=3. ^a-dMeans not sharing a common letter are significantly different (p<0.05) by Duncan's multiple test. A, B. oleraceavar. gongyloides; B, R. sativusL. var. sativus; C, B. oleraceavar. italica; D, B. rapa var. glabra Regel; E, B. napus; F, R. sativus; G, B. carnpestris var. narinosa.

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3T3-L1 지방세포에 대한 새싹 7종의 세포독성은 Fig. 2와 같다. 100 μg/mL의 농도로 십자화과 새싹채소 7종 추출 물을 처리한 후 실험을 진행한 결과, 다채를 제외한 6종에서 는 독성이 나타나지 않았다. 다채의 경우 아무것도 처리하 지 않은 control cell 대비 92.56%의 생존율을 보였다.

Fig. 2. Effect of Brassica spp. sprout vegetables on cell viability. Cell viability was determined by XTT assay. Each value is the mean±SD of the results from five different plates (n=5) and is representative of results from at least two different experiments. Statistical analysis was performed by the one-way ANOVA (p<0.05). A, B. oleraceavar. gongyloides; B, R. sativusL. var. sativus; C, B. oleraceavar. italica; D, B. rapa var. glabra Regel; E, B. napus; F, R. sativus; G, B. carnpestris var. narinosa.

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NBT assay는 NBT 용액이 지방세포 내에 축적된 reactive oxygen species(ROS)와 반응하여 dark blue formazan을 생성 하게 되며, 이를 용출하여 세포 내 ROS의 생성량을 알 수 있다. 이러한 산화적 스트레스는 지방세포의 분화 및 지방 의 축적과 밀접한 관계를 갖는 것으로 알려져 있다(13,21). 3T3-L1 전지방세포에 분화 유도 물질을 처리하여 지방세포 로 분화 시킨 뒤 생성된 ROS 생성량을 측정하기 위하여 NBT assay를 이용하여 측정한 결과는 Fig. 3과 같다. 양성대 조군으로 사용된 NAC는 thiol기를 포함하는 화합물로서 glutathione(GSH)의 전구체이며 천연 항산화제 중 하나로 잘 알려져 있다(22). 시료를 처리하지 않은 대조군과 십자화 과 새싹채소 7종 추출물의 흡광도를 비교한 결과 다채 새싹 추출물을 제외한 콜라비 새싹, 적무 새싹, 브로콜리 새싹, 배추 새싹, 유채 새싹 및 무순 추출물 6종에서 모두 ROS 생성을 저감하는 것으로 나타났다. 다채 새싹 추출물의 경 우는 control과 유의적 차이가 없었다.

Fig. 3. Effect of Brassica spp. sprout vegetables on reactive oxygen species (ROS) production in 3T3-L1 cells during the adipogenesis. CON, control cells which were differentiated with MDI; NAC, positive control cells which were differentiated with MDI in the presence of NAC. Each value is the mean±SD of the results from five different plates (n=6) and is representative of results from at least two different experiments. Statistical analysis was performed by the one-way ANOVA (p<0.05). A, B. oleraceavar. gongyloides; B, R. sativusL. var. sativus; C, B. oleraceavar. italica; D, B. rapa var. glabra Regel; E, B. napus; F, R. sativus; G, B. carnpestris var. narinosa.

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이상의 결과를 통해 지방세포의 분화과정에서 콜라비, 적무, 브로콜리, 배추, 유채 및 무순 추출물의 처리는 지방세 포 내 ROS의 생성을 억제하는 것으로 나타났다. 세포 내 산화적 스트레스는 지방세포의 분화 및 지방의 축적과 밀접 한 관계를 갖는 것으로 알려져 있는데, 에너지대사 경로에 의해 생성된 NADPH는 NADPH Oxidase 4(NOX4)에 의하 여 세포 내 superoxide를 생성한다. 이와 같이 지방세포 내에 서 생성된 ROS와 세포가 분비하는 cytokine들은 새롭게 생성되는 전지방세포의 분화를 촉진시키고, 또한 체내에서 지방세포 주변에 위치한 macrophage에 영향을 미쳐 또 다 른 ROS를 생성한다. 따라서 지방세포의 분화를 억제하는 물질은 ROS의 생성저감을 통한 지방의 축적량 감소에도 영향을 미칠 것으로 생각된다(13,21,23).