추출방법을 달리한 달맞이꽃 추출물의 항산화 및 항균 활성

달맞이꽃(Oenothra biennis)은 7월~8월중 대구근교의 산과 들에서 채취하여 시료로 사용하였고, 달맞이꽃을 흐르 는 물로 세척하여 불순물을 제거한 뒤 동결건조 (PVTFD20R, Ilshin lab., Suwon, Korea)하였으며, 건조한 시료는 분쇄기(IKA® A11 basic, IKA® Werke GmbH & Co., KG, Staufen, Germany)를 이용하여 40 mesh 이하로 분쇄한 후 –70℃(NU-6518G, NuAire, Plymouth, MN, USA) 에서 보관하면서 추출물 제조에 사용하였다.

달맞이꽃 추출은 시료 100 g에 10배의 70% 에탄올을가한 후 상온교반추출(SE, stirrer extraction)은 25±2℃의 실 온에서 교반기(Hanbak Scientific Co., Bucheon, Korea)를 이용 150 rpm으로 24시간, 3회 반복 추출하였고, 환류냉각 추출(RE, reflux extraction)은 냉각관을 부착하여 60℃의 항 온수조에서 3시간 3회 반복 추출하였다. 초음파추출(USE, ultrasonification extraction)은 시료를 넣은 유리병이 초음파 수조(NXPC-4020P, KODO, Hwaseong, Korea) 바닥에 닿지 않도록 하여 40 KHz로 2시간 3회 반복 추출하였다. 고온가 압추출(AE, autoclave extraction)은 autoclave(JSAC-100, JS Research Inc., Gongju, Korea)를 이용 121℃, 15분 동안 3회 반복 추출하였다. 저온고압추출(LE, low temperature high pressure extraction)은 저온고압추출기(FT110, benchtop rapid extractor, ARMFIELD, Ringwood, Hampshire, England) 를 이용 실온에서 8.0 bar의 압력하에서 2시간 3회 반복 추출하였다. 각각의 추출물은 여과지(Whatman No. 2, Maidstone, England)로 여과하여 농축기(WB2000, Heidolph, Schwabach, Germany)로 농축한 후, 동결건조하여 사용하였 다. 각 추출물들의 수율은 동결건조 후 건물 중량을 구한 다음 원료 건물량에 대한 백분율로 나타내었다.

총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis 법(11)에 따라 시료 1mL에 0.2 N Folin-ciocalteu's phenol reagent(Sigma-AldrichCo., St. Louis, MO, USA) 1 mL를 가하여 실온에서 3분간 반응시킨 후, 7.5% Na2CO3 1 mL을 가하여 암소에서 1시간 동안 방치한 후 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리 페놀 함량은 gallic acid를 표준물질로 한 표준곡선에 의하여 산출하였다.

총 플라보노이드 함량은 Abdel-Hameed의 방법(12)에 따라 시료 1 mL에 5% sodium nitrite 0.15 mL를 가하여 25℃에 서 6분간 방치한 후 10% aluminium chloride 0.3 mL를 가하 여 25℃에서 5분간 방치하였다. 다음 1 N NaOH 1 mL를 가하고 교반한 후 510 nm에서 흡광도를 측정하였으며, rutin hydrate(Sigma-Aldrich Co.)의 검량선에 의하여 함량을 산출하였다.

항균활성 측정을 위해 그람 양성세균 Bacillus cereusKCCM 11341, Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 2937과 그람 음성세균 Escherichia coli ATCC 11775, Salmonella typhimurium ATCC 14028을 사용하였고, 생육 배지로서 tryptic soy broth(Difco Co., Detroit, MI, USA)를 사용하였다. 항균활성은 paper disc method를 사용하여 clear zone 형성 유무를 측정하였다.

DPPH radical 소거능의 측정은 Blois의 방법(13)을 변형하여 시료 0.4 mL에 0.4 mM DPPH(α,α-diphenyl-β -picrylhydrazyl, Sigma-Aldrich Co.) 에탄올 용액 0.8 mL을 진탕 혼합하고, 10분간 방치 후 분광광도계를 사용하여 525 nm에서 흡광도를 측정하여 계산식, DPPH radical scavenging ability(%)=100-[(OD of sample/OD of control) ×100]에 의하여 활성을 산출하였다.

ABTS radical 소거능은 ABTS radical cation decolorizationassay(14)를 이용하여 측정하였다. 7.4 mM의 ABTS [2,2´-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt, Sigma- Aldrich Co.]와 2.6 mM potassium persulfate를 혼합하여 실온․암소에서 24시간 동안 방치하여 radical을 형성시킨 다음 실험 직전에 ABTS 용액을 732 nm에서 흡광 도가 0.700±0.030(mean±SD)이 되도록 phosphate-buffered saline(pH 7.4)으로 희석하여 사용하였다. 추출물 0.05 mL에 ABTS 용액 0.95 mL를 첨가하여 암소에서 10분간 반응시킨 후 732 nm에서 흡광도를 측정하여 계산식, ABTS radical scavenging ability(%)=100-[(OD of sample/OD of control) ×100]에 의하여 활성을 산출하였다.

Oyaizu(15)의 방법에 따라 각 추출물 2.5 mL에 0.2 M sodium phosphate buffer(pH 6.6) 2.5 mL와 1% potassiumferricyanide[K3Fe(CN)6] 2.5 mL를 각각 혼합하고 혼합물을 50℃항온수조에서 20분간 반응시킨 다음 10% trichloroacetic acid(TCA, w/v) 2.5 mL를 첨가하여 반응액을 3,000 rpm에서 10분간 원심분리 한 다음 상등액 2.5 mL에 증류수 2.5 mL와 0.1% ferric chloride (FeCl3) 0.5 mL를 첨가하고 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Yen 등(16)의 방법에 따라 시료 1 mL, 80% 에탄올 0.8mL, 2 mM FeCl2·4H2O[iron(II) chloride tetrahydrate; Sigma- Aldrich Co.] 용액 0.1 mL, 5 mM ferrozine[3-(2-pyridyl)- 5,6-diphenyl-1,2,4-triazine-4',4''-disulfonic acid; Sigma-Aldrich Co.] 용액 0.1 mL를 첨가한 다음 혼합하여 실온에서 10분간 반응시켰으며, 562 nm에서 흡광도를 측정하여 계산식 ferrous ion chelating activity(%)＝100-[(OD of sample/OD of control)×100]에 의하여 산출하였다.

모든 실험은 3회 반복으로 행하였으며, 평균치 간의 유의성은 SPSS system(Statistical Package for Social Sciences, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) software package(version 19.0) 를 이용하였고 p<0.05 수준으로 Duncan's multiple range test에 의하여 검정하였다.

추출방법을 달리한 달맞이꽃 에탄올 추출물의 수율, 총폴리페놀 및 플라보노이드 함량은 Table 1과 같다. 달맞이 꽃 추출물은 각각의 상온교반추출(SE), 초음파추출(USE), 환류냉각추출(RE), 고온가압추출(AE), 저온고압추출(LE) 의 방법에 따라 유의적인 차이를 나타내었으며(p<0.05), 그 중 RE방법이 수율, 폴리페놀, 플라보노이드 함량이 각각 46.33%, 463.05 mg GAE/g, 71.71 mg RHE/g으로 가장 우수 하였다. 이러한 결과는 열처리를 통한 추출방법이 다른 추 출방법에 비해 높은 수율, 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 나타낸다는 보고(17,18)와 유사하였다. 이는 열처리 과정 중 식물 세포벽의 수용화에 의해 구조적인 변화가 일어나 식물세포벽 구성성분이 용해되고, 단백질의 변성과 세포막의 비가역적인 분해로 막 투과성이 증가(19)하기 때 문인 것으로 판단된다. 또한, 열처리구 중 RE보다 AE의 값이 낮게 나타난 것은 고온가압처리에 의해 수율 및 총 폴리페놀 함량이 감소하였다는 Woo 등(20)의 연구결과와 유사하였으며, 식물 종과 부위에 따라 생리활성물질의 종 류, 결합정도, 열안정성이 다르기 때문으로 사료된다. Lee 등(21)이 34종의 국내산 산채류 메탄올 추출물의 총 폴리페 놀 함량은 8.2~270.1 mg/g이라고 보고한 결과와 비교하였 을 때 달맞이꽃 추출물에는 상당히 많은 폴리페놀을 함유하 고 있는 것으로 판단되며, 폴리페놀과 플라보노이드는 식 물계에 널리 분포되어 있는 2차 대사산물의 하나로 항암, 항고혈압, 항염증, 항산화 등의 생리활성(22)이 있어 달맞 이꽃 추출물은 다양한 기능성 제품의 소재로 이용이 가능할 것으로 판단된다.

식중독 및 병원성 미생물에 대한 추출방법을 달리한 달맞이꽃 에탄올 추출물의 항균활성을 측정한 결과는 Table 2에 나타내었다. 모든 시료에서 실험에 사용한 공시균주 중 B. cereus에 대한 항균활성이 나타났으며, 추출방법에 따른 차이는 나타나지 않았다. B. cereus는 자연환경에 널리 분포하는 포자 형성균으로 enterotoxin과 구토독소를 생성 하여 설사형, 구토형 식중독을 유발한다(23). 야채, 곡류 등의 농작물 그 가공 식품 등에 적은 수의 B. cereus가 오염되었더라도 적절하지 못한 저장과 조리과정을 거쳐 식중독을 발생시킬 수 있으므로B. cereus의 제어는 중요하 다(24). 달맞이꽃 추출물은B. cereus가 주요 오염균인 토양 유래 농산물 특히 곡류 및 그 가공품의 식중독 예방 및 보존 성 증진을 위한 소재로 활용이 가능할 것으로 판단된다.

DPPH와 ABTS radical 소거능 측정 결과는 Table 3과같다. DPPH radical 소거능은 모든 시료에서 농도 의존적으 로 활성이 증가하였으며, RE방법을 이용한 추출물이 높은 활성을 나타내었고 100 μg/mL의 농도에서 RE(74.40%), USE(72.52%), AE(71.14%), LE(71.09%), SE(66.73%) 순으 로 나타났다. 추출물(50 μg/mL)의 ABTS radical 소거능도 RE, USE, AE, LE, SE 순이었다. 이 결과는 Kang 등(17)이 보고한 다양한 추출방법 중 RE법으로 추출한 쑥 추출물의 항산화 활성이 가장 높다는 결과와 일치하였다. 이러한 차 이는 식물에 함유되어 있는 유효성분의 종류와 추출방법에 따라 차이가 난다고 보고되어 있으며(25), 본 연구에서는 RE 추출물의 polyphenol과 flavonoid가 다른 추출물에 비해 높기 때문에 DPPH 및 ABTS radical 소거능이 우수한 것으 로 판단된다. 달맞이꽃 추출물은 페놀계 합성 항산화제로 널리 사용되고 있는 BHA 및 BHT보다 높은 음이온 radical 소거능을 나타내고, 양이온 radical 소거능은 모든 양성 대 조구에 비해 활성은 낮았으나, 단일 물질로 정제되지 않은 천연물이라는 점에서 항산화 활성이 매우 높은 것으로 판단 된다.

항산화 활성이 우수한 달맞이꽃 추출물은 항산화 활성을갖는 기능성 제품 개발을 위한 소재로 이용이 가능할 것으 로 판단된다.

추출물의 환원력(Fig. 1)은 100~1,000 μg/mL 농도범위에서 농도 의존적으로 증가하였으며, 250 μg/mL 농도에서모두 1.000(OD700) 이상의 높은 환원력을 나타내었으며, RE(1.370), USE(1.262), AE(1.260), SE(1.184), LE(1.158) 순 으로 높았다. 이는 열처리에 의해 bound형 polyphenol이 free형 polyphenol로의 전환되고 저분자 polyphenol이 증가 하였기 때문인 것으로 판단되며(22), 달맞이꽃 추출물의 환원력은 양성 대조구로 사용한 BHA(1.537)와 비교하였을 때 낮았지만 단일 물질이 아니라는 점에서 우수한 환원력을 가지는 천연소재로 판단된다.

추출방법을 달리한 달맞이꽃 추출물의 ferrous ionchelating 효과(Fig. 2)는 500 μg/mL 농도에서 RE(90.14%), USE(86.34%), AE(83.40%), LE(71.02%), SE(64.69%) 순으 로 높았다. 일부 식품에 함유되어 있는 Fe2+나 Cu2+ 등은 hydroxy radical(-OH)과 superoxide radical(O2 -) 등의 생성을 촉진하여 식품의 지질산화를 가속화 시키므로 이러한 금속 에 대한 봉쇄 효과는 금속 촉매제로 인한 free radical의 생성을 억제(26)하므로 달맞이꽃 추출물은 지질산화를 방 지할 수 있을 것으로 판단된다.

Fig. 1. Comparison of reducing power of Oenothera biennis obtainedby different extraction methods. SE, stirrer extraction; USE, ultrasonification extraction; RE, reflex extraction; AE, autoclaveextraction; LE, low temperature high pressure extraction; BHA, butylated hydroxyanisole.

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항균 및 항산화 활성이 있고 비교적 구하기 쉬운 달맞이꽃을 천연 기능성 소재로 활용하기 위한 추출방법은 에탄올 을 이용하여 60℃에서 3시간동안 열처리하는 RE 추출법이 가장 효과적일 것으로 판단된다. 또한 달맞이꽃 에탄올 추 출물은 식물체의 주요 생리활성 성분인 폴리페놀 및 플라보 노이드를 많이 가지고 있으므로 이를 이용한 기능성 식품 소재로서의 사용할 수 있으나, 실용화를 위해 식품별 적용 효과, 추출방법의 정립 및 제품화 등 보다 광범위한 연구가 필요한 것으로 판단된다.

Fig. 2. Compar ison of fer rous ion chelating ability of Oenotherabiennis obtained by different extraction methods. SE, stirrer extraction; USE, ultrasonification extraction; RE, reflex extraction; AE, autoclaveextraction; LE, low temperature high pressure extraction; EDTA, Ethylenediaminetetraacetic acid.

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