우엉 뿌리의 항혈전 및 항산화 활성

본 실험에 사용된 우엉은 2012년 7월 경북 안동에서 재배 한 우엉의 지하부를 구입하여 사용하였으며, 수세, 거피 후 별도의 건조과정 없이 추출에 적합하도록 세절한 후 95% ethanol을 시료 무게의 10배가 되도록 가하여 상온에서 3회 추출하였다. 이후 추출액은 filter paper(Whatman No. 2)로 거른 후 감압 농축(Eyela Rotary evaporator N-1000, Tokyo Rikakikai Co., Ltd., Tokyo, Japan)하여 분말로 조제하 였으며, 이후 추출물을 물에 현탁한 후 n-hexane, ethylacetate 및 butanol 을 이용하여 순차적으로 분획하고 물 잔류물을 회수하였다(6). 각각의 분획물들은 감압 건조 하여 분말화 하였으며, 이후 분말시료들은 DMSO에 적당 한 농도로 녹여, in-vitro 항혈전 활성, 적혈구 용혈 활성 및 항산화 활성 평가에 사용하였다. 항혈전 활성평가에 사 용한 혈장은 시판 control plasma(MD Pacific Technology Co., Ltd., Huayuan Industrial Area, Huayuan, China)를 사용 하였으며, PT reagent와 aPTT reagent는MD Pacific Hemostasis(MD Pacific Technology Co., Ltd., China)의 분석 시약을 사용하여 측정하였다(5). 기타 사용한 시약은 시약 급 이상으로 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)의 제품을 구입하여 사용하였다. 실험에 사용한 우엉 시료는 안동대학교 식품영양학과(Andong, Korea)에서 보관하고 있다(voucher specimen 2012-AL7).

항혈전 활성 중 혈액응고저해 활성은 시료의 thrombin time(TT), prothrombin time(PT) 및 activated partial thromboplastin time(aPTT)을 측정하여 평가하였다(5,7). TT 는 37℃에서 0.5 U thrombin(Sigma Chemical Co.) 50 μL와 20 mM CaCl₂ μL, 다양한 농도의 시료 10 μL를 Amelung coagulometer KC-1A(Amelung. Lemgo, Germany)의 튜브에 혼합하여 2분간 반응시킨 후, 혈장 100 μL를 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였으며, 시료 대조 군으로는 아스피린(Sigma Co.)을, 용매 대조군으로는 DMSO를 사용하였다. Thrombin 저해 활성은 3회 이상 반복 한 시료 TT 실험의 평균치를 용매 대조구인 DMSO의 TT 평균치의 비로 나타내었다(5). 한편 PT 측정은 혈장 70 μL와 다양한 농도의 시료 10 μL를 coagulometer의 튜브에 첨가하 여 37℃에서 3분간 가온 후, 130 μL의 PT reagent를 첨가하 고 혈장이 응고될 때까지의 시간을 3회 반복한 실험의 평균 치로 나타내었으며, prothrombin 저해 활성은 3회 이상 반복 한 시료 PT 실험의 평균치를 DMSO의 PT 평균치의 비로 나타내었다(5). aPTT 측정의 경우에는, 표준혈장 70 μL와 다양한 농도의 시료 10 μL를 coagulometer 튜브에 첨가하여 37 ℃에서 3분간 가온 후, 65 μl의 aPTT reagent를 첨가하고 다시 37℃에서 3 분간 반응하였다. 이후 65 μL CaCl₂(35 mM)을 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 3회 반복 한 실험의 평균치로 나타내었으며, aPTT 연장 활성은 3회 이상 반복한 시료 aPTT 실험의 평균치를 DMSO의 aPTT 평균치의 비로 나타내었다(5,7).

항혈전 활성 중 혈소판 응집저해 활성은, 미세전극에 혈 소판이 부착되어 응집됨에 따라 발생하는 전기 저항값의 변화를 측정하는 impedance 법을 사용하여 평가하였다 (32,33). 농축 혈소판(platelet rich plasma: PRP)은 적십자로 부터 공급받았으며 PRP 를 3,000 rpm에서 10분간 더 원심 분리하여 상층 혈장을 제거한 후 침전된 혈소판만을 회수한 후, washing buffer(138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 12 mM NaHCO₃, 0.36 mM NaH₂PO₄, 5.5 mM glucose, 1 mM EDTA, pH 6.5) 10 mL를 가하여 고르게 현탁한 후, 3,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 수세하였다. 상기 수세과정을 2번 더 반복한 후, 수세된 혈소판은 suspending buffer(138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 12 mM NaHCO₃, 0.36 mM NaH₂PO₄, 5.5 mM glucose, 0.49 mM MgCl₂, 0.25% gelatin, pH 7.4)에 현탁하여 최종 혈소판 농도가 5×10⁸/mL이 되도록 조정하 였다(32). 혈소판 응집능은 Whole Blood Aggregometer (Chrono-log, PA, U.S.A)를 사용해 37℃에서 측정하였으며, 10 mM CaCl₂ 50 μL, suspending buffer 147.5 μL, 시료 5 μL 가 포함된 반응 cuvette에 혈소판 50 μL을 넣은 후 3분 동안 37℃로 가온 후 응집유도제로 collagen(1 mg/mL)을 2.5 μL를 넣고 혈소판 응집을 측정하였다. 응집반응은 collagen 첨가 후 12분간 측정하였으며 amplitude, slope, area under 를 측정하여 평가하였다(33). 이때, amplitude(Ω)는 혈소판에 응집유도제를 첨가하였을 때 일어나는 최대 응집 정도를 나타내며, slope 는 응집유도제를 첨가한 직후부터 1분 동안의 응집곡선의 기울기를 나타내며, area under는 전체적인 혈소판 응집 정도를 표시하는 것으로 전기저항 증가에 따른 slope 곡선의 하강면적을 나타낸다(2). 시료의 혈소판 응집 저해 활성은 시료 대신 DMSO를 첨가한 대조 구와의 상대적인 area under값의 비로 나타내었다(33).

우엉 추출물 및 분획물의 안전성 평가의 일환으로 인간 적혈구(4%)를 이용하여 용혈 활성을 평가하였다. PBS로 3회 수세한 인간 적혈구 100 μL를 96-well microplate에 가하 고 다양한 농도의 시료용액 100 μL를 가한 다음 37℃에서 30분간 반응시켰으며, 이후, 반응액을 10분간 원심분리 (1,500 rpm)하여 상등액 100 μL를 새로운 microtiter plate로 옮긴 후 용혈에 따른 헤모글로빈 유출 정도를 414 nm에서 측정하였다(5). 시료의 용매 대조구로는 DMSO(2%)를 사 용하였으며, 적혈구 용혈을 위한 실험 대조구로는 triton X-100(0.1%) 및 vitamin C(0.5 mg/mL)를 사용하였다. 용혈 활성은 다음의 수식을 이용하여 계산하였다.

(%) Hemolysis = [(Abs. S–Abs. C)/(Abs. T–Abs. C)] × 100.

Abs. S: 시료 첨가구의 흡광도, Abs. C: DMSO 첨가구의

흡광도, Abs. T: triton X-100 첨가구의 흡광도.

우엉 추출물 및 분획물의 항산화 활성은 DPPH(1,1- diphenyl-2- picryl hydrazyl) anion scavenging activity(DSA), ABTS [2,2-azobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)] cation scavenging activity(ASA), nitrite scavenging activity(NSA) 및 환원력 측정으로 평가하였다(34). DSA 측정의 경우, 다 양한 농도로 희석한 시료 20 μL에 99.5% ethanol 에 용해시 킨 2×10^-4M DPPH용액 380 μL를 넣고 혼합하여 37℃에서 30 분 동안 반응시킨 후, 516 nm에서 microplate reader(Asys Hitech, Expert96, Asys Co., Austria)를 사용하여 흡광도를 측정하였으며, DSA(%)는 시료 첨가구와 비첨가구의 백분 율로 표시하였다(34). ASA 측정의 경우, 7 mM ABTS (Sigma Chemical Co.) 5 mL와 140 mM potassium persulfate 88 mL를 섞은 후 상온에서 16 시간 빛을 차단하여 ABTS 양이온을 형성시켰으며, 이후 이 용액을 414 nm에서 흡광 도 값이 1.5가 되도록 ethanol로 희석하였다. 조제된 희석용 액 190 μL와 시료 10 μL를 혼합한 후 상온에서 6 분간 반응시킨 후 734 nm에서 흡광도를 측정하고 다음의 식에 의해 ASA(%)를 결정하였다(34).

ASA (%) = [(C-S)/C] × 100, C: DMSO 첨가시 흡광도, S: 시료 첨가시 흡광도.

한편 NSA측정의 경우, 아질산염 용액(1 mM)에 시료용 액을 가하고 여기에 0.1 N HCl을 가해 pH 1.2로 조정한 후, 37℃에서 1시간 반응시킨 후 Griess reagent(Sigma Chemical Co.)를 가하고 혼합하였다. 이후 15 분간 실온에 서 방치 후 520 nm에서 흡광도를 측정하여 잔존 nitrite 양을 측정하였으며, NSA(%)는 다음의 식에 의해 계산하였다 (34).

NSA (%) = [1-(A-C)/B] ×100,

A: 1 mM nitrite 용액에 시료를 첨가하여 1시간 반응시킨

후의 흡광도,

B: 1 mM nitrite 용액의 흡광도, C: 우엉 시료의 흡광도

환원력 평가의 경우 Oyaizu등의 방법을 변형하여 측정하 였으며(34), ethanol에 용해한 시료 2.5 mL에 0.2 M sodium phosphate buffer(pH 6.6) 2.5 mL와 10% potassium ferricyanide 2.5 mL를 첨가하고 50℃에서 20 분간 반응시킨 후, 10% trichloroacetic acid 2.5 mL를 첨가하여 반응을 종료 하고 4,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 상등액을 회수하 였다. 회수한 상등액은 증류수로 2배 희석한 후, 신선하게 조제된 0.1% ferric chloride 용액과 5:1(v/v) 비율로 혼합하 고 700 nm에서 흡광도를 측정하여 평가하였다. 상기의 항 산화 실험에서 대조구로는 vitamin C(Sigma Chemical Co.) 를 사용하였으며, 용매 대조구로는 DMSO를 사용하였다. 각각의 활성 평가는 각각 3회 반복한 실험의 평균과 표준편 차로 표시하였다.

Total flavonoid(TF)의 함량 측정은 기존의 보고된 방법 (35)에 따라 측정하였으며, 각각의 시료를 18 시간 메탄올 교반 추출하고 여과한 추출액 400 μL에 90% diethylene glycol 4 mL를 첨가하고 다시 1 N NaOH 40 μL를 넣고 37℃에서 1 시간 반응 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 rutin을 사용하였다. Total polyphenol(TP) 함량은 시료 400 μL에 50 μL의 Folin-Ciocalteau, 100 μL의 Na₂CO₃포화용액을 넣고 실온에서 1 시간 방치한 후 725 nm에서 흡광도를 측정하였다(34). 표준시약으로는 tannic acid를 사용하였다.

총당 함량은 phenol-sulfuric acid법, 환원당 함량은 DNS 변법을 이용하여 측정하였다(36). 각각의 분석결과는 3회 반복한 실험의 평균과 표준편차로 나타내었다.

실험 결과는 SPSS 21.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 버전을 사용하여 mean±SD 로 나타내었으며, 각 군간의 차이는 ANOVA로 분석하였으며, Duncan 다중비교 검증법 으로 통계적 유의성 검정을 조사하였다. 유의수준은 p<0.05 로 하였다.

세척 후 껍질을 벗긴 우엉 뿌리의 ethanol 추출효율은 10.94%로 나타났으며(Table 1), 이는 Predes 등(23)이 보고 한 4.45% 보다 높은 추출효율을 나타낸 반면, 70% ethanol 추출효율 10.25%와 유사하였다. 이러한 차이는 실험에 사 용한 우엉의 품종 및 수분함량의 차이에서 기인한 것으로 판단되며, 국내 유통되는 한약재의 평균 추출효율 5.27%(5) 및 해조류 추출효율 5.9%(7)에 비해 우엉의 ethanol 추출효 율은 상당히 높음을 알 수 있었다. 추출물의 순차적 유기용 매 분획 결과, n-hexane, ethylacetate, n-butanol 분획 수율은 각각 1.62, 0.42 및 5.98%로 나타났으며, 물 잔류물은 85.38%이었다(Table 1).

우엉 ethanol 추출물의 성분 조사결과, 5.01 및 0.96 mg/g 의 낮은 함량의 TP와 TF가 확인되었으며, 총당과 환원당 함량은 각각 694.53 및 271.24 mg/g을 나타내어 상당량의 당류가 포함되어 있음을 확인하였다. 이러한 조성은, 분획 물의 대부분을 차지하는 물 잔류물에서도 유사하게 나타나 0.57 및 2.27 mg/g의 낮은 함량의 TP와 TF, 532.85 및 229.05 mg/g의 총당과 환원당 함량을 확인하였다(Table 1). 순차적 유기용매 분획물 중 ethylacetate 분획물은 45.9 및 47.36 mg/g의 높은 함량의 TP와 TF, 상대적으로 낮은 총당과 환원 당 함량을 나타내어 다양한 유용 활성이 강력하게 나타나리 라 예상되었다. 특히 ethylacete 분획 수율이 0.42% 임을 고려한다면 특정 생리활성물질이 존재하는 경우, 상기 ethylacetate 분획은 우엉 유래의 활성물질을 효율적으로 정제할 수 있는 조분획물로 이용 가능하리라 판단된다.

현재 우엉 마쇄액을 민간요법의 지혈제로 사용하고 있으 나, 이에 대한 과학적 연구는 수행된 바 없으며, 우엉의 항혈전 활성은 거의 알려져 있지 않은 상태이다. 따라서, 우엉 시료의 항응고 활성은 TT, PT, aPTT를 각각 측정하여 평가하였으며, 그 결과는 Table 2에 나타내었다. 먼저 대조 구로 사용된 aspirin(1.5 mg/mL)은 무처리구에 비해 TT는 2.7 배, PT는 1.8 배, aPTT는 2.1 배 연장시켜 우수한 혈액응 고저해 활성을 나타내었다. 우엉 ethanol 추출물의 경우에 는 최대 5 mg/mL 농도에서도 무처리구에 비해 TT, PT 및 apTT에서 거의 저해활성이 인정되지 않았으며, 물 잔류물 에서는 5.0 mg/mL 농도에서는 무처리구에 비해 TT는 1.3 배 연장되었으나, aPTT 는 오히려 0.7 배로 감소되었다. 따라서 우엉 추출물의 대부분을 차지하는 물 잔류물의 경우 혈액응고인자 활성화를 통해 혈전 생성을 촉진할 수 있음을 나타내며, 민간에서 우엉을 지혈제로 사용하는 근거로 예 상된다. 분획물 중, hexane 분획물은 5 mg/mL의 고농도에서 TT는 13 배 이상 연장시켰으며, PT는 2.5 배 연장시켰으나, 혈액응고인자 저해와 관련된 aPTT의 경우 무첨가구에 비 해 변화가 없었다. Butanol 분획물(5 mg/mL)의 경우 혈액응 고저해 활성이 인정되었으나 아스피린에 비해 미미하였다. 반면 ethylacetate 분획은 2.5 mg/mL 농도에서 아스피린보 다 강력한 혈액응고저해를 나타내었으며, 특히 아스피린의 1/3~1/6의 농도(0.25~0.5 mg/mL)에서 아스피린에 필적하는 TT 연장효과를 나타내었으며, 농도 의존적인 혈액응고 저 해를 나타내었다. 상기의 결과는 우엉의 ethylacetate 분획은 우수한 혈액응고 저해활성을 나타내며, 물 잔류물은 혈액 응고인자 활성화를 통해 지혈효과를 나타낼 수 있음을 제시 하고 있으며, 향후 각각 분획물의 활성물질 정제 및 이들의 항혈전 활성 연구를 진행할 필요가 있다고 판단된다.

혈소판은 다양한 혈구세포와 함께 내피세포의 손상으로 노출된collagen 등과 결합하여 1차 지혈 플러그(primary hemostatic plug)를 형성하여 혈전생성을 개시하는 중요한 세포이다(1). 우엉 시료의 혈소판 응집능을 평가하기 위해, 먼저 혈소판 응집저해제인 아스피린(0.25 mg/mL)을 첨가 하여 혈소판 응집도를 평가한 결과 amplitude 8Ω, area under 56.4로, 무첨가구 DMSO의 14Ω, 94.7에 비해 각각 57.1% 및 59.5%의 결과를 나타내었으며, 이러한 혈소판 응집저해 활성은 농도 의존적으로 나타나 아스피린의 강력 한 응집저해 활성을 확인하였다(Table 3, Fig. 1). 한편 우엉 ethanol 추출물(0.25 mg/mL)은 amplitude 6Ω,와 area under 50.3의 값을 나타내어, 동량의 아스피린보다 강력한 혈소판 응집저해 활성을 가짐을 확인하였다. 이의 분획물들 역시 22.2~45.6%의 혈소판 응집능을 나타내어, 아스피린보다 강 력한 혈소판 응집저해 활성을나타내었으며, 특히 ethylacetate 분획물의 경우 용매 대조구에 비해 12%의 혈소판 응집만이 나타나, 가장 강력한 혈소판 응집저해 활성이 나타냄을 확 인하였다. 이는 ethylacetate 분획이 정제되지 않은 상태에서 도 아스피린의 2배 이상의 혈소판 응집저해 활성을 나타냄 을 의미하며, 활성물질 정제시에는 위장장해 유발 등의 부 작용이 있는 아스피린을 대치할 수 있는 강력한 항혈전제로 개발 가능하리라 기대된다.

Fig. 1. Diagrams of impedance changes dur ing platelet aggregation after addition of aspirin and the samples of Arctium lappa L. in whole blood aggregometer .

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우엉 시료들의 적혈구 용혈활성을 평가한 결과는 Table 4에 나타내었다. 대조구로 사용된 DMSO와 vitamin C는 용혈활성이 없었으며, triton X-100은 0.1% 농도에서 적혈 구를 100% 용혈시킴을 확인하였다. 우엉 ethanol 추출물은 0.5 mg/mL 농도까지 용혈활성이 없었으며, 이의 분획물 중에서는 ethylacetate 분획에서만 7.78%의 미약한 용혈을 나타내었다. 그러나 ethylacetate 분획 역시 0.25 mg/mL 이하 의 농도에서는 3% 이하의 용혈을 나타내어, 우엉 시료의 저농도 사용은 적혈구 용혈의 문제는 나타내지 않으리라 판단되었다.

우엉 시료의 항산화 활성은 DPPH, ABTS 및 nitrite 소거 능을 평가하여 각각의 라디컬에 대해 50% 소거능을 나타내 는 농도(IC₅₀)를 계산하였으며, 그 결과는 Table 5에 나타내 었다. 먼저 대조구로 사용된 vitamin C의 DPPH, ABTS 및 nitrite 소거능의 IC₅₀는 각각 15.2, 5.3 및 15.8 μg/mL로 강력 한 항산화 활성을 나타내었다. 한편, 우엉 ethanol 추출물, hexane 분획물, 물 잔류물들은 매우 미약한 소거능을 나타 내었으며, butanol 분획에서 약한 DPPH 음이온 소거능과 우수한 ABTS 소거능을 나타내었다. 그러나 ethylacetate 분 획에서는 DPPH, ABTS 및 nitrite 소거능의 IC₅₀가 각각 51.6, 17.8 및 26.6 μg/mL를 나타내어 우엉 시료에서의 항산화 활성은 주로 ethylacetate 분획에서 기인함을 알 수 있었다 (Table 5). 한편 환원력 측정의 경우에도 ethylacetate 분획 및 butanol 분획에서만 유의적인 활성이 나타났으며, 특히 ethylacete 분획에서는 50 μg/mL농도에서 vitamin C의 34% 의 환원력을 나타내었다(Fig. 2). 이상의 결과는 우엉 추출 물 및 분획물이 다양한 항혈전 활성 물질 및 항산화 물질을 포함하고 있음을 제시하며, 특히 ethylacetate 분획물은 강력 한 항혈전 및 항산화 활성을 나타내어 이를 이용한 건강 기능성식품 및 천연물 신약 개발이 가능함을 제시하고 있 다. 특히 ethylacetate 분획물의 수율이 0.42%임을 감안한다 면, 향후 관련 활성물질의 정제와 작용기작 규명 연구가 필요하다고 판단된다.

Fig. 2. Reducing power of the ethanol extracts and their organic solvent fractions of Arctium lappa L. Symbols: ●: ethanol ex., ○: hexane fr., ▼: ethylacetate fr., ▽: butanol fr., ■: water residue and ♦: vitamin C, respectively.

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본 연구는 2012년도 안동대학교 산학연구비 지원사업에 의해 수행된 연구입니다.