서 론
탁주는 맑은 술을 떠내지 않고 그대로 거른 술로써 막걸 리라 불리어지며, 우리 술중 역사가 오래된 술이다(1). 특히, 일반 주류와는 달리 당질, 비타민 B군 및 단백질이 풍부하 고, 누룩의 protease에 의해 단백질이 분해된 valine, leucine, serine, proline, glycine 등의 아미노산과 식이섬유 등이 많아 소주 등의 다른 주류와는 차별화된 특성을 가지고 있다 (2,3). 또한 간 기능 개선효과, 콜레스테롤 및 고혈압 저해효 과 등의 기능적 특징도 가지고 있다(4). 전통누룩의 원료와 종류에 따라 누룩 미생물이 생산하는 알코올 발효력, 이화 학적 특성, 효소활성, 유기산 생성력 등이 다르다. 또한 생산 된 지역에 따라 누룩 특성이 달라 술덧의 색, 향, 맛 등의 품질에도 차이가 있어 지역에 적합한 탁주 개발이 필요하다 (5).
1938년 국내에 도입된 일본 술 제조용 균주인Aspergillus luchuensis가 입국제조에 이용되면서부터 탁주에도 사용되 기 시작하였다(6). 입국으로 빚은 탁주는 독특한 향과 아미 노산 함량이 낮으며, 유기산의 신맛이 지나치게 강하여 전 통누룩으로 제조했을 때와 같은 조화로운 향미를 나타내지 못하는 것으로 알려졌다. 그러나 입국을 탁주 제조에 사용 하면 술덧을 산성으로 유지하여 발효를 안전하게 하고 발효 시간을 단축시키며, 알코올 수율도 높여주는 이점이 있다. 하지만 단일균주 사용과 더불어 원재료가 쌀에 한정되어 우리 술의 다양성이 상실되었으며, 현재까지도 전통주의 풍부한 향미를 재현시키지 못하는 실정이다(7).
국내 양조에 관련된 발효 미생물, 누룩, 제조공정 개발 등의 연구는 일본 입국에서 분리하거나 전통누룩에서 분리 한 미생물 특성 연구가 대부분이고(6,8-10), 그 외, 탁주 품질에 대한 연구가 보고되고 있다(2,5,10). 그러나 전통주 에 적합한 효모 선발이나 육종 및 생산에 관한 연구와 더불 어 유용 양조 미생물을 이용한 누룩 제조와 이를 활용한 주류 개발은 미흡한 실정이다. 또한 발효 기술력 부재로 누룩 및 전통주 제조공정이 까다롭고 관여 미생물이 균일하 지 못함으로 규격화된 제품 생산이 쉽지 않아, 품질의 고급 화와 표준화에 대한 연구도 시급하다(11).
본 연구에서는 전통누룩에서 분리한 효모와 곰팡이를 이용하여 우리 술의 대표주자인 탁주의 주질 향상을 위해, 알코올 생성능이 우수한 양조용 효모와 더불어 양조용 곰팡 이를 균주별로 제조한 쌀누룩 및 이들 배합비율에 따른 술덧의 품질 특성을 조사함으로써 탁주의 주질 향상을 통한 고급화 및 현대화에 기여하고자 한다.
재료 및 방법
본 실험에 사용한 밀기울은 전북 익산지역에서 재배 (2010년 산)된 것을 사용하였고, 쌀누룩 및 덮밥용 쌀은 현재 국내에서 가장 많이 보급된 경기미(추청미)와 단백질 과 지방성분이 적고 물리적·이화학적 특성 등의 기호도가 우수한 한아름(2012년 산) 품종을 사용하였다(12). 시험 균 주는 농촌진흥청 국립농업과학원 발효식품과에서 분리·보 관한Saccharomyces cerevisiae Y190, Y260, Y268, Y281를 사용하였고, 전통누룩에서 당화력과 액화력 활성이 뛰어난 두 종류의 곰팡이(A. luchuensis 34-1과 Lichtheimia ramosa CN042)를 선정하였으며, 밀기울 배지에서 30°C, 5일 간 계 대배양한 후, 4°C 냉장고에 보관하면서 사용하였다.
효모 종류에 따른 알코올 생성능을 조사하기 위해, 4종류 의 S. cerevisiae Y190, Y260, Y268, Y281를 YPD배지에 접종하여 30°C에서 24시간 배양한 후, 생성된 CO2량을 확 인하였다. 또한 효모 농도에 따른 알코올 생성능은 dextrose 를 24% 첨가한 YPD배지에 각각의 효모를 각 농도별(0, 0.3, 0.6, 1.0%(v/v))로 접종하여 30°C에서 60시간 배양하였 으며, 배양 후 생성된 알코올 함량을 측정하였다(13).
액체종국은 20-mesh sieve로 거른 밀기울 배지를 고압멸 균(121°C, 25분)하고 여기에 2종류의 양조용 곰팡이(A. luchuensis 34-1, Lich. ramosa CN042)를 각각 접종하여 3일 간 배양(30°C, 100 rpm)하였다. 전 배양액 5%를 본 배양배지 에 접종하여 4일간 배양(30°C, 100 rpm)한 후, 여과공정을 거쳐 액체종국을 제조하였다. 쌀누룩은 2종류의 쌀 품종(추 청미, 한아름)을 깨끗이 씻고 3~4시간 침지한 후, 소쿠리에 서 물 빼기를 하고, 증자기에서 고두밥을 증자한 후, 40°C가 되도록 급속히 냉각시켜 서로 다른 양조용 액체종국을 살포 하여 뒤집기와 뒤섞기를 거쳐 4일째 출국하였다.
본 연구에서 제조한 탁주는 원료별로 제조한 4종류의 쌀누룩을 속양 주모법으로 술을 빚었다. 술덧의 원료 사용 비율은 고두밥 500 g, 각각의 쌀누룩(A. luchuensis 34-1, Lich. ramosa CN042로 제조한 쌀누룩) 100 g 가수량은 180%, 사용 효모는 S. cerevisiae Y268를 0.3%(v/w) 접종하 였고, 1 L 용기로 25°C에서 6일간 발효한 후, 부직포로 여과 한 여액을 시료로 사용하여 분석하였다. 본 연구에서는 탁 주의 주질 다양성을 유도하기 위해 쌀 품종과 누룩의 배합 비율에 따른 품질 특성을 모니터링 하였다. 특히 균주별로 제조한 쌀누룩의 배합 비율은 A. luchuensis 34-1와 Lich. ramosa CN042을 1:0, 0:1, 1:1, 1:3의 조합으로, 4종류의 탁주를 제조하였다.
알코올 함량은 시료 100 mL를 가열하여 증류액을 80 mL까지 받은 후, 100 mL까지 물로 정용한 후, 주정계를 사용하여 그 표시도를 읽어 Gay-Lussac표로서 15°C로 보정 하여 나타내었다(13).
pH는 pH meter(Metrohm 691, Herisau, Switzerland)로 실 온에서 측정하였고, 총산도는 시료 10 mL에 0.5% phenolphthalein 2~3방울을 떨어뜨린 다음, 0.1 N NaOH로 중화 적정하였으며 소비된 용액의 양을 acetic acid(%)로 환산하였다. 아미노산도는 시료 10 mL를 0.1 N NaOH로 중화시킨 후, 중성 포르말린액 5 mL를 가하여 혼합하고 여기에 0.1 N NaOH 용액을 적정하여 pH 8.3이 될 때까지 소요된 0.1 N NaOH의 mL 수로 표시하였다.
효소활성은 시료 10 g에 염화나트륨 용액 50 mL를 넣고 저온실(4°C)에서 하룻밤 또는 실온(15~20°C)에서 3시간 침 출·여과한 조효소액을 일본 국세청소정분석법(14)에 따라 효소활성을 분석하였다.
유기산 분석은 HPLC (LC-20A Prominence, Shimadzu Co., Kyoto, Japan)을 사용하였고 column은 KC-811(7.8×300 mm, Shodex Co.), mobile phase는 4 mM sulfuric acid를, flow rate는 0.6 mL/min, injection volume은 10 μL, detector는 PDA(210 nm)를 사용하였다(15). 유리 아미노산 분석은 시 료 1 g에 70% ethanol을 10배 넣고 추출한 다음, 가열 및 여과한 후, 감압 농축하여 0.02 N-HCl로 녹이고 0.2 μm membrane filter (Millipore Co. Cork, Ireland)로 재여과한 후, amino acid analysis system (L-8900, Hitachi Co., Tokyo, Japan)을 이용하여 분석하였다(16).
결과 및 고찰
효모 종류에 따른 알코올 생성능을 조사한 결과, 4종류의 서로 다른 양조용 효모중에서 Y190, Y260, Y268의 CO2 생성량이 상대적으로 높게 나타났다(data not shown). 그리 고 YPD 액체배지에 농도별(0, 0.3, 0.6, 1%)로 배양한 결과, 알코올 생성능이 우수한 효모는 0.3%에서 9.3% 알코올을, 1% 농도에서도 9.9% 알코올을 생성한 Y268를 우수 효모로 선정하였고, 접종량 대비 알코올 생성능이 우수한 0.3%의 농도를 최적 접종 농도로 선정하였다(Table 1).
균주별 및 쌀 품종별로 제조된 4종류 누룩의 이화학적 특성(pH, 총산, 아미노산도) 결과를 Table 2에 나타내었다. A. luchuensis 34-1로 만든 추청미 누룩과 한아름 누룩 pH는 3.77과 4.24이었고, Lich. ramosa CN042로 만든 추청미 누 룩과 한아름 누룩 pH는 5.06과 5.30이었다. 양조용 곰팡이 A. luchuensis 34-1로 만든 2종류 누룩의 총산도(0.38%, 0.26%)와 아미노산도(2.62, 2.98)는 양호하지만, Lich. ramosa CN042는 총산이 낮은 것으로 보아 쌀 품종에 따라 관여 양조용 곰팡이의 특성이 다른 것을 알 수 있으며, 탁주 용 쌀누룩으로는A. luchuensis 34-1 균주가 가장 우수하였 다. Woo(2) 등은 대구·경북지역 농가에서 7종의 누룩을 수집하여 분석한 결과, pH는 5.4~5.9의 범위로, 총산도는 0.1%로 나타났다. 본 연구에서A. luchuensis 34-1로 제조한 누룩의 pH는 시판누룩보다 상당히 낮고, 산도는 3배 이상 높은 값을 보였는데, 이는 탁주 제조 시 초기에 산의 보충이 나 미생물에 의한 유기산 생성이 이루어져야 하나(17), 본 연구에서 제조한 누룩을 사용하면 탁주 제조 시 부수적인 산 첨가가 필요 없어 경제적일 것으로 판단되었다.
균주별 및 쌀 품종별로 제조한 쌀누룩의 효소 활성을 조사하여 Table 3에 나타내었다. 쌀 품종에 따라 A. luchuensis 34-1로 제조한 쌀누룩의 산성 단백질 분해력은 17,343.6 units/g과 16,449.6 units/g으로Lich. ramosa CN042 로 제조한 쌀누룩보다 2.0~3.3배 낮았고, 당화력은 4.2~11.4 배 낮은 것을 볼 수 있었다. 이 결과를 통해 A. luchuensis 34-1 균주가 Lich. ramosa CN042보다 이화학적 특성뿐만 아니라 효소 활성도 뛰어난 것을 알 수 있었다.
균주별 및 쌀 품종별로 제조한 누룩의 유기산 분석을 Table 4에 나타내었다. A. luchuensis 34-1로 만든 추청미 누룩은 citric acid와 formic acid, Lich. ramosa CN042은 citric acid와 oxalic acid가 주요 유기산이며 전체 4종류의 유기산 이 검출되었다. 이와 반대로, 한아름 누룩은 양조용 곰팡이 종류에 따라 생성된 유기산 양은 차이가 있지만 주요 유기 산은 citric acid와 malic acid로 분석되었고 유기산의 종류도 쌀 품종과 관여 균종에 따라 다양하였다. 쌀누룩의 유기산 중 citric acid가 총 유기산의 95% 이상으로 주요 유기산으로 분석되었는데, 이는 쌀누룩의 총 유기산 중 citric acid가 97% 이상이나 함유되어 있었다는 Yu(18) 등의 연구 결과와 도 유사하였다.
균주별 및 쌀 품종별로 제조한 누룩의 유리 아미노산 분석 결과를 Table 5에 나타내었다. 추청미로 만든 A. luchuensis 34-1 누룩은 arginine, lysine, glutamic acid, leucine, tyrosine, isoleucine, alanine 등 27종의 유리 아미노 산이 검출되었고 총 아미노산의 함량은 9,983.63 μg/mL이 었다. Lich. ramosa CN042 누룩은 alanine, glutamic acid, arginine, leucine, valine, lysine 등 25종의 유리 아미노산이 검출되었고, 총 아미노산의 함량은 4,609.96 μg/mL이었다. 한아름으로 만든A. luchuensis 34-1 누룩은 arginine, lysine, glutamic acid, leucine, tyrosine, isoleucine, aspartic acid 등 28종의 유리 아미노산이 검출되었고, 총 아미노산의 함량 은 11,819.56 μg/mL 이었다. Lich. ramosa CN042 누룩은 proline, alanine, valine, leucine, glutamic acid, lysine 등 26종 의 유리 아미노산이 검출되었고, 총 아미노산의 함량은 7,957.56 μg/mL이었다. 균주별로 제조한 쌀누룩의 유리 아 미노산을 분석한 결과에서A. luchuensis 34-1로 제조한 누 룩의 총 아미노산 함량은 Lich. ramosa CN042보다 약 2배 정도 높은 것으로 보아, A. luchuensis 34-1은 Lich. ramosa CN042보다 분해력이 강해 높은 수치를 나타내는 것을 볼 수 있었다.
쌀누룩의 주요 아미노산은 약한 쓴맛을 내는 arginine, lysine, tyrosine, valine, 감칠맛을 내는 glutamic acid, 쓴맛을 내는 leucine, isoleucine, 단맛을 내는 alanine, 쓴맛과 단맛을 내는 proline으로 같은 쌀 품종과 균주에 따른 차이보다는 다른 품종과 균주에 따른 차이를 보이는 것으로 보아, 탁주 를 제조했을 때 이들의 주질 특성에 따라 독특한 향과 깔끔 한 맛을 제공할 것으로 여겨진다.
탁주의 pH는 발효과정에서 생성되는 유기산의 종류와 농도 등에 영향을 받으므로 발효 진행상황을 예측할 수 있는 중요한 지표이다(19). 본 연구에서 제조한 탁주 술덧의 pH는 3.1에서 3.7로 상승하는 경향으로 나타났으며 쌀 품종 및 누룩 배합비율에 따른 차이는 크지 않았다(Fig. 1). 발효 기간 중의 산도 변화는 쌀 품종 및 누룩 배합비율에 따라 변화하는 것으로 나타났다(Fig. 2). 쌀 품종에 상관없이 배 합비율에 따라 1:0과 1:3은 상승하는 반면에, 0:1과 1:1은 상승하다가 감소하는 경향을 보였다. 탁주 산도는 술의 풍 미와 보존성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(20). 본 연구에서 제조한 탁주의 산도는 품질인증 기준인 0.5% 이 하에 부합하여 산패의 위험성이 없는 것으로 보이며, 국내 시판 막걸리의 총산 함량을 측정한 Park(21) 등의 연구 결과 와 유사하였다. 탁주 술덧의 아미노산도 변화는 상승하는 경향이었고, 쌀 품종 따라 큰 차이는 보이지 않았지만(Fig. 3), 누룩 배합비율에 따라 차이는 있으며, 그 중 1:0으로 배합한 탁주 술덧의 아미노산도가 2.07, 2.31로 가장 높게 나타났다. 특히, 발효 6일째, 모든 구간에서 탁주 술덧의 아미노산도가 3.5 이하였기 때문에 주질에서 느끼한 맛은 없는 것으로 여겨진다.
알코올 함량은 술의 보존성이나 향미에 영향을 주는 성 분으로 술덧의 알코올 함량은 다소 높아야 한다고 보고되고 있다(22). 탁주 술덧의 알코올 변화는 모든 구간에서 상승하 였으며 쌀 품종 및 누룩 배합비율에 따라 큰 차이는 보이지 않았지만, 발효기간에 따른 알코올 생성율은 발효 6일째는 16%로 가장 높게 나타났다(Fig. 4). 품종에 따른 알코올 함량은 추청미(15.8~16%)보다 한아름(16.1~16.6%) 누룩 으로 빚은 탁주에서 전체적으로 약간 더 높은 것은 누룩 종류를 달리하여 담금한 술덧의 알코올 함량 결과와 유사하 였다(23).
쌀 품종 및 누룩 배합비율에 따라 제조된 8 종류 쌀누룩으 로 빚은 탁주 술덧의 유기산을 분석하였다(Table 6). 쌀 품종 에 따라 사용한 발효제를 보면, 1:0 비율의 추청미 누룩은 citric acid, succinic acid 및 lactic acid가, 0:1 비율의 누룩은 malic acid, succinic acid 및 lactic acid가 주요 유기산이며 전체 7종류 이상의 유기산이 검출되었다. 1:1 및 1:3 비율로 혼합한 쌀누룩은 citric acid, succinic acid, lactic acid 및 malic acid가 주요 유기산으로 검출되었다. 1:0 비율의 한아 름 누룩은 citric acid, succinic acid 및 lactic acid가, 0:1 비율 의 누룩은 succinic acid, lactic acid 및 acetic acid가 주요 유기산이며 전체 8종류의 유기산이 검출되었다. 1:1 및 1:3 으로 혼합한 누룩은 citric acid, succinic acid, lactic acid 및 malic acid가 주요 유기산으로 검출되었다. A. luchuensis 34-1로 제조한 탁주의 주요 유기산은 citric acid로 100 mg% 이상 검출되었고, 술덧의 총 유기산의 함량은 200~300 mg%로 쌀 품종 및 배합비율에 따라 유기산 생산량의 차이 가 있는 것으로 나타났다. 탁주의 유기산은 술의 맛과 향 및 산성도를 조정하는 역할을 한다(24). 본 연구 결과는 탁주 제조 시 생성되는 유기산이 대부분 lactic acid, acetic acid, succinic acid, citric acid라는 Choi(25) 등의 연구와 유사한 결과를 보였다.
속양주모법으로 제조한 탁주의 유리 아미노산 분석 결과 를 Table 7에 나타내었다. 추청미 술덧의 경우, 1:0 배합비율 은 arginine, hydroxylysine, citrulline, proline, glycine, glutamic acid, lysine, leucine, tyrosine, 0:1 배합비율은 citrulline, arginine, proline, glutamic acid, glycine, tyrosine, valine, leucine이 검출되었다. 1:1 배합비율은 hydroxylysine, citrulline, arginine, proline, glycine, glutamic acid, leucine, valine, tyrosine, 1:3 배합비율은 citulline, proline, glycine, hydroxylysine, arginine, leucine, lysine, tyrosine이 검출되었 다. 추청미 술덧의 주요 유리 아미노산은 쓴맛(arginine), 이뇨작용을 돕는 citrulline, hydroxylysine 등이었고, 각각의 양조용 곰팡이와 추청미 그리고 이들의 배합에 따른 전체 유리 아미노산 조성들도 각각 달라 주질의 맛 다양성을 유도할 수 있었다.
한아름 술덧의 경우, 1:0 배합비율은 arginine, citrulline, glycine, proline, glutamic acid, lysine, leucine, tyrosine, valine, phenylalanine, isoleucine, aspartic acid이, 0:1 배합비 율은 citulline, arginine, proline, glutamic acid, glycine, hydroxylysine, leucine, lysine, tyrosine, valine, phenylalanine 이 주요 유리 아미노산으로 검출되었다. 1:1 및 1:3 배합 비율에 따른 차이는 citrulline, hydroxylysine, arginine, glycine, proline, glutamic acid, lysine, leucine, tyrosine, valine, ornithine, aspartic acid가 주요 유리 아미노산으로 검출되었고, 두 균주의 1:1 배합과 1:3 배합 비율에 상관없 이 주요 유리 아미노산 조성은 거의 유사하였다. 한아름 술덧의주요유리아미노산은arginine, citrulline, hydroxylysine 로 추청미의 주요 아미노산과 같은 결과로 함량의 차이는 크지 않은 것으로 나타났으나, 총 아미노산의 함량은 쌀 품종에 따라 추청미를 사용한 경우, 배합비율에 따라 1:0 비율은 3,942.01 μg/mL, 0:1은 2,368.69 μg/mL, 1:1은 3,771.27 μg/mL, 1:3은 3,663.43 μg/mL이었고, 한아름만 사 용하였을 때, 1:0 비율은 4,197.5 μg/mL, 0:1은 2,804.2 μg/mL, 1:1은 4,439.87 μg/mL, 3,962.73 μg/mL이었고, 추청 미보다 한아름을 사용하였을 때 모든 배합 비율에서 유리 아미노산이 높게 검출되었다. 또한, 누룩 배합 비율별로 살펴보면, 누룩 종류에 따라 주요 아미노산이 다르게 검출 되었다. 이 결과는 탁주 제조 시 사용하는 발효제 종류에 따라 유리 아미노산의 조성이 크게 달라지며, 탁주에는 신 맛, 감칠맛, 단맛 및 쓴맛을 나타내는 유리 아미노산들이 균형 있게 함유되어 있어야 한다는 So(26) 등이 보고한 내용 과 유사하였다.
서로 다른 배합비율로 제조한 쌀누룩으로 빚은 탁주의 관능평가 결과를 Table 8에 나타내었다. 탁주의 특성상, 관능평가에서 전문 패널 이라도 기호성의 차이는 있기 때문 에 통계 결과에서 유의적인 차이는 없지만 동일 그룹 내에 서 비교하여 결과를 분석하였을 때 색, 향, 맛 및 전반적인 기호도는 A. luchuensis 34-1 : Lich. ramosa CN042을 1:1 비율로 제조한 탁주가, 후미는 0:1으로 제조한 것이 우수한 것으로 나타난 반면에 1:3로 제조한 탁주는 가장 낮은 평점 을 받아 대조를 이루었다. A. luchuensis 34-1 누룩의 함량이 높을수록 높은 기호도를 보였고, 쌀 품종은 추청미보다 한 아름으로 빚은 탁주의 주질과 전체적인 기호도에서 우수한 것으로 나타났다.
요 약
유용 양조용 효모를 선정하기 위해, 효모의 알코올 생성 능을 조사한 결과, Y268 효모가 알코올 생성능이 가장 높았 으며 그 중, 0.3% 접종한 효모를 최종 선정하여 사용하였다. 2종류의 양조용 곰팡이(A. luchuensis 34-1, Lich. ramose CN042)와 2종류의 쌀 품종(추청미, 한아름)으로 제조한 4 종류 쌀누룩의 특성을 분석한 결과, 쌀 품종에 관계없이 A. luchuensis 34-1 균주의 이화학적 특성이 우수하였고, 균주별 및 쌀 품종별로 제조된 4종류 누룩의 유기산과 유리 아미노산을 분석한 결과에서 주요 유기산은 citric acid와 malic acid로 분석되었다. 유리 아미노산은 각각 25~28개로 구성되어 있으며, 균주별과 쌀 품종별에 따라 차이를 보였 다. 균주별로 제조한 쌀누룩의 배합비율을 달리하여 4가지 조합(A. luchuensis 34-1: Lich. ramose CN042=1:0, 0:1, 1:1, 1:3)과 2종류 쌀 품종으로 빚은 탁주의 발효기간에 따른 특성을 분석한 결과, 누룩의 배합비율과 쌀 품종에 따라 이화학적 특성 차이를 보였고, 알코올 함량은 발효 6일째 16%로 가장 높았다. 제조한 탁주의 유기산과 유리 아미노 산 분석 결과, 전체 7종류 이상의 유기산이 검출되었으며, 주요 유리 아미노산은 arginine, citrulline이었고, 누룩의 배 합비율과 쌀 품종에 따라 차이가 있었다. 탁주의 관능특성 을 비교한 결과, 전반적인 기호도는A. luchuensis 34-1 누룩 의 함량이 높을수록 높은 기호도를 보였고, 누룩 배합비율 별로 비교했을 때는 쌀 품종에 관계없이 1:1 비율로 제조한 탁주가, 쌀 품종별로 비교했을 때는 한아름으로 제조한 탁 주의 선호도가 더 우수한 것으로 나타났다.
