커피 볶음 정도에 따른 생화학적 성분 및 생리활성의 변화

본 연구에서 사용한 커피는 국내 수입상에서 4종의 커피 원두(CS, Colombia supremo; EY, Ethiopia yirgacheffee G2; IM, Indonesia mandheling G1; IMM, India monsooned malabar AA)를 구입하였다. 커피 원두는 열풍로스터 (Genecafe CBR-101A, Genesis Co., Korea)를 사용하여 20 0°C와 250°C에서 각각 10, 15, 20분 로스팅하였다.

커피 생두 또는 로스팅한 커피는 분쇄하였으며 각각의 커피분말 200 mg에 90°C의 증류수를 2 mL을 가하여 60°C water bath에서 2시간 환류시킨 후 추출하였다. 상등액을 0.45 μm membrane filter로 여과하여 Bradbury와 Weers의 방법(16)에 따라 HPLC로서 동시분석하였다. Analytical column은 Waters μBondapak™ C₁₈(3.9×300 mm, 125Å, Waters, Milford, MA, USA)를 사용하였고 column 온도는 40°C로 하였다. Elution solvent는 10 mM HCl : Methanol=90 : 10으로 분석하였다. 유속은 0.5 mL/min, 시료 주입량은 10 μL, UV 검출기의 파장은 275 nm(caffeine)와 325 nm(5-caffeoylquinic acid)이었다. 표준용액은 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.5625 ppm으로 만들어 검량곡선을 작성 한 다음 시료에 대하여 각각의 함량을 계산하였다.

커피 추출물 총 페놀 함량은 Folin-Denis법(17)에 따라 실험하였다. 커피 분말 200 mg에 methanol 2 mL을 가한 후 60°C water bath에서 6시간 방치하고 원심분리(5,000 rpm, 10 min) 후 0.45 μm membrane filter로 여과하여 시료로 사용하였다. 시료 0.5 mL에 25% Na₂CO₃ 용액 0.5 mL을 첨가하여 3분간 정치시킨 후 2 N Folin-Ciocalteu’s phenol 시약 0.25 mL를 첨가하여 혼합한 후 30°C incubator에서 1시간 동안 발색시킨 후 원심분리(5,000 rpm, 10 min) 한 뒤 microplate reader (EL800, BioTek, Winooski, PA, USA)를 이용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. Total phenolics 함량은 gallic acid를 이용하여 작성한 표준곡선에 의해 산출 된 계산식을 사용하여 mg/g으로 표시하였다.

Pyrazine류 분석은 Caprioli 등의 방법(18)을 변형하여 사 용하였다. 생두와 로스팅 온도와 시간이 다른 각각의 커피 원두 분말 15 g을 에스프레소 머신(Grand Doge, BFC Co., Italy)으로 추출하여 5 mL씩 headspace용 vial에 담고 마개로 완전 밀봉하였다. 커피 추출물이 담긴 vial을 headspace SPME(solid phase micro extraction)법으로 60°C heating block에서 가열하여 커피 추출액에서 휘발되는 향기성분을 SPME fiber에 30분간 흡착시킨 후 GC(HP 7890A, Agilent technologies, Palo Alto, CA, USA), MSD(HP 5975C, Agilent technologies)로 분석하였다. SPME fiber는 polydimethylsiloxane/ divinylbenzene(PDMS/DBV) fiber(Supelco Inc., Bellefonte, PA, USA)를 사용하였고 분석 column은 HP-5MS(0.25 μm×0.25 mm×30 m, Agilent technologies)를 사용하였다.

DPPH free radical scavenging 활성 측정은 Heo 등의 방법 (19)을 변형하여 실험하였다. 96 well plate에 농도별(1000, 500, 100, 10, 1 및 0.1 μg/mL)로 희석한 커피 추출물 200 μL와 사용 직전에 만든 0.2 mM DPPH를 100 μL 넣고 혼합하 여 실온에서 30분 동안 반응시킨 후, microplate reader (EL800, BioTek, Winooski, PA, USA)를 사용하여 517 nm에 서 흡광도를 측정하였다. 각 시료 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성은 실험구와 음성대조구의 흡광도를 구하여 백분 율(%)로 표시 하였다. 양성대조군으로 BHT와 α-tocopherol 의 소거활성과 비교하였다.

ABTS radical을 이용한 항산화력 측정은 ABTS cation decolorization assay 방법(20)을 수정하여 실시하였다. 7 mM ABTS 용액과 2.45 mM potassium persulfate을 최종농 도로 혼합하여 실온인 암소에서 24시간 방치하여 ABTS radical(ABTS⁺)을 만들고, ABTS radical은 732 nm에서 흡광 도 값이 0.7±0.02가 되도록 PBS(phosphate buffer saline, pH 7.4) buffer로 희석하여 ABTS 용액으로 사용하였다. 96 well plate에 ABTS 용액 200 μL와 농도별로 희석한 시료 100 μL를 섞고 1분 후 732 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료 추출물의 ABTS 라디칼 소거 활성은 실험구와 음성대 조구의 흡광도를 구하여 백분율(%)로 표시 하였다. 양성대 조군으로 BHT와 α-tocopherol의 소거활성과 비교하였다.

FRAP에 의한 항산화력의 측정은 Benzie와 Strain의 방법 (21)에 따라 측정하였다. Reaction solution은 300 mM acetate buffer(pH 3.6), 40 mM HCl에 녹인 10 mM TPTZ 및 20 mM iron(III) chloride를 10:1:1로 실험직전에 만들어 사용하였다. 96 well plate에 반응액 200 μL와 농도별로 희석 된 시료 50 μL를 혼합한 후 37°C에서 15분간 반응시킨 후, 590 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 대조군으로 trolox의 환원력과 비교하였다.

α-Glucosidase 저해활성은 nitrophenol 분석법(22)을 응용 하여 측정하였다. 0.2 unit/mL의 α-glucosidase 효소액 50 μL, 12 mM p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside 100 μL, sample 50 μL 및 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 6.8) 50 μL와 혼합하여 37°C에서 20분간 pre-incubation한 후 0.1 M NaOH 100 μL를 가하여 반응을 정지시키고 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 활성 비교를 위해 제2형 당뇨치 료제에 쓰이는 acarbose를 사용하였으며, 실험구와 음성대 조구의 흡광도를 구하여 백분율(%)로 표시하였다.

α-Amylase 저해활성은 환원당 분석법(23)을 응용하여 효 소원으로 사람의 타액 amylase를 사용하고 기질로서 0.5% starch를 이용하여 효소활성을 측정하였다. 효소액 50 μL, sample 50 μL, 0.5% starch 100 μL, 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 6.8) 50 μL와 혼합하여 37°C에서 20분간 preincubation한 후 DNS 발색시약(48 mM 3,5-dinitrosalicylic acid and 30 % sodium potassium tartarate in 0.5 M NaOH) 250 μL를 넣고 100°C에서 10분간 끓여 발색시킨 후 충분히 냉각시킨다. 이 반응액에 1.5 mL의 물을 가하고 잘 교반한 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 acarbose를 사용하였으며, 실험구와 음성대조구의 흡광도를 구하여 백 분율(%)로 표시하였다.

분석결과의 통계처리는 SAS(Statistical Analysis System, 9.0, SAS Institute, Cary, NC, USA) software를 이용하였으 며, 통계적 유의성 검정을 위해 분산분석(ANOVA)과 Duncan's multiple range test를 실시하였다.

품종별 커피의 로스팅 정도에 따른 caffeine 함량은 크게 변화하지는 않았다. Table 1에 나타낸 바와 같이 caffeine 함량은 로스팅이 강해질수록 약간씩 감소하는 경향이었다. 즉 생두의 caffeine 함량에 비하여 가장 강한 로스팅 조건 (250°C, 20 min)에서 CS는 약 28%, EY는 10.1%, IM은 9.9% 및 IMM은 7.5%정도 줄어들었다. 이러한 결과는 Kim과 Park(12)이 매우 강한 로스팅 공정이 아닌 경우 카페인의 손실은 매우 적으며, 로스팅 정도에 따라 거의 변화를 보이 지 않는다는 보고와 일치하였다.

5-Caffeoylquinic acid는 quinic acid에 caffeic acid가 ester 결합된 성분으로 3개의 이성질체인 caffeoylquinic acids (CQA), dicaffeoylquinic acids(diCQA), feruoylquinic acids (FQA) 등을 가진 물질이며(24), 본 연구에서는 커피 로스팅 정도에 따른 5-caffeoylquinic acid를 분석하였으며 그 결과 를 Table 1에 나타내었다. 5-Caffeoylquinic acid는 로스팅 강도가 강해질수록 급격히 감소하는 경향을 보였으며, 생 두에 비하여 가장 강한 로스팅 조건(250°C, 20 min)에서 CS는 약 82.1%, EY는 86.2%, IM은 85.0% 및 IMM은 89.0% 감소하였다. Suh 등(9)의 연구에서도 본 연구결과와 유사한 경향으로 에티오피아 및 브라질산 원두를 강하게 로스팅하 였을 때 5-caffeoylquinic acid이 크게 감소하였다고 보고하 였다.

페놀성 화합물에 존재하는 phenolic hydroxyl(OH)기는 단백질 등과 결합하는 성질을 가지고 있으며, 항산화, 항암 및 항균 효과 등의 생리활성을 가지는 것으로 알려져 있다 (25-27). 각 품종별 커피의 로스팅 시간에 따른 추출물에 대한 총 페놀화합물의 함량은 Table 2에 나타내었다. 커피 의 품종 간에는 IM에서 121.71±4.35 mg/g으로 가장 많이 함유하고 있었으나. 로스팅이 강해질수록 크게 감소하였 다. 즉, 생두의 총 페놀 함량에 비하여 200°C에서는 손실이 7.2%이하로 적었으나, 250°C에서는 품종별로 26.6~42.1% 로 크게 감소하였다. Kim과 Han(5)은 로스팅이 진행되면서 총 페놀화합물 함량이 다소 감소한다고 보고하였다. Farah 와 Donangelo(28)도 로스팅 중에 총 페놀화합물이 다소 증 가하다가 최종적으로는 감소하는 경향을 나타내었다고 보 고하여 본 연구결과와 유사하였다.

Pyrazine은 식품의 볶음 과정에서 발생되는 향기성분 중 에 하나로서 구운 향, 고소한 향, 토스트 향, 초콜릿 향 등의 냄새를 내는 성분으로 커피의 좋은 향의 본질이라고 할 수 있다. 각 커피 품종별 로스팅 정도에 따라 추출한 에스프 레소의 향기성분 중 pyrazine 화합물의 생성을 Fig. 1에 나타 내었다. Pyrazine 화합물은 전체 향기성분의 함량에 대한 상대적 pyrazine 함량(RAP, relative amount of pyrazine, %) 으로 나타내었다. 4종의 커피에서 생성된 pyrazine 화합물 은 CS, EY, IM 및 IMM에서 각각 0.01~10.69%, 0.2~7.84%, 0.5~4.56% 및 1.12~14.77%로 IMM에서 가장 많이 생성되 었다. 이것은 CS, EY 및 IM은 아라비카 종인 것에 비해 IMM은 로부스타 종이 섞인 켄트종이며, 생두를 인위적으 로 숙성시켰기 때문에 풍부한 향이 나는 것으로 생각된다. 모든 품종에서 생두일 때에는 pyrazine 화합물이 거의 생성 되지 않았으나, 로스팅이 시작되면서 생성되기 시작하였 다. 결과적으로 200°C에서는 10분 보다 15분 로스팅 하였을 때 증가하였으나 20분 로스팅 했을 때에는 감소하기 시작 하였다. 250°C에서는 10분간 로스팅하였을 때가 가장 많이 생성되었으며 시간이 경과할수록 급격히 줄어들었다. 이는 pyrazine 화합물은 휘발성 방향족 화합물이기 때문에 로스 팅 온도가 높아지고 시간이 길어지면서 대부분이 휘산되어 감소한 것이라고 생각되었다. Ku 등(29)은 로스팅의 온도와 시간이 증가하면서 2-methylpyrazine, 2,3-dimethy- lpyrazine, 2,5-dimethylpyrazine, 2,3,5-trimethylpyrazine, 2,3,5,6-tetramethylpyrazine이 대체적으로 증가하다가 감소하는 경향을 나타낸다고 보고하여 본 연구와 유사한 결과를 나타내었으 며, Lee 등(2)은 210~230°C에서 210~250초 동안 로스팅 하 였을 때 로스팅이 강해질수록 pyrazine이 감소하였다고 보 고하여 본 연구 결과와 유사하였다.

Fig. 1. Pyrazine compounds in the espresso from each type of coffee bean according to the roasting conditions. RAP, relative amount of pyrazine against the total volatile compounds; CS, Colombia supremo; EY, Ethiopia yirgacheffee G2; IM, Indonesia mandheling G1; IMM, India monsooned malabar AA. The values represent the mean±SD (n=3).

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항산화물질은 인체 내에서 활성산소에 의하여 산화적 스트레스를 감소시켜 노화를 억제시키고 항암 등 생리활성 기능이 입증되면서 식품 자체보다 식품 속의 항산화 관련 물질에 대한 관심이 더 많이 집중되고 있다(30,31). 커피의 로스팅 조건에 따른 항산화능을 DPPH, ABTS 및 FRAP 방법으로 측정하였다(Table 3).

DPPH 라디칼 소거활성은 0.1 mg/mL 처리하였을 때 20 0°C에서 로스팅 하였을 경우 79.85±0.21~85.82±0.76%로 비교적 높게 나타났으며, 250°C에서는 75.43±0.00~83.37 ±0.21%로 활성이 약간 낮았으나 같은 농도의 BHT (83.86± 0.37%)와 α-tocopherol(83.50±0.0%)와 거의 유사하게 높은 활성을 나타내었다. Kim과 Han(5)은 0, 5, 8, 10분 로스팅한 커피의 추출물에서는 유의적 차이 없이 높은 항산화성을 나타내었고, 20분에서 free radical 소거 효과가 크게 감소하 였으며, 25분에서 가장 낮은 항산화성을 나타내었다고 보 고하여 본 연구에서의 결과와 유사하였다.

ABTS cation radical 소거활성도 200°C에서 로스팅 하였 을 경우 52.75±0.22~60.21±0.20%로 비교적 높게 나타났으 며, 250°C에서는 47.31±0.72~56.70±0.57%로 활성이 약간 낮았으나 같은 농도의 BHT(62.65±0.03)와 α-tocopherol (60.50±0.36%)의 75~90% 정도의 높은 활성을 나타내었다. Pérez 등(32)은 커피 생두에서의 활성이 프렌치 또는 이탈 리안 방법으로 로스팅 하였을 때 보다 높은 활성을 보였다 고 하였다. 이는 프렌치와 이탈리안 로스팅이 가장 강한 로스팅 방법이기 때문에 항산화성이 낮아진 것으로 판단되 었다.

FRAP assay에서 커피 추출물(CS, EY, IM 및 IMM)의 환원력은 각각 73.58±0.29~80.22±0.11, 73.32±0.38~80.74± 0.20, 73.93±0.16~79.60±0.16 및 72.023±0.29~78.77±0.26% 의 환원력을 나타내어 trolox의 환원력(82.35±0.09%)에 비 해 낮으나 비교적 높은 활성을 나타내었다. 커피의 로스팅 정도가 강해질수록 활성이 약간 감소하는 것은 커피 생두에 존재하는 폴리페놀 성분이 로스팅 과정에서 분해가 되었기 때문으로 여겨진다. Kim과 Park(12)은 로스팅 시간에 따라 갈색도와 항산화성이 정비례관계를 보이다가 14분이 지나 면 오히려 항산화성이 다소 감소한다는 보고를 보여 본 연구와 유사한 결과를 나타내었다.

α-Glucosidase는 소장의 융모막에 존재하는 소화 효소로 서 단당류로 가수분해하여 식후 혈당치의 급격한 상승을 일으킨다. 따라서 α-glucosidase 저해제는 제2형 당뇨의 치 료제 개발에 유용하다. α-Amylase 또한 당질을 분해하여 단당류로 전환시키는 효소로 이러한 효소의 활성 저해는 당질가수분해와 흡수과정을 지연시킴으로 식후 당 농도를 제한한다(33-35). 식후 소장에서 당 흡수를 지연시킴으로서 급격한 혈당상승을 막아주는 당뇨약에 acarbose 등이 있으 며, acarbose는 췌장과 타액선의 α-amylase와 장관의 α -glucosidase를 억제한다(36). 각 품종별 커피의 로스팅 조건 에 따른 커피 열수 추출물에 대한 α-glucosidase, α-amylase 저해 활성은 Table 4에 나타내었다.

α-Glucosidase 저해 활성은 acarbose가 0.2 mg/mL의 농도 에서 45.72±0.73%의 활성을 나타내었고 같은 농도에서 커 피 추출물(CS, EY, IM 및 IMM)의 활성은 각각 7.83± 3.05~43.60±1.97%, 9.29±4.88~44.50±1.43%, 6.85±1.27~ 40.97 ±1.15% 및 0.98±0.73~36.00±1.12%로 acarbose와 비교하였 을 때 활성이 다소 낮으나 생두와 200°C에서 로스팅 된 원두에서는 상당한 항당뇨활성을 보였으나 로스팅이 강해 질수록 급격히 활성이 저하되었다.

α-Amylase 저해 활성에서는 acarbose 0.2 mg/mL의 농도 에서 55.81±1.85%의 활성을 나타내었으며 같은 농도에서 커피 추출물(CS, EY, IM 및 IMM)의 활성은 각각 30.71 ±1.90~54.00±0.35%, 32.74±2.70~59.48±1.86%, 33.26 ±0.81~56.54±1.12% 및 27.81±0.22~49.89±0.68%로 이 또 한 생두와 200°C에서 로스팅 한 원두에서 우수한 활성을 나타내었으나 로스팅이 강해질수록 활성이 저하되었다. Anderson 등(37)은 녹차와 우롱차, 홍차에서 모두 차에 함유 된 카페인이 카테킨과 같은 폴리페놀 성분과 더해졌을 때 인슐린 활성이 강화되었다고 보고하였다. 이는 커피에서도 카페인이 클로로겐산 등의 폴리페놀 성분과 더해져 항당뇨 활성을 나타낼 수 있을 것으로 사료되었다.