수입산 열대·아열대 과일의 항산화 활성 비교연구

본 실험에 사용한 수입 과일은 그린키위(green kiwi, 뉴질 랜드산), 석류(pomegranate, 미국산), 옐로우망고(yellow mango, 필리핀산), 용과(dragon fruit, 베트남산), 파인애플 (pineapple, 필리핀산), 파파야(papaya, 필리핀산) 등 6종으 로 서울소재 대형마트에서 2014년 9월에 구입하였다. 이들 각각의 껍질을 제거하고 조직을 파쇄한 후 동결건조기 (TFD, Ilshin, Seoul, Korea)를 이용하여 건조한 다음 분말화 하여 -20°C에 냉동보관하며 사용하였다. Folin-ciocalteau’s phenol reagent, gallic acid, 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH), 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS), potassium persulfate, xanthine, xanthine oxidase, nitroblue tetrazolium(NBT), potassium ferricyanide, 2, 4, 6-tri-2-pyridyl-1, 3, 5-triazine(TPTZ), mushroom tyrosinase 등은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고 그 외의 시약은 특급 및 일급시약을 구입하여 사용하였다.

각각의 분말 시료에 20배의 70% 에탄올을 가하고 30°C에 서 12시간 추출하는 과정을 2회 반복 실시하였다. 추출액을 여과지(Whatman filter paper No.1)로 여과한 후 진공농축기 (Buchi R-114, Flawil, Switzerland)로 감압농축하여 동결 건 조시킨 다음 일부를 취하여 1, 2.5, 5 mg/mL의 농도가 되도 록 50% dimethyl sulfoxide에 용해하여 시료를 제조하였으 며, 양성대조군으로는 ascorbic acid를 1 mg/mL 농도로 제조 하여 사용하였다.

총 폴리페놀 함량은 Dewanto 등(14)의 방법에 따라 각 시료용액 0.1 mL에 증류수 1.9 mL와 Folin-Ciocalteau’s phenol reagent 0.2 mL를 가하여 실온에서 3분간 반응시켰 다. 여기에 포화 Na₂CO₃ 용액 0.4 mL와 증류수 1.9 mL를 가하여 혼합하고 실온에서 1시간 반응시킨 후 725 nm (Smart Plus SP-1900PC, Seoul, Korea)에서 흡광도를 측정하 였다. 총 폴리페놀 함량은 mg gallic acid equivalents (GAE) /g으로 나타내었다.

시료용액의 DPPH radical 소거능은 Blois의 방법(15)에 따라 0.1 mM DPPH 용액 2 mL에 시료용액 0.4 mL를 가하여 잘 혼합하고 실온에서 30분간 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하여 시료용액 첨가군과 무첨가군 간의 흡광 도 비(%)로 나타내었다.

시료 용액의 ABTS radical 소거능은 Re 등(16)의 방법을 일부 변형하여 측정하였다. 즉, ABTS 용액과 2.45 mM potassium persulfate를 14:1로 혼합(v/v)하여 실온의 암소에 서 20시간 방치한 후 증류수를 가하여 734 nm에서의 흡광 도값이 0.70 내외가 되도록 희석하였다. 이 중 1.6 mL를 취하여 시료용액 0.1 mL를 가하고 실온에서 5분간 방치한 다음 734 nm에서 흡광도를 측정하여 시료용액 첨가군과 무첨가군 간의 흡광도 비(%)로 나타내었다.

시료용액의 superoxide anion radical 소거능은 Wang 등 (17)의 방법을 약간 응용하였다. 즉, 각 시료용액 0.4 mL에 0.4 mM xanthine과 0.24 mM NBT를 1:1로 혼합한 용액 1 mL, xanthine oxidase(0.049 unit/mL) 0.75 mL를 가한 다음 37°C에서 40분간 반응시켰다. 여기에 69 mM SDS 2 mL를 가하여 반응을 정지시킨 다음 560 nm에서 흡광도를 측정하 여 시료용액 첨가군과 무첨가군의 흡광도 비(%)로 나타내 었다.

FRAP은 Benzie 등(18)의 방법을 변형하여 측정하였다. 즉, 300 mM acetate buffer(pH 3.6)와 40 mM HCl에 녹인 10 mM TPTZ 및 20 mM ferric chloride를 10 : 1 : 1(v/v)의 비율로 혼합하여 FRAP용액을 제조한 다음 시료용액 0.2 mL에 FRAP용액 2 mL를 가하여 실온에서 4분간 반응시킨 후 593 nm에서 흡광도를 측정하였다.

시료용액의 tyrosinase 저해 효과는 Chang 등(19)의 방법 을 변형하여 측정하였다. 즉, 10 mM L-DOPA 0.04 mL와 0.175 M phosphate buffer(pH 6.8) 2 mL에 시료용액 0.5 mL를 가하여 잘 혼합하였다. 여기에 mushroom tyrosinase (110 unit/mL) 0.04 mL를 가하고 35°C에서 2분간 반응시킨 다음 475 nm에서 흡광도를 측정하여 시료용액 첨가군과 무첨가군 간의 흡광도 비(%)로 나타내었다.

시료용액의 환원력(reducing power)은 Wong 등(20)의 방 법을 변형하여 측정하였다. 즉, 각 시료용액 0.5 mL에 0.2 M phosphate buffer(pH 6.6) 0.5 mL와 1% potassium ferricyanide 0.5 mL를 혼합하여 50°C에서 20분간 반응시킨 다음 10% TCA 용액 0.5 mL와 0.1% FeCl₃ 0.2 mL를 가하여 잘 혼합한 후 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.

모든 실험은 3회 이상 반복 측정하였고 SPSS(12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 평균±표준편차로 표시 하였다. 각 실험군 간의 차이는 유의수준 p<0.05에서 분산 분석(ANOVA)으로 분석한 다음 Duncan’s multiple range test로 평균치간의 유의적 차이를 검증하였다.

폴리페놀 화합물은 flavonoid, isoflavone, flavone, anthocyanin, tannin, catechin 등을 총칭하는 것으로 과일을 포함한 식물계에 널리 분포되어 있다(5,21). 폴리페놀에 존 재하는 다수의 hydroxyl (-OH)기는 단백질 및 여러 화합물 과 결합하는 특성이 있어 항산화, 항암, 항염, 시력증진 효과 가 우수한 것으로 보고되고 있다(21-23). 열대·아열대 과일 을 70% 에탄올로 추출한 후 총 폴리페놀 함량을 측정한 결과는 Table 1과 같다. 석류가 12.22 mg GAE/g으로 가장 높게 나타났고 파인애플이 3.77 mg GAE/g으로 그 다음으 로 높았으며 용과, 그린키위, 파파야, 옐로우망고가 2.45~2.99 mg GAE/g으로 나타났다(p<0.05). Hossain 등 (24)은 파인애플 메탄올 추출물의 폴리페놀 함량을 51.1 mg caffeic acid equivalent/g으로 보고하였고 Ozgen 등(25) 은 6 품종 석류의 총 페놀 함량 분석결과 124.5~207.6 mg GAE/100 mL의 범위라고 보고하였다. Liu 등(26)은 4 종류 망고의 총 페놀 함량이 22.27~139.71 mg GAE/100 g으로 품종에 따라 차이가 있음을 보고하였고 Patthamakanokporn 등(27)은 망고와 파파야의 폴리페놀 함량을 71~113 mg GAE/100 g과 54 mg GAE/100 g으로 각각 보고하였다. Yu 등(28)은 파파야를 과육, 종자, 껍질로 구분하고 폴리페놀 함량을 측정한 결과 각각 4.67 ug/mg, 25.47 ug/mg, 7.99 ug/mg으로 보고하였다. 이와 같이 같은 종류의 과일이라도 폴리페놀 함량에 차이가 나는 것은 품종, 성숙 정도, 기후, 토양, 건조방법, 추출방법 등이 각기 다른데서 비롯된다고 할 수 있다(12). 과일은 비타민 C, E, β-카로틴과 같은 항산 화 비타민의 주된 공급원이고 free radical 소거작용을 통해 건강에 도움을 준다. 그러나 과일이 나타내는 항산화 효과 의 80% 이상은 비타민 이외의 물질에서 비롯되는 것으로, 대표적 성분이 페놀성 물질이며 이들이 free radical 소거능 을 통해 항산화 작용을 나타낸다고 보고된 바 있다(29).

DPPH는 짙은 보라색을 나타내는 free radical로 항산화 활성이 있는 물질과 만나면 hydrogen radical의 전자를 받아 들여 노란색으로 탈색되는 특징을 가진다. 색이 엷어지는 정도가 크면 DPPH radical 소거능이 큰 것을 의미한다(30). 열대·아열대 과일의 DPPH radical 소거능을 측정한 결과는 Fig. 1과 같다. 시료 농도 1 mg/mL에서는 13.52~61.73%로 나타났고 농도 증가에 따라 소거능은 전반적으로 증가하여 2.5 mg/mL에서 31.46~92.80%, 5 mg/mL에서 43.46~93.00% 를 나타내었다. 석류는 모든 농도에서 다른 시료보다 높은 소거능을 보여주었고 2.5 mg/mL 이상의 농도에서는 양성 대조군으로 사용한 ascorbic acid의 활성(95.26%)과 대등하 여 항산화능이 우수한 것으로 나타났는데(p<0.05) 이는 폴 리페놀 함량이 높은 것과 상관이 있는 것을 알 수 있다. 반면, 용과는 가장 낮은 활성을 보이며 석류의 1/2에 해당하 는 소거능을 보였다. Rho 등(31)은 석류 메탄올 추출물이 10~100 ug/mL의 범위에서 농도에 비례하는 DPPH radical 소거작용을 나타내었다고 하였다. Chung 등(32)은 색상별 키위의 DPPH radical 소거능을 측정한 결과 1~20 mg/mL의 범위에서 농도 비례적으로 유의적인 증가추세를 보이며 20 mg/mL에서 87.12~94.83%를 나타내었다고 보고하였다. Hossain 등(24)은 파인애플을 물, 에틸아세테이트, 메탄올 로 각각 추출하고 100 ppm 농도에서 DPPH 소거능을 측정 한 결과 메탄올 > 에틸 아세테이트 > 물 추출물 순으로 높게 나타났고 이는 폴리페놀 함량과 비례한다고 보고하였 다. 본 실험 결과 총 페놀 함량이 가장 높은 석류에서 DPPH 소거능이 가장 높게 관찰되었다.

Fig. 1. DPPH radical scavenging activity of impor ted tropical and subtropical fruits. Values with different small letters are significantly different at p<0.05 among var ious fruits. Values with different capital letters are significantly different at p<0.05 among concentrations.

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ABTS는 potassium persulfate와 반응하여 청록색의 ABTS cation radical (ABTS^·+)을 생성하는데 항산화 활성 을 가진 물질로부터 전자를 받으면 무색으로 탈색된다. ABTS cation radical은 물과 유기용매에 모두 용해되므로 친수성 및 소수성 시료의 항산화능 측정에 모두 적용 가능 하여 많이 사용되고 있다(30). 열대·아열대 과일의 ABTS radical 소거능 측정 결과는 Fig. 2와 같다. 시료 농도 1 mg/mL에서는 6.31~38.89%로 용과, 그린키위, 파파야가 낮 은 소거능을 보였고 석류가 가장 높은 소거능을 보였다 (p<0.05). 농도 증가에 따라 소거능은 모든 시료에서 유의적 으로 증가하여 2.5 mg/mL에서 18.15~78.40%로 나타났고, 5 mg/mL에서는 28.16~98.98%로 석류 > 옐로우망고 > 파인 애플 > 그린키위 > 파파야 > 용과 순으로 나타났다(p<0.05). 석류는 소거능이 가장 낮은 용과의 3.5배 이상이었으며 양 성대조군인 ascorbic acid(98.23%)와 대등한 활성이었다. ABTS 활성은 폴리페놀 함량이 높은 석류에서 가장 높게 나타나 DPPH 소거능과 마찬가지로 총 페놀함량과 연관이 있는 것을 알 수 있었다.

Fig. 2. ABTS radical scavenging activity of imported tropical and subtropical fruits. Different small letters above the bars indicate significantly different at p<0.05 among various fruits. Different capital letters above the bars indicate significantly different at p<0.05 among concentrations.

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Superoxide anion radical(O₂^·-)은 xanthine oxidase에 의하 여 생성되고 NBT와 반응하여 superoxide anion radical-NBT 복합체를 형성하면 청색을 띠게 되는데 항산화 활성을 갖는 물질에 의해 탈색되는 원리를 이용하여 측정하였다(33). Superoxide anion radical은 hydrogen peroxide (H₂O₂), hydroxyl radical (OH^·), singlet oxygen 등의 전구체로 작용 하며 세포 및 신경조직을 손상시키는 독성이 강한 radical이 다(34). 열대·아열대 과일의 superoxide anion radical 소거능 을 측정한 결과는 Fig. 3과 같다. 시료농도 1 mg/mL에서 석류와 파인애플이 각각 67.27%와 64.30%로 가장 높게 나 타났고 파파야와 그린키위가 각각 29.34%와 32.58%로 가 장 낮게 나타났다. 시료 농도 증가에 따라 소거능은 증가하 는 경향을 보여 2.5 mg/mL에서 33.11~81.29%, 5 mg/mL에 서 45.86~86.63%로 파파야는 전 농도 범위에서 가장 낮은 소거능을 보였고 석류와 파인애플은 가장 높은 소거능을 보였다(p<0.05). 양성대조군으로 사용한 ascorbic acid는 활 성이 나타나지 않아 본 실험에서 사용한 농도 범위에서는 superoxide anion radical을 포착하는 능력이 없는 것으로 나타났으며 이러한 결과는 Jeong 등(35)의 연구에서 vitamin C, vitamin E, BHA, BHT 등의 상용 항산화제가 superoxide anion radical 소거능을 나타내지 않았다고 보고 한 내용과 유사하였다.

Fig. 3. Superoxide anion radical scavenging activity of impor ted tropical and subtropical fruits. Different small letters above the bars indicate significantly different at p<0.05 among var ious fruits. Different capital letters above the bars indicate significantly different at p<0.05 among concentrations.

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FRAP법은 산화·환원 반응을 측정하는 것으로 시료 중에 항산화 물질이 존재하면 노란색의 Fe(III)-TPTZ가 푸른색 의 Fe(II)-TPTZ로 환원되는 원리를 이용하는 것이다(36). 열대·아열대 과일의 FRAP 활성을 흡광도로 나타낸 결과는 Fig. 4와 같다. 시료 농도 1 mg/mL에서는 0.02~0.14 abs로 나타났고 2.5 mg/mL에서는 0.05~0.15 abs로 큰 변화가 없었 으나 그 이후의 농도에서 유의적으로 증가하여 5 mg/mL에 서는 0.10~0.37 abs로 파파야가 가장 높았고 그 다음으로 그린키위 > 파인애플 = 석류 > 용과 > 옐로우망고 순이었다 (p<0.05). Guo 등(37)은 28종 과일의 FRAP 활성을 측정한 결과 본 실험에 사용한 동일종의 과일에서 키위 > 석류 > 파인애플 > 망고 순으로 높게 나타났다고 보고하여 본 실험의 결과와 유사한 경향을 보였다. 이 같이 항산화 실험 방법에 따라 시료의 활성 정도가 다르게 나타나는 것은 항산화 실험마다 측정 원리와 반응 mechanism이 각기 다르 고 특정 성분에 대한 반응 정도가 다르기 때문인 것으로 보고되고 있다(36). 따라서 시료의 항산화 활성을 평가하려 면 두 가지 이상의 방법으로 평가하기를 권장하고 있다 (27,36).

Fig. 4. FRAP of impor ted tropical and subtropical fruits. Different small letters above the bars indicate significantly different at p<0.05 among var ious fruits. Different capital letters above the bars indicate significantly different at p<0.05 among concentrations.

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피부에 존재하는 흑색색소인 melanin은 표피세포의 melanocyte에서 tyrosinase를 핵심효소로 하여 tyrosine으로 부터 생 합성된다. 피부에 적당량 존재하는 melanin은 자외 선과 활성산소로부터 피부를 보호하는 역할을 하지만 과도 한 생성은 색소침착으로 이어지고 피부 노화를 촉진시키며 피부암 유발의 원인이 되기도 한다(38). 한번 생성된 멜라닌 은 쉽게 파괴 또는 분해되기 어렵기 때문에 melanin 합성의 주효소인 tyrosinase 활성을 저해하는 물질의 탐색 연구가 이루어지고 있다(38). Mushroom tyrosinase 효소를 이용하 여 열대·아열대 과일의 tyrosinase 저해 효과를 측정한 결과 는 Fig. 5와 같다. 시료 농도 1 mg/mL에서는 그린키위가 29.61%로 가장 낮았고 석류가 44.09%로 가장 높았다. 농도 증가에 따라 저해효과의 증가는 미미하여 2.5 mg/mL에서 39.79~53.79%, 5 mg/mL에서 45.72~67.28%를 나타내었으 며 그 중 석류, 파인애플, 용과가 다른 시료보다 높은 활성을 나타내었다(p<0.05). Shin 등(40)은 참외 추출물의 tyrosinase 저해활성을 측정한 결과 1,000 ppm에서는 tyrosinase 저해 활성이 나타나지 않았고 10,000 ppm에서 껍질 17.71%, 과 육 16.81%, 태좌 12.59%를 보이며 각 부위별로 20% 이하의 낮은 저해효과를 나타내었다고 보고하였다(40). Chung 등 의 연구(32)에서 gold, green, red 키위의 tyrosinase 저해 효 과는 농도 증가에 따라 증가하는 경향을 나타내어 5 mg/mL 에서 35.17~43.11%, 10 mg/mL에서 44.09~50.00%, 20 mg/mL에서 57.06~86.76%를 나타내었고 총 페놀 함량이 높은 순으로 저해효과가 높았다고 보고하여 본 실험의 결과 와는 다소 차이를 보였다.

Fig. 5. 5. Tyrosinase inhibitory activity of impor ted tropical and subtropical fruits. Different small letters above the bars indicate significantly different at p<0.05 among var ious fruits. Different capital letters above the bars indicate significantly different at p<0.05 among concentrations.

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환원력은 항산화 활성과 관련이 있는 중요한 인자이다. Potassium ferricyanide를 이용하여 형성된 ferric ion(Fe³⁺) -ferricyanide 복합체는 시료 중에 존재하는 항산화 물질에 의해 ferrous(Fe²⁺) 상태로 환원되면서 푸른색을 띠게 되고 이 때의 흡광도로 항산화 활성을 측정한다(5,30,33). 열대·아열대 과일의 환원력을 측정한 결과는 Fig. 6과 같다. 시료 농도 1 mg/mL에서는 석류가 0.42 abs로 가장 높았고 파인애 플이 0.17 abs로 그 다음 순으로 높았다. 시료 농도 증가에 따라 환원력은 유의적으로 증가하여 2.5 mg/mL에서 0.24~0.98 abs를 나타내었고 5 mg/mL에서는 용과가 0.34 abs로 가장 낮았고 석류가 1.28 abs로 용과보다 3.7배 이상 의 환원력을 보이며 가장 높게 나타났으며 양성대조군인 ascorbic acid(1.25 abs)와 대등하였다(p<0.05). 이로써 석류 는 Fe³⁺를 효과적으로 환원시키는 것을 알 수 있었다. 본 실험 결과 환원력은 페놀 함량이 높은 시료에서 높게 나타 나 DPPH radical 소거능에서와 마찬가지로 페놀 함량과 상관관계가 높은 것으로 보인다.

Fig. 6. Reducing power of imported tropical and subtropical fruits. Different small letters above the bars indicate significantly different at p<0.05 among various fruits. Different capital letters above the bars indicate significantly different at p<0.05 among concentrations.

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