해조류 추출물의 항산화 및 α-glucosidase 저해 활성

실험재료는 국내 연안에 자생하는 해조류 중 식용이 가 능한 감태(Ecklonia cava), 곰피(Ecklonia stolonifera), 대황 (Eisenia bicyclis), 매생이(Capsosiphon fulvescens), 모자반 (Sargassum fulvellum), 미역(Undaria pinnatifida), 지충이 (Sargassum thunbergii), 청각(Codium fragile), 톳(Hizikia fusiformis), 파래(Enteromorpha prolifera)를 사용하였다. 해 조류는 울릉도, 제주도 등 각각의 산지로부터 구매하여 흐 르는 물로 여러 번 세척하여 염분을 제거한 뒤 60°C에서 12시간 동안 열풍건조하였으며, 건조한 시료는 분쇄기 (IKA® A11 basic, IKA® Werke GmbH & Co., KG, Staufen, Germany)를 이용하여 40 mesh 이하로 분쇄한 후 추출물 제조에 사용하였다.

10종의 해조류 분말을 물과 에탄올을 용매로 하여 추출 물을 제조하였다. 열수 추출은 각각의 해조류 20 g에 증류수 1 L를 첨가하여 121°C에서 15분간 열수추출하였고, 에탄올 추출은 해조류 20 g에 에탄올 1 L를 첨가하여 하루 동안 200 rpm에서 교반하여 추출하였다. 열수추출물과 에탄올 추출물은 원심분리(Centrige 5810R, Effendorf, Hmburg, Germany) 후 여과하여 vacuum evaporator(WB2000, Heidolph, Schwabach, Germany)에서 농축하였고, 일정한 양을 각각의 추출용매에 녹여 항산화 및 α-glucosidase 저해 활성 측정에 사용하였다.

총 폴리페놀 함량 측정은 Folin-Denis 법(15)에 따라 시료 1 mL에 0.2 N Folin-Ciocalteu's phenol reagent(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 1 mL를 가하여 실온에서 3분간 반응시킨 후, 7.5% Na₂CO₃ 1 mL을 가한 후 암소에서 1시간 동안 방치한 후 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리 페놀 함량은 garlic acid를 표준물질로 한 표준곡선에 의하 여 산출하였다.

총 플라보노이드 함량은 Abdel-Hameed(16)의 방법에 따 라 시료 1 mL에 5% sodium nitrite 0.15 mL를 가한 후 25°C에 서 6분간 방치한 다음 10% aluminium chloride 0.3 mL를 가하여 25°C에서 5분간 방치하였다. 다음 1 N NaOH 1 mL 를 가하고 교반한 후 510 nm에서 흡광도를 측정하였으며, rutin hydrate(Sigma-Aldrich Co.)의 검량선에 의하여 함량을 산출하였다.

DPPH radical 소거능의 측정은 Blois의 방법(17)을 변형 하여 시료 0.4 mL에 0.4 mM DPPH(α,α-diphenyl-β -picrylhydrazyl, Sigma-Aldrich Co.) 에탄올 용액 0.8 mL을 진탕 혼합하고, 10분간 방치 후 분광광도계를 사용하여 525 nm에서 흡광도를 측정하여 계산식, DPPH radical scavenging ability(%)=100-[(OD of sample/OD of control)×100]에 의하 여 활성을 산출하였다.

ABTS[2,2´-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt, Sigma- Aldrich Co.] radical 소거능은 ABTS radical cation decolorization assay(18)를 이용하여 측 정하였다. 7.4 mM의 ABTS와 2.6 mM potassium persulfate 를 혼합하여 실온∙암소에서 24시간 동안 방치하여 radical 을 형성시킨 다음 실험 직전에 ABTS 용액을 732 nm에서 흡광도가0.700±0.030(mean±SD)이 되도록phosphate-buffered saline(pH 7.4)으로 희석하여 사용하였다. 추출물 50 μL에 ABTS 용액 950 μL를 첨가하여 암소에서 10분간 반응시킨 후 732 nm에서 흡광도를 측정하여 계산식, ABTS radical scavenging ability(%)=100-[(OD of sample/ OD of control)×100] 에 의하여 활성을 산출하였다.

Marklund와 Marklund(19)의 방법에 따라 각 추출물 200 μL에 pH 8.5로 조정한 tris-HCl buffer 용액 3 mL와 7.2 mM pyrogallol 200 μL를 가하고 25°C에서 10분간 반응시킨 후 1 N HCl 1 mL를 가하여 반응을 정지시키고 420 nm에서 흡광도를 측정하였으며 계산식, SOD-like activity(%)＝ 100-[(OD of sample/OD of control)×100]에 의하여 활성을 산출하였다.

Oyaizu(20)의 방법에 따라 시료 1 mL에 0.2 M phosphate buffer(pH 6.6) 2.5 mL와 1% potassium ferricyanide 용액 2.5 mL를 가한 후 50°C에서 30분간 반응시켰다. 다음 10% trichloroacetic acid(TCA) 용액 2.5 mL를 가한 후 1,650×g에 서 10분간 원심분리하였으며, 상징액 2.5 mL에 증류수 2.5 mL 와 0.1% FeCl₃ 용액 0.5 mL를 가한 후 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.

지방 산패 억제 효과는 Buege와 Aust(21)의 thiobarbituric acid reactive substances(TBARS) 방법을 변형하여 측정하였 다. 상온에서 추출물 0.1 mL, emulsion oil 0.5 mL, 증류수 0.3 mL와 Fe²⁺(산화촉진제) 0.1 mL를 섞은 후 37°C에서 1시 간 반응시켰다. 반응 혼합물을 잘 섞은 다음 2 mL TBA/TCA 시약을 가하고 다시 혼합 후 끓는 물에서 15분간 가열시켰 다. 가열 후 찬물에서 식힌 후 3,000 rpm에서 10분간 원심분 리 시킨 상등액을 531 nm에서 흡광도를 측정하였고, 공시 료는 시료 대신에 증류수를 가하여 같은 방법으로 측정하였 으며 계산식, TBARS(inhibition of lipid rancidity, %)=100-[(OD of sample/OD of control)×100]에 의하여 활성 을 산출하였다.

Kim 등(22)의 방법에 따라 추출물 0.05 mL, 0.2 unit/mL α-glucosidase 0.05 mL와 200 mM potassium phosphate buffer(pH 7.0) 0.05 mL를 잘혼합하여 37°C에서 10분간 전처 리하였다. 다음에 3 mM ρNPG(ρ-nitrophenyl α-Dglucopyranoside) 0.1 mL를 첨가하여 37°C에서 10분간 반응 시킨 후 0.1 M Na₂CO₃ 0.75 mL로 반응을 정지시켜 405 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 저해활성은 아래의 식에 의해 산출하였다.

α-glucosidase inhibition activity(%)＝[1-(C_Abs-S_Abs)/ (C_Abs-B_Abs)]×100

C_Abs, : 대조구 흡광도

S_Abs, : 시료 흡광도

B_Abs, : 시료 무첨가구의 흡광도

모든 실험은 3회 반복으로 행하였으며, 평균치간의 유의 성은 SPSS(Statistical Package for Social Sciences, 19.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) software를 이용, p<0.05수준 으로 Duncan's multiple range test에 의하여 검정하였다.

국내 자생하는 대표적 해조류의 추출용매를 달리한 추출 물의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 측정한 결과는 Table 1과 같다. 본 연구에 사용한 해조류의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량은 에탄올 추출물이 물 추출물보다 더 높은 경향을 나타내었다. 총 폴리페놀 함량은 대황(EB) 열수 추출물과 에탄올 추출물이 각각 98.75 150.81 mg/g으 로 가장 높았으며, 감태(EC), 지충이(ST), 곰피(ES), 매생이 (CF), 톳(HF), 파래(EP), 모자반(SF), 청각(CFr), 미역(UP) 순으로 나타났다. 이는 갈조류들이 녹조류 및 홍조류보다 폴리페놀 함량이 많다는 Ahn 등(23)의 연구 결과와 일치하 였다. 플라보노이드 함량도 대황 열수 추출물과 에탄올 추 출물이 각각 31.77, 77.02 mg/g으로 가장 높았으며, 총 폴리 페놀 함량과 유사한 경향을 나타내었다. 항산화 물질 중 폴리페놀 화합물들은 우수한 항산화 활성을 가지는 것으로 알려져 있으며, 이는 free radical을 안정화시키는 phenolic ring이 존재하기 때문이다. 또한 플라보노이드는 주로 anthocyanidins, flavonols, flavones, cathechins 및 flavanones 등으로 구성되어 있으며, 그 구조에 따라 특정 플라보노이 드는 항산화 및 항균성 등 다양한 생리활성을 갖고 있는 것으로 보고되고 있다(24).

해조류의 물 및 에탄올 추출물들(1 mg/mL)의 DPPH 및 ABTS radical 소거능 측정 결과는 Table 2와 같다. 해조류 추출물의 DPPH radical 소거능은 총 폴리페놀 및 플라보노 이드 함량이 높은 감태, 곰피, 대황, 지충이 추출물에서 비교 적 높은 활성을 나타내었으며, 대황 열수 추출물과 에탄올 추출물이 각각 63.36, 86.26%로 가장 높은 소거능을 나타내 었다. ABTS radical 소거능은 모든 해조류 추출물에서 활성 을 나타내었으며, 감태, 대황, 지충이 추출물은 열수와 에탄 올 추출물에서 모두 99% 이상의 높은 활성을 나타내었으 며, 곰피 열수와 에탄올 추출물은 각각 84.03, 99.58%를 나타내었다. 이상의 결과 해조류 추출물은 음이온 소거능 을 측정하는 DPPH radical 소거능보다 양이온 소거능을 측정하는 ABTS radical 소거능이 우수하였으며, 총 폴리페 놀과 플라보노이드 함량이 비교적 높은 감태, 곰피, 대황, 지충이 추출물에서 DPPH 및 ABTS radical 소거능 역시 우수하였다. 이러한 결과는 각 추출물이 함유하고 있는 총 페놀 화합물의 함량이 증가하면서 항산화 활성도 증가한다 는 Seo 등(25)의 보고와 유사하였다.

용매를 달리하여 추출한 해조류 추출물(1 mg/mL)의 SOD 유사활성 측정 결과는 Fig. 1과 같이 나타났다. 해조류 열수 추출물은 0.79~16.39%의 범위를 나타내었으며, 대황 열수 추출물이 16.39%로 가장 높았다. 반면에 해조류 에탄 올 추출물은 열수 추출물에 비해 높았으며, 7.05~21.34%의 범위를 나타내었고, 열수 추출물에서와 같이 대황 에탄올 추출물이 21.34%로 가장 높았다. SOD 효소는 식물이나 동물에 있어 활성산소를 제거하는 항산화 효소로 알려져 있으며, 이러한 SOD 유사활성을 갖는 항산화 물질로는 phenolic acids, flavonoids, anthocyanins 및 isoflavonoids와 같은 페놀성 화합물들이 알려져 있다(26,27).

Fig. 1. SOD-like activity of the extracts (1 mg/mL) from 10 different seaweeds. EC, Ecklonia cava ; ES, Ecklonia stolonifera ; EC, Eisenia bicyclis; CF, Capsosiphon fulvescens; SF, Sargassum fulvellum; UP, Undaria pinnatifida; ST, Sargassum thunbergii; CFr, Codium fragile; HF, Hizikia fusiformis; EP, Enteromorpha prolifera ; WE, water extract; EE, ethanol extract. Means with different superscripts in a bar indicate significant differences (p<0.05).

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용매를 달리하여 추출한 해조류 추출물(1 mg/mL)의 환 원력 측정 결과는 Fig. 2와 같이 나타났다. 추출 용매에 따른 환원력(OD₇₀₀)은 열수 추출물에서 0.010~0.876 범위를 나타내었으며, 대황 열수 추출물이 0.876으로 높은 환원력 을 나타내었고, 매생이, 모자반, 미역, 청각, 톳, 파래는 0.1 이하의 낮은 환원력을 나타내었다. 에탄올 추출물의 경우 0.060~1.710의 범위를 나타내었으며, 그 중 대황, 감태, 지충 이, 곰피 에탄올 추출물이 각각 1.710, 1.472, 0.702, 0.459로 다른 해조류에 비해 높았다. 이상의 결과 열수 추출물에 비해 에탄올 추출물에서 환원력이 높았으며, phenol성 물질 이 항산화능을 포함한 다양한 생리적 효능을 나타내며 이는 주로 환원력에 의한 효과라고 보고한 결과(28)와 같이 환원 력이 우수한 해조류인 대황은 다양한 항산화 및 생리활성 기능성 소재로 활용될 수 있을 것으로 판단된다.

Fig. 2. Reducing power of the extracts (1 mg/mL) from 10 different seaweeds. EC, Ecklonia cava ; ES, Ecklonia stolonifera ; EC, Eisenia bicyclis; CF, Capsosiphon fulvescens; SF, Sargassum fulvellum; UP, Undaria pinnatifida; ST, Sargassum thunbergii; CFr, Codium fragile; HF, Hizikia fusiformis; EP, Enteromorpha prolifera ; WE, water extract; EE, ethanol extract. Means with different superscripts in a bar indicate significant differences (p<0.05).

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생체 내에서 세포막에 존재하는 인지질 및 당지질과 혈 관에 존재하는 지질은 산소와 결합하여 과산화물을 만들고 이들의 연속반응에 의하여 alcohol류, aldehyde류, ketone류 등을 생성하여 생체 내에서 DNA를 손상시켜 암을 유발하 기도 하며, 세포의 노화와도 관련이 있는 것으로 알려져 있다(29). 추출 용매에 따른 해조류 추출물(1 mg/mL)의 지 방산패억제능 측정 결과는 Fig. 4와 같다. 해조류 열수 추출 물은 대황과 감태에서 각각 21.82, 8.21%의 지방산패억제 능을 나타내었으며, 다른 해조류의 경우 1 mg/mL의 농도에 서 지방산패억제능이 나타나지 않았다. 반면에 해조류 에 탄올 추출물은 모든 시료에서 27.60~83.95% 범위의 지방산 패억제능을 나타내었으며, 그 중 대황 에탄올 추출물이 83.95%로 가장 높았다. Fig. 3.

Fig. 3. TBARS of the extracts (1 mg/mL) from 10 different seaweeds. EC, Ecklonia cava; ES, Ecklonia stolonifera ; EC, Eisenia bicyclis; CF, Capsosiphon fulvescens; SF, Sargassum fulvellum; UP, Undaria pinnatifida; ST, Sargassum thunbergii; CFr, Codium fragile; HF, Hizikia fusiformis; EP, Enteromorpha prolifera; WE, water extract; EE, ethanol extract. Means with different superscripts in a bar indicate significant differences (p<0.05).

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Fig. 4. α-Glucosidase inhibition activity of the extracts (0.1 mg/mL) from 10 different seaweeds. EC, Ecklonia cava; ES, Ecklonia stolonifera ; EC, Eisenia bicyclis; CF, Capsosiphon fulvescens; SF, Sargassum fulvellum; UP, Undaria pinnatifida; ST, Sargassum thunbergii; CFr, Codium fragile; HF, Hizikia fusiformis; EP, Enteromorpha prolifera; WE, water extract; EE, ethanol extract. Means with different superscripts within a bar indicate significant differences (p<0.05).

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α-Glucosidase는 소장 상피세포의 brush-border membrane 에 존재하는 효소(30)로서 소장에서 음식물 중의 전분을 포도당과 같은 단당으로 분해하여 흡수시킨다. α-Glucosidase 저해제는 소장점막의 미세융모막에 존재하는 이당류의 분 해효소를 가역적으로 억제하여 탄수화물의 흡수를 지연시 키는 역할을 하며, 소장 전체에 포도당이 흡수되어 식후혈 당 상승을 완만하게 한다(31). 해조류 추출물의 α -glucosidase 저해 활성을 측정하여 향후 혈당상승 억제제로 활용될 수 있는 소재로서의 가능성을 검토하였다. 해조류 추출물(0.1 mg/mL)의 α-glucosidase 저해활성은 비교적 감 태, 곰피, 대황, 지충이 추출물에서 높게 나타내었으며, 열 수 추출물의 경우 각각 95.17, 48. 07, 97.75, 87.13%를 나타 내었으며, 에탄올 추출물의 경우 각각 98.04, 86.90, 97.81, 97.97%를 나타내었다. 항산화 활성의 결과와 같이 총 폴리 페놀 함량이 높은 해조류가 α-glucosidase 저해 활성이 뛰어 난 것으로 판단되며, 이는 vanillic acid, p-hydroxybenzaldehyde 과 같은 phenolic acid계 및 플라보노이드계 화합물이 항산 화 효과뿐만 아니라 높은 α-glucosidase 저해활성을 나타낸 다는 보고(32)와 일치하였다. 본 연구에서 국내 자생하는 해조류를 대상으로 항산화 및 α-glucosidase 저해 활성을 비교한 결과, 대황, 감태, 지충이 등의 갈조류에 속하는 해조 류가 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량이 많았고, 항산화 활성 및 α-glucosidase 저해 활성도 우수하였다. 따라서 생리 활성이 우수한 해조류를 원료로 사용하여 기능성 소재를 개발하고 이를 활용한 다양한 제품화 관련 추가 연구가 필요하다.