곤드레 추출물의 최종당화산물의 생성저해 및 라디칼소거 활성

본 실험에 시료로 사용한 곤드레(Cirsium setidens)는 경북 영양군 수비면에서 2014년도 5월에 채취된 신선한 곤드레를 사용하였으며, 표본시료는 대구대학교의 식품공학과 천연물화학실험실에 보관하고 있다. 본 실험에서 사용된 시약으로bovine serum albumin(BSA), 3-morpholinosydnonimine (SIN-1), dihydrorhodamine123(DHR123), aminoguanidine, Folin and Ciocalteau's phenol reagent, gallic acid, 2,2'- azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid(ABTS), 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH), (+)-catechin 및 tacrine은 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA) 구입하여 사용하 였고, 그 외에 사용된 용매 및 시약은 모두 일급 이상의 등급을 사용하였다.

신선한 곤드레 5.0 kg을 메탄올로 침지추출을 3회 반복하여 여과한 후 농축하였다. 얻어진 곤드레 메탄올 추출물 (386.1 g)에 대해 물에 현탁하여 저극성 용매인 n-Hexane 으로 먼저 추출한 후 수층을 다시 ethyl acetate(EtOAc)와 n-butyl alcohol(n-BuOH)을 이용하여 각각 순차적으로 3회 분획하여 추출하였다. 각 용매추출 분획을 감압 농축하여 건조 시킨 후 각각 n-hexane 가용분획 (193.6 g), EtOAc 가용분획(28.6 g), n-BuOH 가용분획(72.3 g), 물 가용분획 (74.4 g)을 각각 얻었으며(Fig. 1) 각 분획물을 대상으로 라 디칼 소거능 및 최종당화산물 생성 저해능 평가를 수행하였 다.

Fig. 1. Liquid-liquid partition of the aerial parts of Cirsium setidens.

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곤드레 70% 에탄올 추출물의 전자공여능은 Blois 방법(22)에 따라 측정하였다. 각 시료용액에 120 μL에 0.45 mM 의 희석한 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 용액 60 μL 을 넣고 교반한 후 15분간 방치한 다음 517 nm에서 흡광도 를 측정하였다. 전자공여능은 시료용액의 첨가군과 흡광도 차이를 백분율로 나타내었다.

곤드레메탄올추출물의2,2'-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid(ABTS) radical 소거능을 Re(23)의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다. 7 mM ABTS(in water)와 2.4 mM K2O8S2동량을 혼합 후 실온, 암소에서 12시간 방치 하여 라디칼의 생성을 유도한 후 ABTS+ 라디칼 용액을 희석하여 734 nm에서 흡광도 값이 0.7~0.8 정도가 되도록 희석한 후 사용하였다. 희석한 ABTS+ 라디칼 용액 100 μL 와 곤드레 추출물 100 μL을 혼합하여 실온에서 7분간 반응 시킨 후 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 positive control로는 (+)-catechin을 사용하였으며 결과는 시료를 처 리하지 않은 군에 대한 %로 표시하였다.

최종당화산물 생성 저해활성은 Vinson 및 Howard 등이행한 방법(24)을 변형하여 실시하였다. 10 mg/mL의 알부민 (bovine serum albumin)을 0.2 M phosphate buffer(pH 7.4)에 용해시키고, 0.2 M의 fructose와 glucose를 처리한다. 이때 0.2 M phosphate buffer에 0.02% sodium azide를 넣어 반응기 간 동안 박테리아의 생성을 방지하였다. 이 반응액에 추출 물 또는 양성 대조군인 aminoguanidine을 첨가한 후 37℃에 서 7일 동안 반응시켰다. 배양 후에는 spectroflourometeric detector(Infinite F200, Tecan Austria GmBH, Grödig, Austria)를 이용하여 형광도(Excitation: 350 nm, Emission: 450 nm)를 측정하였다.

총 페놀성 화합물의 함량은 Folin-Denis 방법(25)에 따라측정하였으며, 추출물 혹은 분획물을 1.0 mg/mL 농도로 조제한 후, 시료 50 μL와 Folin-Denis 시액 50 μL, 0.7 M 탄산나트륨 포화용액 50 μL를 차례로 넣은 다음 이것을 잘 혼합하여 실온에서 60분 방치한 후 UV/VIS 분광광도계 로 750 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 표준물질은 gallic acid를 이용하여 표준곡선을 작성하여 양을 환산하였다.

보라색을 띄는 DPPH 라디칼은 항산화 활성이 있는 물질과 반응하게 되면 안정한 형태로 돌아가면서 색이 탈색되고 흡광도 값이 감소하는 원리(26)를 이용한 본실험의 결과로, Table 1에서 나타낸 것처럼 곤드레 메탄올 추출물 및 각 유기용매 분획에 대해서 DPPH 라디칼 소거활성을 평가한 결과, 신선한 곤드레 메탄올 추출물 IC50값은 48.1±2.1 μ g/mL 라디칼 소거능을 나타내었으며, 분획물 중 EtOAc층 의 IC50값은 67.9±3.6 μg/mL의 라디칼 소거능을 나타내었 다. 특히, n-BuOH 분획물의 IC50값은 24.3±1.7 μg/mL의 우 수한 라디칼 소거활성을 나타내어, positive control로 사용 된 천연 항산화 성분으로 잘 알려져 있는 (+)-catechin과 유사한 활성을 나타냄을 확인하였다. 한편, 물층과n-hexane 분획물의 IC50값은 각각 >500 μg/mL, 180.3±13.7 μg/mL의 비교적 약한 라디칼 소거능을 나타내었다. 최근 페놀성 화 합물의 함량과 DPPH 라디칼 소거능은 밀접한 상관관계가 있다는 보고(27)에 근거하여 곤드래 추출물의 항산화 활성 과 페놀성 화합물 함량과의 연관성을 평가한 결과, Table 1 및 4에서 나타낸 것처럼, DPPH 라디칼 소거능은 페놀성 화합물의 함량이 상대적으로 높은 EtOAc 및 n-BuOH층에 서 가장 높은 것을 확인하였고, 그중에서도 라디칼소거 활 성이 강한n-BuOH층에는 DPPH 라디칼 소거능이 높은 곤 드레의 항산화 활성이 우수한 페놀성 화합물의 존재를 시사 하였다. 또한 다양한 엉겅퀴(Cirsium)속 식물에서 발견되는 flavonoid 화합물(28)인 pectolinarin은 항산화활성 메커니즘 을 통한 간보호 작용을 나타내며(29), 곤드레 주요성분인 qunic acid 유도체인 3,4-di-O-caffeoylquinic acid, chlorogenic acid의 우수한 DPPH 라디칼 소거능활성이 보 고되어져 있다(30). 이들 보고된 화합물이외의 DPPH 라디 칼 소거능을 가진 활성성분의 분리 및 동정이 필요하다고 사료된다.

ABTS+ 라디칼 소거활성은 시료가 항산화력에 의해ABTS+이 소거되어 본래의 청록색이 탈색되는 정도를 측정 하는 방법으로 천연물로 부터 항산화활성물질 개발을 위한 연구에 광범위하게 이용되고 있다(31). 그 결과 Table 2에서 나타낸 것처럼 곤드레 메탄올 추출물 및 각 유기용매 분획 물에 대해 농도별 라디칼 소거능을 평가하여 활성을 IC50값 으로 나타내었으며, 특히 EtOAc 및 n-BuOH 분획층물의 IC50값은 각각 69.5±2.6 μg/mL, 25.0±3.3 μg/mL의 매우 우수 한 라디칼 소거능을 나타내었으며, 이들 활성은 positive control인 (+)-catechin의 활성에 상당하는 효능임을 확인하 였다. 한편, 물층과 n-hexane 분획층에서는 상대적으로 낮 은 라디칼소거 활성을 나타내었다(Table 2). 이상의 결과는 Table 4에서 나타낸 것처럼 페놀성 함량 상대적으로 높게 나타난 EtOAc 층 및n-BuOH 층에서 ABTS+ 라디칼을 소거 하는 항산화 활성물질의 존재가 시사되었다. 최근의 연구 결과에 의하면 곤드레에 존재하는 linarin, pectolinarin 등의 플라보노이드류(18) 이외의 qunic acid 유도체인 3,4-di-O-caffeoylquinic acid가 우수한 ABTS+ 라디칼 소거 활성을 나타내었으며(32) 이들 화합물을 포함한 n-BuOH 층에 존재하는 라디칼소거 활성물질의 동정이 필요하다고 사료된다.

최종당화산물은 고혈당의 조건에서 조직에 축적되는 단백질 당화산물로서 당뇨병 환자에서 정상인보다 수배 이상 함량이 증가하는 것으로 밝혀져 있어 당뇨병성 합병증과 밀접한 상관성을 갖는 중요한 요인으로 알려져 있다(33). 최근 AGEs의 생성은 당뇨합병증과 밀접한 관계가 있으며 당뇨합병증 치료 및 예방 전략으로 많은 연구가 진행되어 지고 있다. 최근에 개발된 대표적인 최종당화산물 생성 저 해제로는 aminoguanidine이 있으나 독성이 보고되어 보다 안전하고 부작용이 없는 천연물 유래 AGEs 생성 저해제의 개발을 위한 연구가 진행되고 있다. 본 연구에서 곤드레 추출물의 당뇨합병증관련 효능평가를 위해 수행한 실험의 결과 곤드레 메탄올 추출물의 IC50값은 각각 221.1±7.7 μg/mL의 효능을 나타내었고, n-BuOH 가용분획의 경우 IC50 값이 46.0±1.5 μg/mL의 상대적으로 강한 활성을 나타났다. 양성대조구인 aminoguanidine의 IC50값이 90.2±3.2 μg/mL 과 비교해볼 때n-BuOH 가용분획은 우수한 효능을 확인하 였다(Table 3). 최근의 한약재의 최종당화산물 생성저해활 성 1차 검색 연구(34)에 의하면 계피(Xanthium strumarium) 열매의 IC50 값은 16.1 μg/mL, 초과(Plantago asiatica) 80% 에탄올 추출물의 IC50 값은 31.4 μg/mL, 편축(Polygoni avicularis) 80% 에탄올 추출물의 IC50 값은 33.1 μg/mL의 최종당화산물 생성저해활성을 나타내었으며 이들의 활성 과 곤드레 메탄올 추출물의 n-BuOH 가용부에 상당하는 우수한 활성을 나타내었다. 최근 flavonoid류의 최종당화산 물 생성 저해활성과 관련된 구조-활성 상관관계가 보고되 어 aglycone에 당의 존재가 활성상승에 영향을 미치는 것이 밝혀졌으며(5), quinic acid 유도체의 우수한 최종당화산물 생성 저해활성이 보고(35)되어 져있어 향후 곤드레에 존재 하는 최종당화산물 생성 저해활성물질의 동정 및 활성기작 평가가 필요하다고 사료된다.

곤드레 추출물 및 각 분획물에 함유하고 있는 총페놀성화합물의 함량을 Table 4에 나타내었으며, 곤드레 메탄올 추출물은 1 g당 17.3±1.5 mg의 페놀성 화합물의 함량을 확인하였으며, 유기용매 가용부의 경우 n-hexane 가용부 <물 가용부<EtOAc 가용부<n-BuOH 가용부의 순으로 페놀 성 화합물의 함유량이 증가함을 확인하였다. EtOAc 분획물 은 1 g당 11.0±1.7 mg의 페놀성 화합물을 함유하는 것으로 나타났으며, n-BuOH 분획물이 15.2±1.6 mg으로 상대적으 로 높은 페놀성 화합물의 함유량을 나타내는 것으로 분석되 었다. 이상의 결과로 부터 곤드레 추출물의 DPPH 라디칼 소거능은 Table 2 및 3에서 나타낸 것처럼 페놀성 화합물의 함량이 상대적으로 높은n-BuOH 가용부 및 EtOAc 가용부 에서 상대적으로 높은 것을 확인할 수 있었으며, DPPH 라디칼 소거능과 페놀성 화합물 함량사이에는 밀접한 상관 관계가 있다는 보고(27)와도 일치하는 결과였다.