고추장 제조시 발효가 항돌연변이 및 in vitro 항암효과에 미치는 영향

본 연구에서 사용된 고추장 재료와 개량식 고추장은 모 두 H사(충남, 논산)에서 직접 제공받아 사용하였다. 고추장 재료 중, 밀은 80% 도정된 것(호주산)을 사용하였고 고춧가 루는 국내산을 사용하였으며, 소금은 정제염(한주소금, 울 산)을 사용하였다.

발효 단계별로 고추장의 기능성을 확인하기 위해, 밀, 1차발효밀, 2차발효밀, 최종발효밀, 고춧가루와 이렇게 제 조된 개량식고추장을 이용하여 실험을 하였다. 1차발효밀 (first fermented wheat grains, FFWG)은 A. oryzae를 접종한 밀가루 곡자에 증자한 밀과 식염, 종수를 첨가하여 35°C에 서 3일간 발효시킨 것이고, 2차발효밀(second fermented wheat grains, SFWG)은 1차발효밀에 Z. rouxii를 접종하고 혼합발효(in tank Ⅰ, 30°C, 7일)한 것이며 최종발효밀(final fermented wheat grains, FiFWG)은 2차발효밀을 이송한 후 균질화(in tank Ⅱ, 30~40일) 하여 발효시킨 것이다. 개량식 고추장은 최종발효밀에 고춧가루를 4:1의 비율로 첨가하여 상품용고추장으로 제조하였다(Fig. 1). 또한 제조된 고추장 은 30°C에서 15일 및 30일간 후발효를 시켜 발효기간에 따른 in vitro 항암기능성의 변화를 측정하였다.

항돌연변이 및 항암 기능성 실험을 위해서 모든 시료를 동결건조 시킨 후 마쇄하였다. 시료에 20배(w/v)의 메탄올 을 첨가하여 12시간 교반을 3회 반복한 후 여과하여 회전식 진공 농축기(EYELA, Tokyo Rikakikai Co., Japan)로 농축하 여 메탄올추출물(methanol extract)을 얻었다(9). 이들 추출 물들은 dimethyl sulfoxide(DMSO; Sigma-Aldrich Chemical Co., USA)에 희석하여 실험에 사용하였다.

직접돌연변이원인 N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG)는 Sigma-Aldrich Chemical Co.(USA)에서 구입하 여 증류수에 녹여서 사용하였다. D-Biotin, L-histidine⦁ HCl(monohydrate), D-glucose-6-phosphate(mono sodium salt), NADP(sodium salt)는 Sigma Chemical Co.에서 구입하였으 며, Bacto nutrient broth(dehydrated)와 Bitek agar는 Difco Laboratories(Detroit, MI, USA)로부터 구입하였다. Sal. Typhimurium LT-2 histidine 영양요구성인Sal. Typhimurium TA100은 미국 캘리포니아 대학의 Ames B.N. 박사로부터 제공받아 실험에 사용하였다. 그리고 이 균주는 새로운 frozen permanent가 준비되었을 때나 매 실험 직전 histidine 요구성, deep rough(rfa) 돌연변이, uvrB돌연변이, R factor 등의 유전형질을 Maron과 Ames 등(15)의 방법으로 확인하 여 사용하였다.

세포배양을 위해 RPMI 1640, fetal bovine serum(FBS), 0.05% trypsin-0.02% EDTA 그리고 100units/mL penicillinstreptomycin을 GIBCO사(Grand Island, NY, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 세포배양은 37°C에서 CO₂ incubator (311, Forma Scientific Inc., Waltham, MA, USA)를 사용하였 다(13).

본 실험에서 주로 이용하였던 preincubation test는 phosphate buffer saline 0.5 mL, 하룻밤 배양된 균주(1~2×10⁹ cells/mL) 0.1 mL, 희석된 시료(50 μL)와 돌연변이 유발물질 (50 μL)을 cap tube에 넣고 가볍게 vortex하였다. 45°C의 top agar 2 mL씩을 각 tube에 붓고 3초 간 vortex하여 미리 준비한 minimal glucose agar plate에 도말하고 37°C에서 48 시간 배양한 후 복귀돌연변이 숫자를 계수하였다. 한편 실 험에 사용된 시료와 돌연변이 유발물질의 농도는 예비실험 (dose response 및 독성실험)을 통하여 결정하였다. 돌연변 이 억제효과의 정도(inhibition rate)는 (a–b)/(a–c)×100에 의 해 계산하였다. 여기서 a는 돌연변이원에 의해 유도된 복귀 돌연변이수, b는 시료를 처리하였을 때의 복귀돌연변이의 수이며, c는 돌연변이원과 시료가 없을 경우의 자연 복귀돌 연변이의 수이다(15).

HT-29 인체 대장암세포와 AGS 인체 위암세포는 한국 세포주 은행(서울대학교 의과대학)으로부터 분양받았다. HT-29 인체 대장암세포와 AGS 인체 위암세포는 100 units/mL의 penicillin-streptomycin과 10%의 FBS가 함유된 RPMI 1640을 사용하여 37°C, 5% CO₂ incubator에서 배양하 였다. 배양된 각각의 암세포는 일주일에 2~3회 refeeding하 고 6~7일 만에 PBS로 세척한 후 0.05% trypsin-0.02% EDTA 로 부착된 세포를 분리하여 원심 분리한 후 집적된 암세포 에 배지를 넣고 피펫으로 암세포가 골고루 분산되도록 잘 혼합하여 75 mL cell culture flask에 7 mL 씩 일정 수 분할하 여 계속 6~7일 마다 계대 배양하면서 실험에 사용하였다 (13).

배양된 암세포는 96well plate에 well당 1×10⁴ cells/mL가 되게 180 μL씩 분주하고 시료를 일정농도로 제조하여 20 μL 첨가하여 37°C, 5% CO₂ 배양기에서 72시간 배양하였다. 여기에 인산생리식염수에 5 mg/mL의 농도로 제조한 MTT 용액 20 μL를 첨가하여 동 배양조건에서 4시간 더 배양하였 다. 이를 550×g에서 10분간 원심 분리하여 상징액을 제거하 고, 각 well 당 DMSO 150 μL를 가하여 30분간 교반한 후 ELISA reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다(16,17)

각 시료로부터 얻은 실험자료로부터 ANOVA를 구한 후 Duncan’ multiple range test를 이용하여 p<0.05 수준에서 통계 분석하였다.

전통 장류에 대한 생리활성 효과에 관한 연구에서 Jung 등(18)은 전통 장류가 항돌연변이 및 항암효과가 있음을 보고하였고, Yoon 등(19)은 발효식품인 된장, 고추장, 간장 및 청국장의 메탄올추출물이 높은 항돌연변이원성이 있었 으며 돌연변이원의 종류에 따라 서로 다른 항돌연변이 효과 를 나타낸다고 보고하였다. 본 실험에서는 고추장 및 발효 밀의 항돌연변이 효과를Sal. Typhimurium TA100을 이용한 Ames test를 실시하여 MNNG에 대한 항돌연변이 효과를 살펴보았다(Table 1). 2.5 mg/plate로 처리하였을 때 원료 밀의 항돌연변이 효과가 34%로 나타났으며 FFWG, FiFWG 의 발효과정이 증가함에 따라 항돌연변이 효과가 증진되었 으며 각각 49%, 52%로 나타났다. 최종발효밀과 고춧가루 로 제조된 고추장은 55%로 가장 높은 항돌연변이 효과를 나타내었다(p<0.05). 고춧가루의 경우에는 46%로 원료 밀 의 다음 순으로 나타났다. 시료 처리농도가 5 mg/plate일 때도 거의 비슷한 경향을 나타내었으며 원료 밀은 38%로 나타났는데 발효가 가장 길었던 FiFWG는 59%로 원료밀보 다 21%의 항돌연변이 효과가 증진되었다. 고춧가루의 항돌 연변이 효과는 56%로 발효밀과 유사하였으며, 고추장의 경우에는 저해율이 63%로 가장 높은 항돌연변이 효과를 나타났다. 본 연구에 나타난 결과는 Lee(13)가 연구한 전통 고추장인 식혜 고추장, 밥 고추장과 떡 고추장이 0개월째에 각각 32%, 22%, 25%였지만, 발효 4개월째에는 52%, 28%, 37%로 각각 증가되었으며, 발효 8개월째에는 각 51%, 38%, 42%로 발효가 진행됨에 따라 항돌연변이 효과가 점차 증가 하는 결과와 비슷하였다. 따라서 본 연구에서 밀이 오래 발효될 수록 항돌연변이효과가 높아지므로 밀의 발효정도 는 항돌연변이 효과에 상당한 영향을 미친다고 할 수 있으 며 고추장에 첨가된 재료들과 이 과정 중에 생성된 발효산 물 등의 활성물질이 작용한 것으로 생각되어 진다(22,32). 본 실험에서 밀의 발효과정이 길어지면서 항돌연변이효과 가 높아 진 이유는 발효하는 과정 중에 생성되는 발효산물 들외에 발효에 의해 많이 증식된 미생물자체의 작용에 의해 나타난 것으로도 생각되어 진다(23). Choi (20)의 연구 에서 고춧가루의 품종에 따른 MNNG에 대한 항돌연변이 효과는 명품과 청양품종이 57%, 52%로 높았고, 산지별로 는 영양, 안동, 이천이 항돌연변이 효과가 각각 61%, 55%, 53%로 높았다고, Kim 등(21)은 고춧가루 추출획분들은 아 플라톡신B₁ 에 의해 발생되는 mutagenicity를 저해하는 효 과를 나타내었으며 3분획 모두 저해 효과를 보였는데 첫 번째 분획은 돌연변이 유발성을 약 70%정도 저해하였다고 하였다. 이와 같이 본 연구에서도 밀의 발효산물과 함께 고춧가루가 높은 항돌연변이 효과를 나타내었다. 고춧가루 의 항돌연변이효과에 영향을 끼칠 수 있는 인자는 고추내의 매운 성분인 capsaicin이라 추정되며(20,21), 또한 고춧가루 에 많이 함유되어 있는 비타민C와 β-carotene도 돌연변이를 억제함에 있어서 중요한 역할을 하고 있는 것으로 추정된다 (21).

개량식 고추장의 재료 및 발효밀과 고추장 시료들의 in vitro 항암효과를 인체암세포를 이용한 MTT assay로 측정 하였다. Table 2에서 보는 바와 같이 HT-29 인체 결장암세 포의 MTT assay결과는 처리 농도 0.5 mg/mL 와 1.0 mg/mL 에서 원료 밀(45%, 55%)은 고춧가루(68%, 83%)보다 항암 효과가 낮았으나 발효가 진행되는 과정동안 계속 활성이 증가되는 것으로 나타났다. 0.5 mg/mL로 처리하였을 때 1차발효밀(FFWG)은 발효되지 않은 밀보다 각 10%씩 항암 효과가 증진되었는데 발효가 더 많이 된 2차발효밀(SFWG) 과 최종발효밀(FiFWG)은 항암 효과가 각각 65%, 71%로 항암 효과가 더 증진되었으며 고춧가루와 FiFWG로 제조된 고추장은 71%의 항암효과를 나타내었다(p<0.05). 1 mg/mL 농도로 처리했을 때도 비슷한 경향이 나타났다. Lee(13)와 Kong(14)의 연구에서 숙성(발효)된 고추장과 숙성되지 않 은 고추장을 비교한 결과 숙성된 고추장이 인체대장암세 포, 인체위암세포와 마우스의 서혜부 피하 종양세포에서 더 높은 성장 저해율을 나타내어 발효과정이 중요한 항암효 과 증가요인으로 보고하였다. Seo 등(23)은 고추장에서 분 리한 균주의 대장암 억제효과를 관찰하였으며 65~78% 이 상의 높은 암세포 저해활성을 보였다. 따라서 본 연구에서 도 밀이 발효되면서 생성된 발효산물들이 중요한 활성물질 로서 항암효과를 나타낸 것으로 사료되어 지며 발효과정을 거치면서 발효산물 뿐만 아니라 고추장발효에 관여한 미생 물이 많이 생성되어서 고추장의 항암기능성을 증진시켰다 고 생각되어 진다.

Table 3에서는 AGS 인체 위암세포를 이용하여 시료들의 MTT assay를 실시한 결과를 보여주고 있다. 결장암 세포에 서의 결과와 비슷했지만 원료 밀은 0.5%와 1.0% 처리농도 에서 각각 48%, 62% 정도의 항암효과를 나타났는데 밀을 발효한 최종 발효밀은 76%, 91%의 억제율로 앞의 결과에 서 보다 더 높은 항암 활성을 나타내었다(p<0.05). Lee(13) 는 sarcoma-180 cells을 이용한 전통고추장의 마우스종양억 제실험에서 저해율이 발효가 빠르게 진행된 식혜 고추장이 33%의 항종양효과로 밥 고추장(27%)과 떡 고추장(7%)보 다 더 높았다고 하였다. 또한, Kong(14)은 잘 숙성된 고추장 은 발효되지 않은 고추장(17%)보다 마우스의 서혜부 피하 에 이식된 종양세포로부터 종양생성을 45%나 억제하였다 고 하였다. 마우스에 Colon 26-M3.1 cell을 이용하여 폐로 전이되는 종양의 개수를 측정한 결과 대조군의 318개의 종양개수에 비해 전통고추장의 경우 각각의 농도에서 종양 개수 52, 66개로 79%, 84%에 이르는 높은 전이억제율이 관찰되었다고 하였는데 발효에 의해 구성성분의 구조가 변형됨으로서 생리활성이 더욱 높은 물질이 만들어 진다고 하였다. 이 등(31)은 메밀가루 첨가 고추장에서 발효과정 중 rutin의 aglycone인 quercetin의 함량이 증가하였음을 관 찰하였다. 또한, 밀의 주요 활성성분인 ferulic acid가 효모의 작용에 의해 생리활성이 향상된 4-vinylguaiacol로 분해되 는 등 더 많은 양의 phenolic flavor compounds를 생산하는데 폴리페놀의 높은 항암작용이 알려져 있음에 따라 본 연구에 서 잘 발효된 밀이 항암효과가 높은 이유가 phenolic compounds가 많이 생성되어 암세포의 성장을 억제하는 효 과가 나타난 것으로 생각되어 진다(22,26,27).

고춧가루도 항암 활성이 높았고 최종발효밀에 고춧가루 를 첨가한 개량식 고추장이 74%, 92%로 역시 항암 활성이 가장 높았다. 고추에서 매운 맛을 나타내는 물질인 capsaicin 은 HT-29 인체 대장암세포에서 AMPK 활성화하여 apoptosis를 유도한다고 보고되어 있다(24). Park 등(25)은 마우스를 이용한 실험에서 capsaicin이 전암성 병변인 papiloma의 형성을 억제하는 것을 관찰하였다. Capsaicin은 위장보호효과 및 암세포 사멸 유도 효과에 대한 연구결과와 leukemia와 같은 암세포에서 apoptosis 유도효과를 나타냄 이 보고되어 있다(28-30). 따라서 본 연구에서 capsaicin 및 고춧가루에 있는 식물화합물 등의 작용으로 인해 최종발효 밀에 고춧가루를 첨가하여 제조된 개량식 고추장이 항암효 과를 더 증가시킨 것으로 사료되어 진다.

항암 효과가 가장 좋았던 최종발효밀에 고춧가루를 첨가 하여 제조된 고추장의 30°C에서 발효기간(15 days, 30 days) 에 따른 AGS 인체 위암세포에 대한 암세포 성장억제효과 를 살펴보았다(Fig. 2). 발효되지 않은 고추장보다 15일 동 안 발효된 고추장이 암세포 성장을 유의적으로 감소시켰고 (p<0.05), 15일발효시킨 고추장과 30일발효시킨 고추장은 유의성이 없는 것으로 나타났다. 따라서, 발효기간을 더 연장시켜 추후실험을 진행할 필요성이 있으며 발효기간이 길어지면 고추장은 더 높은 항암효과를 나타낼 것이라고 추정된다. 이는 앞에서 언급한 것과 같이 밀의 발효가 오래 진행될 수록 생리활성물질이나 발효에 의해 미생물이 많이 증식되어 나타난 것으로 사료되며 고춧가루를 첨가하여 고춧가루에 있는 매운 성분인 capsaicin, 비타민C와 β-carotene등에 의해 더욱 높은 항암효과가 나타난다고 생각 되어진다(21,22). 따라서 고추장 자체를 더욱 오래 발효시 킨다면 더 높은 항암효과가 나타날 것이라고 생각되며 이에 대한 후속 연구가 필요하다.

Fig. 2. Inhibitory effect of methanol extract from Kochujang prepared and fermented more for 15 and 30 days at 30°C on the growth of AGS human gastric cancer cells in MTT assay. ^a-eMeans with the different letters on the bars are significantly different (p<0.05) by Duncan’s multiple range test.

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이상으로 고추장제조 재료인 밀이 발효되면서 항돌연변 이 효과와 항암 효과가 높아지며 최종발효밀에 고춧가루를 첨가하여 제조된 고추장이 가장 높은 항돌연변이 효과와 항암 효과를 보였다. 따라서 발효가 고추장의 기능성에 높 은 영향을 끼치며 발효된 고추장 속에는 고춧가루나 capsaicin보다는 발효를 통한 1,2,3,-propanetriol-1-acetate, 1,2,3,-propanetriol과 같은 활성물질(22)과 폴리페놀성분 (27)등이 존재하는 것으로 보이며 전분질 발효에 대한 계속 된 항암 효과 연구가 필요하다고 하겠다.