침향 추출물의 라디칼 및 췌장 지방분해 효소저해 활성 평가

본 실험에 시료로 사용한 침향(Aquilaria agallocha)은 2010년 2월에 대구시 소재 약업사에서 구입하여 잘게 세절 한 다음 사용하였으며, 표본시료는 대구대학교의 식품공학 과 식품분석실험실에 보관하고 있다. 또한 1,1-diphenyl- 2-picrylhydrazyl(DPPH), 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline- 6-sulphonic acid)(ABTS), Folin-Ciocalteu’s phenol 시약, porcine pancreatic lipase, (+)-catechin 등의 시약은 Sigma 사에서 구입하여 사용하였다. 추출용 유기용매류는 특급시 약을 사용하였고 흡광도 측정을 위한 spectrophotometer는 Tecan 사의 Infinite F200(Tecan Austria GmBH, Grödig, Austria)을 사용하였다.

건조된 침향 1.2 kg을 잘게 부순 후 80% methanol(MeOH) 8 L로 3일간 3회 반복 추출 하였다. 얻어진 용액을 여과한 후, 감압 농축하여 80% MeOH 추출물 185.3 g을 얻었다. 얻어진 침향 추출물을 물에 현탁하여 유기 용매의 극성차를 이용하여 methylene chloride(CH₂Cl₂), ethyl acetate(EtOAc), n-butanol(n-BuOH)로 순차적으로 3회 분획하여 추출하였 다. 각 분획물을 감압 농축하여 건조 시킨 후 CH₂Cl₂ 가용부 (55.9 g), EtOAc 가용부(91.7 g), n-BuOH 가용부(28.5 g), H₂O 가용부(3.4 g)를 각각 얻었으며 각 가용부를 대상으로 라디칼 소거능 및 지방분해효소 저해능을 평가하였다.

침향 80% MeOH 추출물 및 유기용매 가용부의 전자공여 능은 Blois 방법(30)을 변형하여 측정하였다. 각 시료용액에 120 μL에 0.45 mM의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 용액 60 μL를 넣고 교반 후 15분간 방치한 다음 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 양성대조군으로는 (+)-catechin 를 사용했으며 전자공여능은 시료용액의 첨가군과 무첨가 군의 흡광도 차이를 백분율로 나타내었다.

2,2’-Azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sul fonic acid(ABTS) radical 소거능은 Re(31)의 방법을 변형하여 다 음과 같이 측정하였다. 7 mM ABTS(in water)와 2.4 mM K₂O₈S₂ 를 동량을 혼합 후 실온, 암소에서 12시간 방치하여 라디칼의 생성을 유도한 후 734 nm에서 흡광도 값이 0.6~ 0.7 정도가 되도록 희석하여 사용하였다. 희석한 ABTS⁺ 라디칼 용액 100 μL와 생약 추출액 100 μL을 혼합하여 실온에서 7분간 반응시킨 후 734 nm에서 흡광도를 측정하 였다. 이때 대조물질로는 (+)-catechin를 사용하였으며 결과 는 시료를 처리하지 않은 군에 대한 %로 표시하였다.

Pancreatic lipase 저해활성 측정은 Kim 등이 행한 방법 (32)을 변형하여 실시하였다. Enzyme buffer(10 mM MOPS, 1 mM EDTA, pH 6.8)에 porcine pancreatic lipase를 0.5 g/200 mL의 농도로 4°C에서 4,000 rpm으로 원심 분리를 하여 상층액을 사용하여 169 uL Tis buffer(100 mM Tris-HCl, 5 mM CaCl₂, pH 7.0) 와 6 uL enzyme buffer를 혼합한다. 샘플은 distilled water로 용해하여 다양한 농도로 희석하여 사용하였다. Enzyme과 sample을 먼저 37°C에서 15분 동안 shaking incubation 시킨 후 기질로 10 mM p-nitrophenyl butyrate (p-NPB)를 첨가 하여 37°C에서 30분 동안 shaking incubation 시킨 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. Pancreatic lipase 저해활성은 시료용액의 첨가군과 무첨가 군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

총 페놀 화합물의 함량은 Folin-Denis 방법(33)에 따라 측정하였으며, 추출물 혹은 가용부 시료액 50 μL와 Folin-Denis 시액 50 μL을 넣고 3분 후, 0.7 M 탄산나트륨 용액 50 μL 를 넣고 잘 혼합하여 실온에서 60분 방치한 후, UV/VIS 분광광도계로 730 nm에서 흡광도를 측정하였 으며, 표준물질은 tannic acid를 이용하여 표준곡선을 작성 하여 양을 환산하였다.

항산화 물질의 가장 큰 특징적인 기작은 유리기와 반응 하는 것으로 유리기 소거 작용은 활성 라디칼에 전자를 공여하여 항산화 효과를 평가 하는 척도로 이용된다. DPPH 는 생체 내에 존재하는 라디칼은 아니지만 그 자체가 홀수 전자를 갖고 있는 수용성 물질로서 약 517 nm에서 강한 흡광도를 나타낸다. 항산화능이 있는 물질과 반응하게 되 면 전자를 내어 주면서 라디칼이 소멸되고 특유의 보라색이 없어지면서 안정한 형태로 돌아가면서 흡광도 값이 감소한 다(34). Fig. 2에서 나타낸 것처럼 침향 80% MeOH 추출물 및 각 유기용매 가용부에 대해서 라디칼 소거능을 평가한 결과, 침향 80% MeOH 추출물은 26.9±4.5 μg/mL의 비교적 강한 IC₅₀값을 나타내었으며, 유기용매 가용부에 대해 같은 방법으로 활성을 평가한 결과, CH₂Cl₂ 가용부에서 26.1±4.4 μg/mL, EtOAc 가용부에서 24.8±3.9 μg/mL의 IC₅₀값을 나타 내었다. 또한 n-BuOH 가용부(IC₅₀; 42.7±5.6 μg/mL), H₂O 가용부(IC₅₀; 186.8±7.1 μg/mL)의 순으로 라디칼 소거 활성 을 나타내었으며 이러한 결과를 양성 대조군인 (+)-catechin 의 IC₅₀값인 5.9±0.4 μg/mL의 라디칼 소거능과 비교 시 단일 물질이 아닌 MeOH 추출물 및 유기용매 분획임을 고려할 때 상대적으로 우수한 활성임을 시사하였다.Fig .1

Fig. 1. Liquid-liquid par tition of Aquilaria agallocha.

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Fig. 2. DPPH radical scavenging activity of the methanolic extract of A. agallocha and its CH₂Cl₂, EtOAc-, n-BuOH-, and H₂O-soluble por tions.

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ABTS⁺ 라디칼 소거활성은 Re(31)의 방법을 변형하여 ABTS의 양이온 라디칼의 흡광도가 항산화제에 의해 감소 되는 원리에 기초한 방법으로, potassium persulfate와 ABTS 의 산화에 의해 라디칼을 형성시킨 후 각각의 시료에 대한 자유라디칼 소거능을 측정함으로써 항산화 활성을 확인할 수 있다. 그 결과 Fig. 3에서 보는 것처럼 침향 80% MeOH 추출물은 14.7±0.7 μg/mL에서 IC₅₀ 값을 나나내었으며, 분 획물에 대한 라디칼 소거활성을 평가한 결과 CH₂Cl₂, EtOAc 및n-BuOH 가용부에서 각각 5.3±0.4 μg/mL, 5.5±0.4 μg/mL, 10.4±0.2 μg/mL의 IC₅₀ 값을 확인하였으며, 양성 대조군인 (+)-catechin의 IC₅₀값인 2.1±0.2 μg/mL과 비교시 에도 동등한 효능임을 확인하였다. 또한 Fig. 2에서의 DPPH 라디칼 소거활성 평가 결과를 고려할 때 침향의 80% MeOH 추출물과 CH₂Cl₂, EtOAc 가용부에 우수한 항산화 활성물질 의 존재가 시사되었으며, 이들 활성물질의 동정이 필요하 다고 사료된다.

Fig. 3. ABTS⁺ radical scavenging activity of the methanolic extract of A. agallocha and its CH₂Cl₂, EtOAc-, n-BuOH-, and H₂O-soluble por tions.

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최근 pancreatic lipase는 지방질 가수분해 효소로 지방의 소화 및 흡수에 중요한 역할을 하며 pancreatic lipase의 활성 을 억제하여 지방의 흡수를 막아 지방의 배설을 촉진하는 전략으로 많은 연구가 진행되어 지고 있다(15). 현재 시판되 고 있는 항비만 제제는 우수한 효능에 도 불구하고 우장장 애, 과민증, 담즙분비장애, 지용성비타민 흡수억제 등의 부 작용이 있는 것으로 알려져 있으며 최근에는 부작용이 없는 식품 및 천연물로부터 pancreatic lipase 저해제의 개발을 위한 연구가 진행되고 있다. 본 연구에서 항비만 소재의 개발을 위해 침향의 80% MeOH 추출물을 극성에 따라 CH₂Cl₂, EtOAc 및n-BuOH로 순차 분획하여 얻어진 각 가용 부에 대하여 pancreatic lipase를 이용한 실험을 수행하였다. 그 결과 침향의 80% MeOH 추출물의 CH₂Cl₂ 가용부에서 우수한 1.1±0.3 μg/mL의 우수한 활성을 나타내었으며, 다 음으로 EtOAc 가용부에서 73.8±4.4 μg/mL, n-BuOH 가용 부에서 116.1±9.1 μg/mL 순의 IC₅₀값을 확인하였다. 이상의 결과로부터 CH₂Cl₂ 가용부의 pancreatic lipase 저해활성은 positive control인 orlistat에 상당하는 항비만 활성으로 향후 활성물질 동정 및 항비만 활성메카니즘에 대한 연구가 필요 하다고 사료된다.Fig .4

Fig. 4. Inhibitory effects of the methanolic extract of A. agallocha and its CH₂Cl₂, EtOAc-, n-BuOH-, and H₂O-soluble por tions against pancreatic lipase.

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식물에서 항산화 활성은 주로 페닐프로파노이드, 플라보 노이드, 탄닌 등의 페놀성 화합물과과 라디칼 소거반응을 나타내며, 이러한 페놀성 화합물의 항산화활성은 자유라디 칼의 흡착과 중화 및 과산화수소의 분해 등에서 중요한 역할을 할 수 있다고 알려져 있다(35). 플라보노이드와 페놀 산은 페놀성 화합물중에 주요 타입의 화합물중 하나이며 그들의 항산화 활성은 일반적으로 하이드록실기의 개수, 결합위치 및 당과의 결합여부와 깊은 관계가 있음이 알려져 있으며, 전통약용식물로부터 분리된 tannin, quinone, coumarin, lignan, stilbene, flavonoid 등의 천연 페놀성 화합 물에 대하여 항산화 활성을 포함한 각종 생리활성과 구조와 의 상관관계가 체계적으로 증명되어졌다(36).

침향 추출물 및 극성별 유기용매 가용부에 함유되어 있 는 페놀성 화합물의 함량을 Table 1에 나타내었으며, CH₂Cl₂ 가용부의 가용부가 1 g당 217.2 mg의 가장 많은 페놀 화합물을 함유하는 것으로 나타났으며, EtOAc 가용부 에서 211.5 mg/g, n-BuOH 가용부는 113.7 mg/g 및 H₂O 가용부에서 55.8 mg/g의 순으로 페놀성 화합물의 함량이 감소하는 것을 확인하였다. 이상의 결과로 부터 추출물과 분획의 DPPH, ABTS⁺ 양이온 라디칼 소거능을 결과를 고려 할 때, 페놀성 화합물의 함량과 라디칼 소거능 사이에는 강한 상관관계가 있는 것을 알 수 있었다.

팥꽃나무과 방향성 수지질의 상록성 교목인 침향을 80% MeOH로 침지 추출하여 얻어진 추출물에 대해 CH₂Cl₂, EtOAc 및n-BuOH로 순차 용매 분획하였고, 얻어진 결과물 에 대하여 녹차의 항산화 성분으로서도 잘 알려져 있는 천연 항산화제인 (+)-catechin을 대조군으로 하여 DPPH, ABTS⁺ 라디칼 소거법에 의한 항산화활성 평가를 실시한 결과, 항산화 활성은 시료의 처리농도에 비례하게 효능을 나타내는 것으로 확인되었으며 그중에서도 DPPH 라디칼 소거활성은 페놀성 화합물의 함량이 상대적으로 높은 CH₂Cl₂ 가용부에서 26.1±4.4 μg/mL, EtOAc 가용부에서 24.8±3.9 μg/mL의 우수한 IC₅₀값을 나타내었다. 또한 ABTS⁺ 라디칼 소거능은 CH₂Cl₂, EtOAc 및n-BuOH 가용부 에서 각각 5.3±0.4 μg/mL, 5.5±0.4 μg/mL 활성이 확인 되었 으며, 총 페놀함량과의 강한 상관관계가 시사되었고 페놀 성의 활성물질의 존재가 시사되었다. 또한, 항비만 활성과 관련된 pancreatic lipase 저해활성을 측정한 결과, 오일의 형태로 얻어진 CH₂Cl₂ 가용부의 IC₅₀값은 1.1±0.3 μg/mL의 저해율을 나타내었으며 이는 대조군인 orlistat에 비해 약하 나 추출물 상태임을 고려할 때 단일물질로 정제할 경우 더욱 우수한 효능의 화합물이 존재할 가능성을 시사하였 다. 향후 이들 식의약품 소재개발을 위한 구체적인 자료 수립을 위하여 효소활성을 나타내는 성분들에 대해 활성추 적탐색법(activity-guided isolation)에 따라 활성물질을 추 적, 분리하는 연구를 통한 효능물질의 동정 및 활성 기작에 대한 연구가 필요하며, 침향의 식물 화학적 성분연구에 대 한 기초자료로 활용가능하리라 사료된다.