감마선 처리에 의한 떫은감 과육의 세포벽 성분 및 물성 변화

본 실험에 사용한 시료는 약 120 g 내외의 크기가 비슷한 둥시(떫은감)를 사용하였다.

시료의 감마선 조사는 투명한 polyethylene bag에 담고 한국원자력연구소내 선원 10만 Ci Co-60 감마선 조사시설 을 이용하여 실온에서 시간당 2.5 kGy 선량율로서 10 kGy 의 총 흡수선량을 얻도록 하였다. 흡수선량의 확인은 ceric cerous dosimeter을 이용하였고, 총 흡수선량의 오차는 ±5% 내외이었다. 최적 조사선량을 위한 실험에서는 5~20 kGy의 조사선량의 범위에서 실험하였으며, 물성변화와 관능검사 를 위한 감마선의 조사는 최적 조사선량인 10 kGy 조사 후 실험하였다.

탄닌 함량의 측정은 Duval과 Shetty의 방법(25)에 준하여 측정하였다. 즉, 시료 용액 1 mL에 95% ethanol 1 mL와 증류수 5 mL를 가하여 잘 흔들어 주고 5% Na₂CO₃ 용액 1 mL와 1 N Folin Ciocalteu reagent 0.5 mL를 가한 후 실온에 서 60분간 발색시킨 다음 725 nm에서 흡광도를 측정하였으 며, gallic acid를 사용한 표준곡선에서 양을 환산하였다.

과육의 경도는 rheometer(CR-100D, Sun scientific Co., Ltd., Tokyo, Japan)를 사용하였으며 시료를 높이 1 cm 두께 로 절단하여 직경 5 mm의 probe가 표피에서 3 mm되는 지점까지 가해지는 compressive force(kg/cm²)를 측정하 였다.

Yamaki 등(26)이 행한 방법에 따라 Fig. 1과 같이 행하였 다. 즉 세포벽추출은 과피를 제거한 과육질 100 g에 80% ethanol 200 mL를 가하여 균질화 한 후 80°C에서 10분간 가열하여 효소를 불활성화 시킨 다음 80% ethanol로 3회 여과, 세척하여 동결 건조한 것을 알콜 불용성 물질(alcohol insoluble substances)로 하였다. 여기에 α-amylase(3~5 unit/mg) 1 mg/mL를 함유한 50 mM sodium phosphate buffer(pH 6.8)에 protease(6~8 unit/mg) 1 mg/mL를 가하여 같은 조건에 12시간 처리한 후 원심분리한 상징액을 수용 성물질(water souble material)로 하고, 잔사는 세포벽성분 (cell wall fraction)으로 하였다. 다시 세포벽성분에 150 mg 의 NaClO₂와 빙초산 4방울을 함유한 증류수 100 mL를 가하 여 70°C에서 1시간 교반한 후 원심분리하여 상징액을 lignin 분획으로 하였고, 잔사에 0.05 M EDTA-2Na 100 mL를 가하 여 80°C에서 30분간 가열하여 원심분리한 후 상징액을 pectin질 분획으로 하였다. 다시 잔사에 0.05 N H₂SO₄ 100 mL를 가하여 100°C에서 5시간 끊인 다음 원심분리하여 얻은 상징액을 산 가용성 hemicelluose 분획으로 하였다. 다시 잔사에 4 N KOH를 가하고 N2 gas하에서 12시간 방치 한 후 원심분리하여 얻은 상징액을 알칼리 가용성 hemicelluose 분획으로 하였으며, 잔사를 cellulose분획으로 하였다. 각 상징액은 증류수에서 72시간 투석한 후 동결 건조하여 중량으로 함량을 측정하였다.

Fig. 1. Procedure for the fraction of cell wall polysaccharides from astr ingent persimmon fruits.

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효소추출은 Moshrefi와 Luh(27)가 행한 방법에 따라 시 료 200 g에 증류수 400 mL를 가하여 10분간 균질화하고 30분간 천천히 교반한 후 1 M이 되게 NaCl을 가하고 30분 간 천천히 저어준 후 균질액을 pH 6.0으로 조정하고 3시간 동안 magnetic bar로 교반한 다음 여과하여 조효소액을 얻 었다. 조효소액을 80% 포화 (NH₄)₂SO₄로 염석하고, 20,000×g에서 10분간 원심분리한 다음 침전물을 0.15 N NaCl용액에서 48시간 투석한 후 다시 20,000×g로 15분간 원심분리한 상징액을 조효소로 하였다. 모든 효소의 추출 조작은 4°C에서 행하였다.

Polygalacturonase 활성 측정은 Gross의 방법(28)에 준하 였다. 1% polygalacturonic acid 용액 100 µL와 증류수 50 µL 혼합액에 효소액 50 µL를 가하여 30°C에서 30분간 반응 시킨 다음 0.1 M boric acid-borax buffer(pH 9.0) 1 mL를 가하여 반응을 정지시켰다. 다음에 1% 2-cyanoacetamide용 액 200 µL를 가하여 혼합하고, 10분간 끊인 후 얼음물에서 냉각한 다음 276 nm에서 흡광도를 측정하였다. Polygalacturonase의 활성 단위는 30°C에서 30분 동안에 1 µmole의 α-D-galacturonic acid를 생성하는 효소량을 1 unit로 하였다.

Simon과 Tucker의 방법(29)에 의해 측정하였다. 즉, 0.05 M acetate buffer(pH 5.2)에 pectin을 0.5% 농도로 용해하여 만든 기질용액과 효소액을 10 : 1(v/v)로 혼합한 후 30°C에서 60분간 반응시키고, 반응액 1 mL에 2% potassium permanganate 0.2 mL를 가하고 얼음수조에서 15분간 방치 하였다. 여기에 0.2 mL의 0.5 M sodium arsenite 용액과 0.6 mL의 증류수를 가한 후 1시간 실온에서 반응시키고 2 mL의 0.02 M pentan-2,4-dion 용액을 가하여 밀봉하고, 60°C에서 15분간 가열하여 발색시킨 후 실온에서 412 nm로 흡광도를 측정하였으며, 표준품으로는 메탄올을 사용하여 표준곡선을 작성하였다.

β-Galactosidase의 활성 측정은 Pressey의 방법(30)에 따 라 ρ-nitrophenyl-β-galactoside를 가수분해하는 정도를 측정 하여 효소의 활성으로 나타내었다. 0.2% ρ-nitrophenyl-β -galactoside/10 mM sodium acetate buffer(pH 4.0) 50 µL에 0.2% bovine serum albumin 300 µL와 10 mM sodium acetate buffer(pH 4.0) 100 µL를 잘 혼합한 후, 효소액 100 µL를 가하여 15분간 반응시킨 다음 0.2 M Na₂CO₃ 2 mL를 가하여 반응을 정지시키고 410 nm에서 흡광도를 측정하였다. 효소 단위는 30°C에서 15분 동안에 1 mM의 ρ-nitrophenyl-β -galactoside를 분해하는 효소량으로 정하였다.

떫은 감 과육에 대한 관능검사는 10인으로 검사 패널을 구성하여 수렴성 및 경도에 대하여 5단계 평점법으로 평가 하였다. 수렴성은 매우 떫다(1점), 약간 떫다(2점), 보통이다 (3점), 거의 떫지 않다(4점), 전혀 떫지 않다(5점)로 평가하 였고, 조직감은 매우 딱딱하다(1점), 약간 딱딱하다(2점), 보통이다(3점), 약간 물렁하다(4점), 매우 물렁하다(5점)로 평가하였다.

본 실험의 결과는 3회 반복하여 측정한 평균값을 나타내 었으며 평균±표준편차로 나타내었다. 통계처리는 SPSS (7.5, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 프로그램을 이용하여 통계 처리하였고 분산분석(analysis of variance) 및 Duncan 의 다중범위검정법(Duncan’s multiple range test)으로 95% 수준에서 유의성을 검정하였다.

떫은감 과육 중의 가용성 탄닌 함량의 변화는 Table 1과 같이 방사선을 처리하지 않은 대조구의 경우 181.04±1.72 µg/g이었으나 방사선 처리의 경우 처리 방사선의 양이 5, 10, 20 kGy로 증가할수록 146.31±0.77 µg/g, 126.50±0.39 µg/g 및 128.09±2.76 µg/g으로 과육내의 가용성 탄닌의 양은 줄어드는 것이 확인되었으며, 10 kGy 이상의 방사선 처리 는 가용성 탄닌의 양을 변화시키는데 크게 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다. Nakabayashi(31), Yonemori와 Matsushima(32)는 감과실의 성숙 및 연화가 진행됨에 따라 탄닌 분자 간 중합으로 고분자화가 진행되어 불용성으로 바뀐다고 보고하였고, 본 실험 결과 방사성 조사에 의해 과육의 숙성이 일어나며, 이에 따른 탄닌 분자들의 중합에 의한 고분자화가 발생하여 가용성 탄닌이 불용성 탄닌으로 바뀌는 것으로 생각되었다.

떫은 감 과육의 경도는 Table 2에서처럼 방사선을 조사하 지 않은 대조구에 비해 방사선 조사에 의해 감의 숙성이 진행됨에 따라 연화현상이 유발되어 경도가 감소되는 것으 로 추정하였으며, 이러한 현상은 연화효소의 활성과 연관 이 있으리라 판단되었다. 또한 방사선 조사량이 증가함에 따라 과육의 경도가 약해지는 양상을 나타내었으나 10 kGy 와 20 kGy간의 조사량 차이에서는 유의성이 없는 것으로 측정되었다. 따라서 FAO, IAEA, WHO 등에서 식품에는 10 kGy 이하의 조사량만 허용하고 있으며(18), 본 연구 결 과, 20 kGy의 조사량이 물성변화에 미치는 영향이 10 kGy 에 비해 유의적인 차이를 나타내지 않아 과다한 조사량이라 고 판단되어 향후 연구에는 10 kGy의 조사량에 국한하여 연구를 진행하였다.

과실의 숙성은 세포벽 구성성분의 변화에 기인하고, 세 포벽 구성성분의 변화는 세포벽 분해효소에 의한 효소적 변화와, Ca²⁺함량에 따른 pectin질의 변화에 기인한다(1,2). Table 3과 4는 Yamaki 등(26)이 행한 방법에 따라 분획한 알콜불용성 물질(alcohol-insoluble substance), 수용성 물질 (water-soluble material) 및 세포벽성분(cell wall)의 함량을 측정한 결과이다. 알콜불용성 물질의 함량은 방사선을 처 리하지 않은 대조구의 경우 39.3±3.2 mg/g이었으나, 방사선 처리의 경우 37.2±3.7 mg/g로 다소 낮아졌고, 수용성 물질 의 함량은 대조구의 경우 11.4±1.7 mg/g였으나, 방사선 조 사의 경우 13.9±1.8 mg/g로 다소 높아졌으며, 세포벽 성분 의 함량은 대조구의 경우 26.6±2.2 mg/g였으나, 방사선 조 사의 경우 23.1±4.7 mg/g로 다소 낮아졌다. 방사선 처리 후 상온에 저장하였을 경우에 세포벽 성분은 저장 기간이 경과할수록 다소 낮아지는 경향을 나타내었고, 수용성 물 질의 함량은 방사선 조사 후 저장 기간이 경과할수록 함량 이 높아지는 경향을 나타내었다. Kenn(33) 및 Arpaia 등(34) 은 과실이 성숙됨에 따라 알콜 불용성 물질과 세포벽성분의 함량은 감소하고, 세포벽 구성다당류는 저분자화 현상이 일어난다고 보고하였고, Hurber(1), Ahmed와 Labavitch(5) 및 Bartley와 Knee(8)는 세포벽성분이 분해됨으로써 세포 벽성분의 함량은 감소하고 수용성 물질이 증가한다고 보고 하였다. 따라서 떫은감 과육은 방사선조사에 의해 숙성이 일어나며 세포벽성분의 함량은 감소하고 수용성물질의 함 량이 증가하는 것은 세포벽이 분해되어 수용성물질로 전환 되기 때문인 것으로 생각된다. 또한 알콜 불용성 물질과 세포벽성분의 함량이 감소하는 것은 연화현상과 깊은 관련 이 있을 것으로 판단되어 제품 물성에 영향을 미칠 것으로 판단되었다(33).

Table 5와 6은 세포벽 구성다당류를 분획하여 정량한 결과로 lignin의 함량과 pectin질의 함량은 대조구의 경우 각각 0.82±0.13 mg/g, 3.56±0.27 mg/g mg/g였으나, 방사선 조사의 경우 각각 0.77±0.04 mg/g, 3.14±0.19 mg/g로 다소 감소하였다. 또한 방사선 조사 후 저장 기간이 경과할수록 이러한 현상은 더욱 심화되는 것으로 측정되었다. Kenn(33), Yamaki 등(26)은 과일이 숙성될수록 총 pectin의 함량이 감소한다고 보고하였으며, 연화현상이 일어나는 과 일의 경우 감마선 조사에 의해 과일의 숙성이 진행될 수 있음을 짐작하였다. 산가용성 hemicellulose의 함량은 lignin 과 pectin처럼 방사선 조사에 의해 감소하는 경향을 나타내 었으나, 알칼리 가용성 hemicellulose와 cellulose는 방사선 조사에 의해 증가하는 양상을 나타내었다. Hurber(1)는 과 실이 성숙함에 따라 hemicellulose는 저분자화 현상이 일 어난다고 보고하였으며, 본 연구 결과에서 방사선 조사에 의해 감과육의 고분자 hemicelluloses가 가수분해되어 저 분자 hemicelluloses로 전환되기 때문인 것으로 판단되었 다(27).

과실의 연화현상은 세포벽 분해효소에 의해서 세포벽의 구성다당류가 가수분해됨으로써 일어나며, polygalacturonase (PG), pectinesterase(PE)와 β-galactosidase는 과실의 연화와 밀접한 관계가 있다(1-4). 떫은 감에 10 kGy 선량으로 방사 선을 조사한 후 저장기간 동안 감 과육에 존재하는 세포벽 분해 및 연화효소인 PG, PE와 β-galactosidase의 활성변화 를 측정한 결과 Fig. 2에서와 같이 과일의 연화현상에 관여 하는 PG, PE 및 β-galactosidase 모두 10 kGy 방사선 처리 후 저장기간이 경과할수록 효소활성이 급격하게 증가하였 다. 방사선 조사전에는 효소활성이 전혀 측정되지 않았으 나, 저장 2일째 PG, PE와 β-galactosidase의 활성은 각각 2.52, 2.21 및 3.07 unit/mL로 측정되었다. 과실의 성숙과정 중 PG의 활성은 과실이 익어감에 따라 활성이 증가하며 (35), 저장 중에 PG의 활성이 급격히 증가한다(12,36). 또한 과실이 성숙함에 따라 PG의 활성이 증가되는 것은 세포벽 의 분해와 동시에 glycoprotein형태로 세포벽에 결합되어 있는 비활성형 PG가 유리되어 활성형으로 전환되기 때문 이며(37), 특히 생성된 PG가 middle lamella를 용해하므로 활성형 PG로 유리되어 효소의 활성도 급증하게 된다(2). Pressey(35)는 과실이 성숙함에 따라 효소의 활성도가 증가 하며, PG의 활성이 증가하면 경도가 급격히 감소한다고 보고하였다. 본 실험 결과 방사선 조사에 의해 감과육의 세포벽 분해 효소들의 활동이 왕성해지고 이로 인한 연화현 상이 촉진되어 과육의 경도가 낮아지게 되어 연화현상이 발생하는 것으로 판단되었다. 또한 방사선을 조사하지 않 은 감과육을 상온저장 할 경우 40일간의 저장기간에도 과 육의 경도 변화는 크게 낮아지지 않는다는 결과 보고가 있으며(38,39), 본 연구에서는 방사선 조사 후 2일간의 저장 에도 감과육의 물성 변화가 관찰되어 방사선에 의한 효소 변화에 기인한 연화를 촉진시키는 수단으로 활용이 가능한 것으로 판단되었다.

Fig. 2. Change in enzyme activity of astr ingent persimmon fruits during storage after 10 kGy dose radiation treatment.

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방사선을 처리하지 않은 감과육의 경우 저장 초기에는 물성 변화가 거의 발생하지 않으므로(38,39), 방사선 처리 감을 대상으로 관능검사한 결과 Table 7에서 보는바와 같이 수렴성은 방사선을 처리하지 않은 대조구의 경우 1.2±0.2 로 매우 떫은 것으로 나타났으나 방사선 처리 후에는 2일간 저장한 경우 3.8±0.3으로 떫은맛을 거의 느끼지 않을 정도 의 수치에 육박함을 알 수 있었다. 과육의 경도에 대한 관능 검사 결과 Table 7에서와 같이 대조구는 2.0±0.1로 딱딱한 것으로 나타났으나 방사선 처리 후에는 2.4±0.3으로 관능 검사 score가 증가하기 시작하여 저장 2일 후 score가 3.6±0.3으로 물렁해 지기 시작하는 것으로 나타났다. 이는 방사선 처리 후 저장기간이 경과할수록 연화효소의 활성이 높아지는 것에 기인한 것으로 판단되었다. 이러한 결과를 종합하면 방사선 처리 후 저장 기간이 경과할수록 떫은맛은 감소하는 경향을 나타내었으나 반대로 연화현상은 심해지 는 것으로 나타났다. 따라서 떫은 감 과일의 경우 방사선처 리에 의해 탄닌의 축합이 일어나며 과육의 숙성도 동시에 발생하여 떫은맛이 감소하게 되고, 연화현상도 발생되는 것으로 추측하였으며, 떫은맛의 감소 정도와 경도의 유지 를 고려해서 방사선조사 후 저장 2일까지는 물성이 유지되 는 것으로 판단되었다.