돼지 육골분 및 진주담치 단백질의 가수분해물 제조 및 칼슘 결합 물질의 분리

본 실험에서 사용된 돼지 육골분은 ㈜홍창엠앤티 (Jincheon, Korea)에서 제공받아 사용하였다. 진주담치는 대전 소재의 노은농수산물시장에서 구입하여 가식부만 분 리하여 실험에 사용하였다.

돼지 육골분의 단백질은 Garcia와 Phillips(9)의 방법을 변형하여 추출하였다. 먼저, 시료와 0.1 M NaCl을 1:5(w/v) 비율로 섞고 그 혼합액을 homogenizer(IKA, Ultra-Turrax T25, Staufan, Germany)를 이용해 10,000 rpm에서 30분 동 안 균질화 시켜준 후, sonicator(GE 750, Sonics & Materials, Newtown, CT, USA)를 이용해 15분간 sonication 하였다. 단백질의 수율을 높이기 위해 60°C에서 3시간 동안 교반한 후, 10,000×g에서 1시간 원심분리 하여 얻은 상등액을 동결 건조하였다.

진주담치는 탈지과정을 거친 후 단백질을 추출하였다 (10,11). 진주담치와 isopropanol을 1:4(w/v) 비율로 섞어 균 질화 시켜준 후 37°C에서 1시간 동안 정치시켜 상등액을 제거하는 과정을 두 번 반복하고 동결 건조하였다. 탈지된 진주담치 시료에서 단백질을 추출하기 위해 deionized water를 1:6(w/v) 비율로 섞고, 1 M NaOH를 이용하여 pH 12로 맞춰준 후 1시간 동안 교반시켜주었다. 10,000×g에서 20분간 원심분리 하여 얻은 상등액을 1 M HCl을 이용하여 pH 5.2가 되도록 조절한 후 10,000×g에서 20분간 원심분리 하여 얻은 침전물을 동결건조 하였다.

돼지 육골분 및 진주담치 단백질 시료를 10 mM sodium phosphate buffer(pH 7.0)에 각각 용해하여 2% 수용액으로 제조하여 가수분해의 기질로 사용하였다. 단백질 가수분해 효소로는 Novo Nordisk Co.(Bagsvaerd, Denmark)에서 구입 한 alcalase(from Bacillus licheniformis, activity 2.4 AU/g protein)를 이용하였다. 기질 대비 효소를 500:1(w/v)로 첨가 하여 55°C, pH 7 조건에서 12시간 동안 가수분해 하면서 매 2시간마다 시료를 채취하여 가수분해도 측정 실험에 사용하였다(12).

돼지 육골분 및 진주담치 단백질 가수분해도를 측정하기 위해 trinitrobenzenesulfonic acid(TNBS) method(13) 및 O-phthaldialdehyde(OPA) method(14)를 사용하였다. TNBS method는 available amino group concentration 측정에 이용 되는 방법으로, 펩타이드 함량 측정에도 이용하였다. 시료 에 0.1 M sodium borate buffer(pH 9.2)를 첨가하고 5 mM TNBS reagent와 혼합하여 30분 동안 반응시킨 후 반응을 정지시키기 위해 18 mM Na₂SO₄와 2 M NaH₂PO₄를 넣어주 었으며, 420 nm에서 흡광도를 측정하여 펩타이드 함량을 측정하였다. 또한 Nielsen 등(14)의 OPA method에 따라, 시료 400 μL에 OPA reagent 3 mL을 첨가하여 5초 동안 섞어준 뒤 2분간 반응시켜 340 nm에서 흡광도를 측정하였 다. 가수분해도는 아래의 식에 의해 구하였고, OD_total는 6 N HCl, 120°C에서 24시간 동안 가수분해 시킨 시료의 흡광도이다(15).

(OD_sample-OD_blank)/(OD_total-OD_blank)×100 %

돼지 육골분 및 진주담치 단백질 가수분해물은 Amicon 8200(Millipore Co., Billerica, MA, USA)를 이용하여 한외여 과 하였으며, Ultracel PL-3(Millipore Co.)를 통해 3 kDa이하 의 가수분해물을 얻어 동결 건조하였다. 돼지 육골분 단백 질 가수분해물은 10 mM Tris-HCl buffer(pH 8.0)에 용해하 여 1 mg/mL 용액을 제조한 후fast protein liquid chromatography (FPLC)(Amersham Pharmacia, Uppsala, Sweden)를 이용하여 anion exchange column(Mono Q, Amersham Pharmacia)를 통해 2 mL/min의 유속으로 분획하였다. 진주담치 단백질 가수분해물의 경우, Q-Sepharose(2.5 cm×10 cm, Amersham Pharmacia)를 이용하여 2 mL/min의 유속으로 분획하였으 며, loading한 시료의 농도는 2 mg/mL이었다. 두 가지 시료 모두 이동상 용매 A는 10 mM Tris-HCl buffer(pH 8.0)로 하였고, 용매 B는 10 mM Tris-HCl buffer(pH 8.0)에 0.5 M NaCl을 첨가하여 사용하였다. 분획한 시료들은 모두 214 nm에서 흡광도를 측정하였고, 분획 과정 중의 염을 제거하 기 위하여 100~500 Da size의 membrane(regenerated cellulose, Spectrum Laboratories, Inc., Rancho Domiguez, CA, USA)를 이용하여 dialysis한 후 동결건조 하여 칼슘 결합력을 측정하였다.

동결 건조된 가수분해물 분획을 10 mM phosphate buffer(pH 7.0)에 용해하여 충분히 교반시켜 준 후 2.5 mM calcium chloride를 첨가하여 1 hr 동안 실온에서 stirring 해주면서 반응시켰다. 반응이 끝난 후 3,500×g에서 20 min 동안 원심 분리하여 상등액을 얻었고, colorimetric method(16)에 의해 orthocresolphtahlein complexone reagent 를 이용하여 calcium 함량을 정량하였다.

본 실험의 통계적 분석을 위해 SAS(Statistical Analysis System program, 8.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) 프로그램을 이용하였으며, Duncan’s multiple range test 방 법을 통해 각 처리구간의 유의성(p<0.05)을 검증하였다.

생리활성 펩타이드를 얻는 방법으로 식품 단백질의 효소 적 가수분해 방법이 많이 이용되고 있다(17). 단백질의 가수 분해가 진행됨에 따라 다양한 분자량의 펩타이드가 생성되 면서 –OH, -COOH, NH₂ 등의 친수기가 노출되고, 이는 칼슘을 비롯한 미네랄의 결합을 용이하게 만들어 준다고 알려져 있다(18). 따라서 본 연구에서는 돼지 육골분 단백질 을 alcalase로 가수분해하여 calcium binding peptide를 분리 하고자 하였으며, 가수분해도를 확인하기 위해 시간에 따 른 펩타이드의 양을 TNBS method로 측정한 결과를 Fig. 1에 나타내었다. 돼지 육골분의 경우, available amino group 은 가수분해가 진행됨에 따라 증가하는 경향을 보였으며, 특히 초기 2시간 동안 4.47 mM에서 16.63 mM로 가장 급격 한 증가를 나타내었고, 증가폭은 점차 감소하여 12시간 후 에는 22.44 mM의 농도를 나타내었다. 또한 진주담치 단백 질도 비슷한 경향을 보였는데, 가수분해 시간이 지남에 따 라 TNBS assay 결과 초기 7.29 mM에서 2시간 후 16.80 mM로 급격한 증가를 보였고 점차 증가폭이 감소하여 12시 간 후에는 21.83 mM로 나타났다. 또한 OPA method에 의한 가수분해도 측정값 역시 초기의 약 21%에서 43%로 증가하 여, alcalase를 이용하여 tilapia(Oreochromis niloticus) 단백 질을 가수분해 한 결과와 유사하였다(19). 또한, 가수분해 시간이 지날수록 가수분해도가 증가하지만, 일정 시간 이 후로는 크게 증가하지 않아 기존의 연구와 비슷한 경향을 나타내었다(20).

Fig. 1. Effects of the hydrolysis time on the available amino group concentration and the degree of hydrolysis. (A), porcine meat and bone meal protein; (B), mussel protein.

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단백 분해 효소인 alcalase를 이용해 12시간 동안 가수분 해하여 얻은 돼지 육골분 및 진주담치 단백질의 가수분해물 을 Ca과 결합된 펩타이드 소재로 이용하기 위하여 3 kDa 이하로 한외여과를 하였는데, 펩타이드의 분자량과 아미노 산 조성은 칼슘 결합력과 밀접한 연관이 있다고 알려져 있다(21). Jung 등(22)은 1~5 kDa의 저분자량을 가진 펩타이 드가 체내 이용률과 흡수율이 높다고 보고한 바 있고, 기존 연구에서 얻어진 Ca binding peptide의 분자량 역시 1.4 kDa(23), 1.2 kDa(24), 1.6 kDa(25) 등으로 나타났다. 이러한 연구보고들을 참고로 하여 본 연구에서는 가수분해물의 분자량을 3 kDa 이하로 설정하였다. 펩타이드가 칼슘과 같은 2가 양이온과 효과적으로 결합하기 위해서는 음전하 를 갖는 곁사슬을 가지고 있어야 하므로(26), 한외여과 후 동결 건조된 돼지 육골분과 진주담치 단백질 가수분해물을 anion exchange chromatography에 의해 분리하였다. 돼지 육골분 가수분해물을 Mono Q column에 의해 분획한 결과, 2개의 major peak로 분리되었는데(Fig. 2A), MBM-F1과 MBM-F2의 peptide 양에 대한 Ca 결합된 정도를 측정한 결과, 각각 0.184와 0.840으로 MBM-F2의 분획이 칼슘에 대한 결합력이 더욱 높은 것으로 나타났다(Table 1).

Fig. 2. Elution profile of (A) porcine meat and bone meal protein, and (B) the mussel protein hydrolysates from the anion exchange chromatography. The absorbance was measured at 214 nm.

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진주담치 단백질 가수분해물은 Q-Sepharose ion exchange chromatography에 의해 분리하였으며, 그 결과 Mussel-F1, F2, F3의 3가지 major peak를 얻을 수 있었다(Fig. 2B). 각 분획에서의 염을 제거하기 위해 membrane을 이용하여 dialysis 과정을 거친 후, 3가지 분획에 대한 Ca 결합력 측정 결과, 각각 0.110. 0.097, 0.875로 나타났고, Mussel-F3에 대한 Ca 결합력이 가장 높은 것을 알 수 있었다(Table 1). 각 분획의 칼슘 결합력은 가수분해물의 분자량과 펩타이드 의 아미노산 구성에 따라 달라지며, 특히 미네랄과 같은 금속이온과 결합 할 수 있는 친수기 등이 중요한 요소가 된다고 보고된 바 있다(18). 따라서 본 연구에서 칼슘 결합 력이 높게 나타난 MBM-F2와 Mussel-F3의 경우, 타 분획에 비해 칼슘과 결합하는데 있어 긍정적인 영향을 미치는 아미 노산이 포함되어 있다고 판단된다.

식품 단백질의 효소적 가수분해를 통해 분리한 Ca-binding peptide로는 명태 등뼈로부터 얻은 Val-Leu-Ser-Gly-Gly- Thr-Thr-Met-Ala-Met-Tyr-Thr-Leu-Val(23), 클로렐라의 Asn- Ser-Gly-Cys(27), 돼지혈장단백질의 Val-Ser-Gly-Val- Glu- Asp-Val-Asn(23), 새우 가공 부산물의 Thr-Cys-His(28) 등이 있다. Jeon 등(27)은 칼슘 결합에 Ser, Gly, Cys 등이 중요한 역할을 한다고 보고한 바 있고, Choi 등(29)은 Glu와 Asp가 미네랄의 결합에 관여한다고 하였다. 또한 MBM과 mussel meat의 효소적 가수분해 결과 얻어지는 가수분해물의 경우 상기 아미노산들이 풍부하게 함유되어 있다고 판단된다 (30,31). 따라서 본 연구 결과, Ca 결합력이 높게 나타난 펩타이드 분획 속에는 Ca binding에 관여하는 Ser, Gly, Cys, Glu, Asp 등이 존재할 것 이라고 생각되며, 이에 대해서는 향후 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다. 또한 기존 무기염 형태의 칼슘 보충제보다 더욱 안정적이고 체내 흡수 율이 높은 생리활성 펩타이드에 대한 수요가 높아짐에 따 라, 본 연구 결과 얻어진 MBM-F2와 Mussel-F3는 칼슘 결합 소재로의 활용이 가능하다고 판단된다.