추출조건에 따른 블루베리 열수추출물의 항산화 활성 비교

본 실험에 사용된 블루베리는 래빗아이종(Vaccinium ashei)으로 제주시 조천읍 소재의 블루베리 농가에서 재배 한 것을 2.5 kg 구매하여 -70°C에서 냉동 보관하면서 추출시 료로 사용하였다. 대조 표본(No.2013/015)은 제주대학교 아 열대원예산업연구소 문정용 박사에 의해 확인되었고, 아열 대원예산업연구소 식물 표본실에 보관하였다. 또한 모든 시약들은 Sigma Chemical(St. Louis, MO, USA), Ameresco Inc.(Solon, Ohio, USA)와 Invitrogen Gibco(Grand Island, NY, USA)에서 구입하여 사용하였다.

추출물의 제조는 20 g fresh blueberry에 증류수 400 mL를 가하여 믹서기를 이용해 마쇄한 후 아래와 같이 5가지 조건 으로 열수추출을 하였다. 각각의 추출물은 whatman No.2 여과지를 이용하여 여과시킨 후, 여액을 rotary vacuum evaporator를 이용하여 30°C에서 감압 농축하였다. 냉동건 조기(PVTFD10R, Ilsin, Korea)를 사용하여 온도 -60~80°C 에서 48시간동안 동결 건조하여 분말상태로 만들어 냉동 보관하면서 분석용 시료로 사용하였다. 실험에 사용된 각 각의 블루베리 열수추출물은 autoclave(SX700, Tomy, Tokyo, Japan)를 이용하여 0.25 MPa, 121°C에서 20분간 가 압가열처리 한 후 추출(autoclave extraction, AE), 180°C에 예열된 전기오븐에서 20분간 방치하여 추출(oven extraction, OE), Gulcin 등(19)의 방법을 변형하여, 끓인 증류수에 15분 간 혼합 후 sonication하여 추출(hot water sonication extraction, HWSE), Timothy 등(20)의 방법을 변형하여 끓인 증류수에 0.5%(v/v) acetic acid를 첨가한 후 sonication하여 추출(hot water with 0.5%(v/v) acetic acid sonication extraction, HWASE), 끓인 증류수에 15분간 끓여 열탕추출 (boiling extraction, BE) 방법을 이용하여 추출하였다.

추출수율은 각각의 추출물을 동결 건조시켜서 건조중량 을 구한 다음 추출물 조제에 사용한 원료 물량에 대한 백분 율로 나타내었다. 총 폴리페놀 함량은 Cheung 등(21)의 방 법을 약간 변형하여 DW 1,375 μL에 125 μL의 시료를 넣은 후 0.5 mL Folin-Ciocalteu’s 시약을 넣고 3분 후에 1 mL의 Na₂CO₃를 가한 다음 실온에서 30분 동안 정치한 후 분광광 도계(Sunrise, Tecan, Salzburg, Austria)를 이용하여 700 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 함량은 gallic acid equivalents (mg GAE/g)로 나타내었다. 총 플라보노이드 함량은 Zhishen 등(22)의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료 40 μL 에 5% NaNO₂ 6μL를 첨가하여 5분간 반응시킨 후 10% AlCl₃ 12 μL를 혼합하여 6분간 반응시킨 다음 1 N NaOH 40 μL를 첨가한 후 분광광도계(Sunrise, Tecan)를 이용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 함량은 rutin equivalents (mg RE/g)로 나타내었다.

총 안토시아닌 함량은 pH differential method(23)에 따라 측정하였다. pH buffer로는 pH 1.0 buffer(0.2 M KCl+0.2 M HCl)와 pH 4.5 buffer(0.2 M potassium phosphate+0.1 M critic acid)를 사용하였다. 1,900 μL pH 1.0 buffer와 1,900 μL pH 4.5 buffer에 각각 100 μL 시료를 혼합한 후 15분간 정치한 후 분광광도계(UV1800, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 520 nm와 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 안토시아닌 함량은 아래와 같이 cyanidin-3-glucoside를 기 준으로 계산하였다.

A = (A_λ520-A_λ700)pH 1.0-(A_λ520-A_λ700)pH 4.5 Mw = molecular weight of cyanidin-3-glucoside = 449.2 g/mol DF = dilution factor ε = the molar absorptivity = 26,900 L·M^-1·cmv^-1 1 = cm

ABTS radical 소거능 측정은 기존에 보고된 방법(24)을 변형하여 수행하였으며, ABTS 용액은 7 mM 2,2’-azinobis( 3-ethylbensthiazoline-6-sulfonic acid, ABTS)와 2.45 mM K₂S₂O₈를 혼합해 16시간 동안 암소에 보관하여 준비하였으 며, OD 값이 0.700±0.005에 도달하게 DW로 희석하였다. 분광광도계(UV1800, Shimadzu)를 이용하여, 큐벳에 900 μL ABTS 용액과 100 μL 시료를 혼합하여 실온에서 2분간 반응시킨 후, 734 nm에서 흡광도를 측정했으며, α -tocopherol을 양성대조군으로 사용하였다.

Alkyl radical 소거능은 Hiramoto 등(25)의 방법에 따라 측정하였다. 20 μL DW, 40 mM2,2’-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride(AAPH), 40 mM alpha-(4-pyridyl-1-oxide)- N-tert-butylnitrone(4-POBN)과 농도별 시료 20 μL를 차례로 첨가하여 37°C 항온수조에서 30분간 반응시킨 다음 capillary tube로 옮겨 electron spin resonance(ESR) spectrometer (JES-FA200, JEOL, Tokyo, Japan)로 측정하였다. 측정조건 은 magnetic field 336.000 mT, power 7 mM, sweep time 30초, sweep width 10 mT, frequency 9.43GHz, modulation width 0.2 mT, amplitude 500, time constant 0.03초로 하여 측정하였다.

DPPH radical 소거능은 Nanjo 등(26)의 방법에 따라 측정 하였다. 에탄올에 용해시킨 60 μM DPPH 30 μL와 농도별로 준비한 시료 30 μL를 섞은 후 10초간 교반하여 2분 동안 실온에서 반응시킨 후에 capillary tube로 옮겨 ESR spectrometer(JES-FA200, JEOL, Tokyo, Japan)에서 측정하 였다. 측정조건은 magnetic field 336.000 mT, power 5 mM, sweep time 30초, sweep width 10 mT, frequency 9.43 GHz, modulation width 0.8 mT, amplitude 500, time constant 0.03 초로 하여 측정하였다. 양성대조군으로는 catechin을 사용 하였다.

Fe²⁺ ion chelating activity의 측정(27)은 250 μL의 시료에 5 μL의 2 mM FeCl2를 가한 후, 10 μL의 5 mM ferrozine을 넣어서 10분 동안 실온에서 반응시켰다. 반응물은 분광광 도계(Sunrise, Tecan)를 이용하여 562 nm에서 흡광도를 측 정하였으며, 양성대조군으로 ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)를 사용하였다.

블루베리 추출물의 SOD 유사활성은 SOD assay kit-WST (Dojindo, Kumamoto, Japan)를 이용하여 분석하였다. 시료 20 μL에 WST working solution 200 μL와 Enzyme working solution 20 μL을 가한 후, 37°C에서 20분간 반응시킨 다음 분광광도계(Sunrise, Tecan)를 이용하여 440 nm에서 흡광 도를 측정하였다. 양성대조군으로 rutin을 사용하였다.

본 실험에 사용된 human dermal fibroblast는 제주대학교 의학전문대학원 조문제 교수로부터 분양 받았다. Fibroblast 세포는 10% fetal bovine serum, 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin가 첨가된 Dulbecco’s modified eagle medium를 이용하여 37°C, 5% CO₂ incubator에서 배양하였 다. H₂O₂에 의한 산화스트레스 억제효과는 MTT assay를 이용하여 측정하였다(28). 세포를 96 well plate에 1×10⁴ cell/mL로 200 μL씩 분주하여 37°C, 5% CO₂ incubator에서 16시간 전 배양하였다. 추출물들은 각 농도별로 3시간 전 처리한 후 200 μM의 H₂O₂를 첨가하고 4시간동안 배양하였 다. 배양액을 제거한 후 MTT 용액(5 mg/mL, Ameresco Inc.) 을 4시간 동안 처리한 후 150 μL DMSO에 녹여 분광광도계 (Sunrise, Tecan)을 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하 였다.

모든 실험은 3회 반복으로 행하여 평균치와 표준편차로 나타내었고, 유의성 검증은 SPSS(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 ANOVA one way를 실시하였다.

추출방법에 따른 블루베리 열수추출물의 추출수율, 총 폴리페놀 함량, 총 플라보노이드 함량은 Table 1과 같다. 블루베리 20 g으로부터 autoclave를 이용한 추출(AE) 시 1.59 g, 오븐을 이용한 추출(OE) 시 1.67 g, 끓인 증류수와 혼합 후 sonication 추출(HWSE) 시 1.71 g, 끓인 증류수에 0.5%(v/v) acetic acid를 첨가한 후 sonication 추출(HWASE) 시 1.83 g, 15분 동안 열탕추출(BE) 시 1.70 g을 회수하였다. 이에 따른 각 추출물 회수율은 HWASE의 경우가 9.15%로 가장 높았으며, OE, HWSE, BE 시에는 각각 8.35, 8.55, 8.50%로 큰 차이가 없었으나, AE에서는 7.95%로 가장 낮은 수율을 보였다. 식물계에 널리 분포하는 2차 대사산물인 폴리페놀 화합물은 phenolic acid, cinnamic acid, flavonoid, anthocyanin, benzoic acid 등이 있으며 항산화 효능을 지닌 주요 성분들로 보고되고 있어(29), 각 추출물의 총 폴리페놀 함량 측정한 결과, AE에서 3.47 mg GAE/g으로 가장 높은 함량을 보여주었다. 그 다음으로는 BE에서 2.69 mg GAE/g 으로 두 번째로 높은 함량이 나타났고, HWSE와 OE에서는 각각 2.31 및 2.16 mg GAE/g의 함량이 나타났다. 추출수율 이 가장 높았던 HWASE이 1.76 mg RE/g으로 가장 낮은 폴리페놀 함량을 나타냈다. 총 플라보노이드 함량은 총 폴 리페놀 함량과 유사한 경향을 나타냈다. AE가 1.59 mg RE/g으로 가장 함량이 높았으며, BE는 1.32 mg RE/g, OE와 HWSE에서는 각각 0.89 및 0.84 mg RE/g으로 함량이 유사 했으며, HWASE는 0.63 mg RE/g으로 추출물 중에서 가장 낮은 함량을 나타냈다. 따라서 폴리페놀과 총 플라보노이 드 함량은 autoclave를 이용한 추출물인 AE에서 가장 높게 나타났다. 이는 상온 물 추출물의 폴리페놀 및 플라보노이 드 함량인 각각 5.76 및 2.97 mg/mL(30)보다는 낮지만 Janyawat 등(31)이 보고한 frozen blueberry의 물 추출물의 총 폴리페놀(2.95 mg GAE/g) 및 플라보노이드(0.29 mg catechin equivalent(CE)/g) 함량보다는 높은 수치이다.

안토시아닌은 적색의 색소로 블루베리를 포함한 여러 식물에 매우 광범위하게 분포되어 있다(32). Routray와 Orsat(33)에 의해 블루베리의 안토시아닌 함량은 품종이나 분석 방법에 따라 0.20~5.15 mg cyanidin-3-glucoside/g fresh weight 범위에서 다양한 함량을 나타낸다고 보고된 바 있 다. 추출방법에 따른 블루베리 열수추출물의 총 안토시아 닌 함량은 Fig. 1에 나타낸 바와 같다. 끓인 증류수에 혼합 후 sonication하여 추출(HWSE) 시에 추출물에서 fresh weight 1 g 당 6.45 mg으로 가장 높은 함량을 나타냈다. 그러나 acetic acid 첨가 후 sonication 추출(HWASE) 시에는 비록 가해준 온도와 시간은 HWSE시료와 동일하지만 HWSE보다 낮은 안토시아닌 함량(4.02 mg/g)을 나타냈다. 이는 첨가된 acetic acid가 안토시아닌의 구조변형을 유발한 것에 기인한 것으로 판단된다(34). Oven을 이용한 추출 (OE) 시에는 5.29 mg/g, 15분간 끓여준 추출(BE)에서는 4.18 mg/g, autoclave를 이용한 추출(AE)에서는 가장 낮은 0.96 mg/g의 함량을 나타냈다. 따라서 총 안토시아닌 함량 은 총 폴리페놀 및 플라보노이드 경향과는 전혀 다르게 나타났는데, 이는 추출 시에 가해 준 온도에 반비례하는 결과로, 열에 민감한 안토시아닌의 특성(35) 때문인 것으로 예상된다.

Fig. 1. The total anthocyanin content in hot water extracts. AE, autoclave extraction; OE, oven extraction; HWSE, hot water & sonication extraction; HWASE, hot water & 0.5% (v/v) acetic acid & sonication extraction; BE, boiling extraction. Values are mean±SD. Means with different letters above a bar are significantly different at p<0.01.

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ABTS assay는 단시간 내에 측정이 가능하고 친수성 및 소수성 물질의 항산화 활성 측정에 모두 적용할 수 있어 항산화 효능을 검증하는데 많이 사용되고 있다. ABTS가 peroxidase, H₂O₂와 반응하여 활성 양이온인 ABTS⁺이 생성 되고, 시료에 의해 ABTS⁺가 소거되면 라디칼 특유의 청록 색이 탈색되는데, 이때 탈색되는 정도를 라디칼 소거능으 로 나타나게 된다(24). 열수추출 조건에 따른 ABTS radical 소거능은 Fig. 2에 나타내었다. 추출물의 농도가 증가함에 따라 ABTS radical 소거활성이 증가하는 경향을 보였으며, 모든 농도 범위 안에서 autoclave를 이용한 추출(AE)이 유의 적 차이(p<0.05)를 보이며 가장 우수한 활성을 보였고, 15분 간 끓인 추출(BE)이 다음으로 높은 활성을 나타냈다. 1,000 μg/mL 농도에서 AE와 BE에서 각각 98.13±2.78%와 87.08±8.75%의 ABTS radical 소거능으로, positive control 인 α-tocopherol 68.41±5.97%보다 우수한 활성을 나타냈다. 다음으로 oven을 이용한 추출(OE), 끓인 증류수와 혼합 후 sonication한 추출(HWSE)에서는 74.84±4.03% 및 71.29± 4.82%로 유사한 소거능을 보였고, acetic acid가 함유된 추 출(HWASE)에서는 59.33±4.89%로 가장 낮은 소거활성을 나타냈다. 이와 같은 결과는 총 폴리페놀 및 플라보노이드 의 함량과 항산화 효능이 매우 깊은 상관관계를 지니고 있음을 나타내고 있다. 동일한 양의 블루베리에서 얻어지 는 추출조건별 활성을 비교하기 위해 ABTS radical 소거능 을 추출물 수율 대비로 계산하였을 경우에도, AE가 HWASE 에 비해 1.90배 더 우수한 활성을 나타냈다(Table 2).

Fig. 2. ABTS radical scavenging activity of hot water extracts. AE, autoclave extraction; OE, oven extraction; HWSE, hot water & sonication extraction; HWASE, hot water & 0.5% (v/v) acetic acid & sonication extraction; BE, boiling extraction. α-tocopherol (200 μM) was used as positive control. Values are mean±SD. Means with different letters among the same concentration are significantly different at p<0.05

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Alkyl radical은 hydrocarbon reaction에서 초기반응생성 물로 electron spin resonance(ESR)에 의해 쉽게 탐지될 수 있다. Alkyl radical은 자가산화과정에 관련되어 있는 radical 이기 때문에 alkly radical 소거능 또한 중요한 항산화 활성 이라 할 수 있다(36). 열수추출조건에 따른 alkyl radical 소 거능은 Fig. 3에 나타내었다. 500 μg/mL의 농도에서 autoclave 이용추출(AE)과 15분간 끓인 추출(BE)이 유의적 차이(p<0.05) 없이 각각 68.11±2.88% 및 67.34±7.46%의 우 수한 alkyl radical 소거능을 나타냈으나, 250 μg/mL의 농도 에서 AE가 BE보다 높은 활성을 나타냈다. 따라서 AE가 모든 농도 범위 안에서 가장 우수한 alkyl radical 소거능을 나타냈고 이는 ABTS radical 소거능과 일치하는 결과이다. 또한 500 μg/mL의 농도에서, oven을 이용한 추출(OE)과 끓인 증류수에 혼합 후 sonication한 추출(HWSE)이 각각 57.26±0.91% 및 57.00±3.93%로 유사한 활성을 나타냈으 며, 끓인 증류수에 acetic acid를 첨가한 후 sonication 추출 (HWASE) 시에는 33.75±1.92%로 가장 약한 라디칼 소거능 을 나타냈다. 이러한 결과는 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량과 ABTS radical 소거능 실험 경향과 일치한다. 또한 Alkyl radical 소거능을 수율 대비로 계산하였을 경우, AE가 HWASE에 비해 약 2.32배 더 우수한 항산화 활성을 나타냈 다(Table 2).

Fig. 3. Alkyl radical scavenging activity of hot water extracts. AE, autoclave extraction; OE, oven extraction; HWSE, hot water & sonication extraction; HWASE, hot water & 0.5% (v/v) acetic acid & sonication extraction; BE, boiling extraction; CAT, catechin. Catechin (800 μM) was used as positive control. Values are mean±SD. Means with different letters among the same concentration are significantly different at p<0.05.

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블루베리 열수추출물의 DPPH radical 소거능은 Fig. 4에 나타낸 바와 같이 시료의 농도가 증가함에 따라 DPPH radical 소거능이 증가하였다. 처리 농도 중 가장 고농도인 1000 μg/mL에서 최저 활성을 나타낸 acetic acid를 함유한 추출(HWASE)을 제외하고는 나머지 시료들 간의 유의적인 차이(p<0.05)는 없었다. 그러나 중간 농도인 500 μg/mL에서 는 끓인 증류수에 혼합 후 sonication한 추출(HWSE)과 autoclave를 이용한 추출(AE)은 각각 43.65±3.59% 및 40.33±1.13%의 소거능으로 다른 추출물에 유의적 차이를 보이며 높은 활성을 나타내어 HWSE, AE, 15분간 끓인 추 출(BE), oven 이용 추출(OE), HWASE 순으로 DPPH radical 소거활성이 나타났다. 이는 HWSE가 DPPH radical 소거활 성이 있는 안토시아닌(37)을 가장 많이 함유하고 있기 때문 이라고 판단된다. DPPH radical 소거능을 수율 대비로 계산 한 결과, HWASE 대비해서 HWSE가 1.58배 높게 나타났으 며, AE는 이보다 더 높은 1.72배로 나타났다(Table 2).

Fig. 4. DPPH radical scavenging activity of hot water extracts. AE, autoclave extraction; OE, oven extraction; HWSE, hot water & sonication extraction; HWASE, hot water & 0.5% (v/v) acetic acid & sonication extraction; BE, boiling extraction; CAT, catechin. Catechin (25 μM) was used as positive control. Values are mean±SD. Means with different letters among the same concentration are significantly different at p<0.05.

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Fe, Cu, Ni 등과 같은 금속은 지질산화과정에서 촉매로 작용한다. 특히 몇몇 식품에 함유되어 있는 hydroxy radical 과 superoxide radical 등의 생성을 촉진하는 Fe²⁺, Cu²⁺등에 대한 결합능이 우수할수록 높은 항산화 활성을 나타낸다 (38). 열수추출조건에 따른 Fe²⁺ ion chelating 효과는, 앞에 서 언급한 총 폴리페놀 함량, 총 플라보노이드 함량 및 다른 항산화 실험과는 달리 모든 시료에서 유의적 차이(p<0.05) 없이 우수한 Fe²⁺ ion chelating 효과를 확인하였다(Fig. 5). 특히, 100 μg/mL의 농도에서 positive control인 EDTA 81.05±12.88%의 소거능과 상응하거나 그보다 높은 활성을 나타내었다. 이는 금속 이온 chelating 효능과 radical 소거능 이 서로 다른 기작으로 작용하기 때문인(39) 것으로 판단된 다.

Fig. 5. Fe²⁺ ion chelating activity of hot water extracts. AE, autoclave extraction; OE, oven extraction; HWSE, hot water & sonication extraction; HWASE, hot water & 0.5% (v/v) acetic acid & sonication extraction; BE, boiling extraction. EDTA was used as positive control. Values are mean±SD. No significant difference.

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항산화 효소 중의 하나인 superoxide dismutase(SOD)는 체내에 존재하는 superoxide를 제거하는 효소로써 세포막, DNA, 단백질 등에 손상에 대한 방어 작용을 한다(40,41). SOD 유사활성물질은 효소는 아니지만 SOD와 유사한 역할 을 하여 superoxide로부터 생체를 보호한다고 알려져 있기 때문에(42), 블루베리 추출물들에 대해서도 SOD 유사활성 을 측정하였다(Fig. 6). 모든 농도에서 autoclave를 이용한 추출(AE)이 유의적 차이(p<0.01)를 보이며 가장 우수한 활 성을 나타냈으며, 이어서 BE, OE, HWSE 및 HWASE 순으 로 각각 71.46±3.24, 69.67±4.11, 65.28±5.56, 56.08±4.36% 의 SOD활성을 나타냈다. 이는 총 폴리페놀 및 플라보노이 드 함량과 ABTS, alkyl radical 소거능 실험 경향과 일치하는 결과였으며, AE가 체내에서 활성산소 제거 효과에 가장 효율적일 것으로 여겨진다. 수율대비 활성을 비교하였을 때, SOD assay에서도 AE의 SOD 유사활성이 HWASE에 비해 1.65배 높은 것으로 나타났다(Table 2).

Fig. 6. SOD activity of hot water extracts. AE, autoclave extraction; OE, oven extraction; HWSE, hot water & sonication extraction; HWASE, hot water & 0.5% (v/v) acetic acid & sonication extraction; BE, boiling extraction. Rutin (300 μM) was used as positive control. Values are mean±SD. Means with different letters among the same concentration are significantly different at p<0.01.

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H₂O₂로 유도된 산화스트레스에 대해 블루베리 추출물이 human fibroblast 세포의 생존율에 미치는 영향을 MTT assay로 측정하고 그 결과를 Fig. 7에 나타냈다. H₂O₂로 유도 된 산화스트레스를 가하기 전에 블루베리 열수추출물 자체 에 의한 세포독성을 테스트해 본 결과, 처리 농도 250 μg/mL 까지는 모든 추출물에서 세포독성이 나타나지 않았으며, 500 μg/mL 처리 시에 HWASE와 BE에서 세포생존율이 각 각 77.62±9.93%, 78.24±7.97%로 감소하였다. Fibroblast 세 포에 200 μM H₂O₂를 4시간 처리하여 산화스트레스를 유발 하였을 때, 비처리군보다 세포생존율이 47.41±2.77%로 감 소하였다. 하지만 세포에 H₂O₂를 처리하기 전에 블루베리 추출물을 전 처리함으로써 세포생존율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. Autoclave를 이용한 추출(AE)이 유의적 차이(p<0.01)를 보이며 60.26±3.17%로 가장 높은 생존율을 나타냈고, OE, HWSE, HWASE, BE는 각각 55.18±3.59%, 55.43±4.09%, 55.46±1.97%, 55.43±2.04%로 유사한 활성을 나타냈다. 산화스트레스에 대한 세포보호효과는 추출물 간 에 큰 차이를 보이지 않았지만, 세포보호효과를 수율 대비 로 계산하였을 때 HWASE이 비해 AE가 1.84배 더 높은 것으로 나타났다(Table 2). 이전 연구에서 블루베리의 phenolic 화합물이 산화 스트레스에 의한 세포보호효과를 유발하는 것으로 보고된 바 있다(43), 따라서 autoclave를 이용한 블루베리 추출물에 존재하는 폴리페놀 성분에 의해 H₂O₂ 산화 스트레스에 대한 fibroblast 세포보호효과가 나타 났을 것으로 사료된다.

Fig. 7. Protective effects of hot water extracts on H₂O₂-induced cytotoxicity. (A) Dermal fibroblast cells were treated for 3 h with indicated samples. Values are mean±SD. *Means indicated significant difference in comparing control at p<0.01. (B) Dermal fibroblast cells were pre-treated for 3 h with indicated samples and then incubated with 200 μM of H₂O₂ for 4 h. Values are mean±SD. *Means indicated significant difference in comparing H₂O₂ at p<0.01. C, control; AE, autoclave extraction; OE, oven extraction; HWSE, hot water & sonication extraction; HWASE, hot water & 0.5% (v/v) acetic acid & sonication extraction; BE, boiling extraction

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본 연구에서는 추출방법을 달리하여 블루베리 열수추출 물들간의 항산화 활성 차이를 비교하였다. Autoclave를 이 용한 가압가열추출(AE), 오븐을 이용한 추출(OE), 끓인 증 류수에 혼합 후 sonication한 추출(HWSE), 끓인 증류수에 산을 첨가한 후 sonication한 추출(HWASE) 및 15분간 끓여 추출(BE) 등의 방법으로 추출물을 제조하고, 총 폴리페놀, 플라보노이드 및 안토시아닌 함량을 확인하고 ABTS, alkyl 및 DPPH radical 소거능 실험과 Fe²⁺ ion chelating 활성을 확인하였다. 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 모두 AE에 서 각각 3.47±0.16 mg GAE/g 및 1.59±0.19 mg RE/g으로 가장 높은 값을 나타냈다. 한편 이와는 반대로 총 안토시아 닌 함량은 AE가 가장 낮은 함량을 나타냈으며, HWSE(5.29 mg/g) 에서 가장 높은 함량을 나타냈다. ABTS와 alkyl radical 소거능 측정 결과, AE가 가장 우수한 소거능을 나타 냈으며, DPPH radical 소거능 실험에서는 AE와 더불어 안 토시아닌 함량이 가장 높은 HWSE이 우수한 활성을 나타냈 다. Fe²⁺ ion chelating 활성 측정 실험에서는 모든 추출물이 유의적 차이 없이 높은 활성을 나타냈다. 또한 SOD activity 측정 실험에서 AE가 가장 우수한 활성을 나타냈으며, H₂O₂ 에 의해 유도된 세포독성 또한 AE가 가장 효과적으로 억제 시켰다. 이상의 결과를 토대로 추출 조건에 따른 항산화 활성 차이를 수율 대비로 비교하였을 때, 가장 낮은 활성을 나타냈던 HWASE에 대비하여 AE는 ABTS radical scavenging activity 1.90배, alkyl radical scavenging activity 2.32배, DPPH radical scavenging activity 1.72배, SOD assay 1.65배, H₂O₂에 의해 유도된 세포독성에 대한 보호효능 1.84 배의 우수한 항산화 활성을 나타냈다.