효소 처리한 돈혈 활용 철분분말제제 특성

본 실험에 사용된 돈혈은 2015년 2월에서 3월 사이 3차례에 걸쳐 공급받았으며, 공급받은 샘플은 혈액의 응고방지를 위하여 구연산나트륨(DAEJUNG, Siheung, Korea)을 첨가하여 냉암소에서 보관하며 1~2일 내로 사용하였다. 가수분해효소는 현재 시판되는 Alcalase, Protamex, Esperase, Neutrase, Thermoase 및 Flavourzyme의 단백질 가수분해효소를 사용하였다. Alcalase와 Neutrase는 Novo 사(Novo Nordisk, Bagsvared, Denmark)에서 구입하여 사용하였고, 나머지 효소는 Sein Corporation Ltd.(Daegu, Korea)에서 제공받아 사용하였다.

돈혈의 가수분해를 위한 효소처리는 동일한 혈액의 양에 단일 처리시 0.2%, 복합 처리시 0.1%를 각각 첨가하여 진탕배양기(Maxturdy 45, Wisd, Wonju, Korea)에서 공통 최적 활성온도인 55℃로 100 rpm으로 진탕하며 4시간 동안 가수분해 한 다음 60℃에서 열풍 건조한 뒤 분쇄하여 1 mm sieve로 거른 돈혈분말 시료를 직사광선을 피한 서늘한 곳에서 보관하며 실험하였다.

총 고형분 함량은 digital refractometer(Pal-3, ATAGO Co., Tokyo, Japan)를 사용하여 측정하였고 pH의 측정은 pH meter(ST3100, OHAUS, Parsippany, NJ, USA)를 이용하여 실온에서 측정하였다. 돈혈분말의 용해도 확인을 위하여 증류수 10 mL에 돈혈분말 0.1 g을 용해한 뒤 액상의 색도를 측정하였다. 색도 측정은 UV-spectrophotometer (UV-1800, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하여 측정하였으며 UV PC optional color analysis software를 이용해 명도(L), 적색도(a), 황색도(b) 값으로 변환하여 Hunter’s color value로 나타내었다. 이 때 대조구는 증류수를 사용하였으며 L=99.99, a=-0.11, b=-0.02의 값으로 측정되었다.

돈혈 분말의 무기질 함량은 습식분해법(wet digestion method)(15)으로 분석하였다. 시료 1 g에 65%의 HNO₃ 6 mL와 30% H₂O₂ 1 mL를 teflon bottle에 담은 후 이를 전처리 시험용액으로 하며, microwave digestion system(Ethos-1600, Milestone, Sorisole, Italy)을 이용하여 최고 600 W로 총 20분간 산분해를 실시한 다음, 전처리 과정을 거친 시료용액을 0.45 μm membrane filter(Milipore, New York, NY, USA)로 여과하여 유도결합플라즈마 원자방출분광기(ICP-IRIS, Thermo Elemental, Waltham, MA, USA)로 분석하였다.

돈혈분말의 생체 내 이용률을 측정하기 위하여, Miller 등(16)의 방법으로 실험하였다. 실험에 사용된 돈혈 분말의 양은 미리 측정된 분말 내 철분 함유량을 철분의 1일 권장섭취량 기준(최대 14 mg)으로 환산하여 사용하였다. 환산된 돈혈 분말과 증류수의 무게 합을 100 g으로 하여 용해 한 다음 6 N HCl을 이용하여 pH 2로 보정하였으며 0.1 N HCl에 녹아있는 16% pepsin 용액을 0.5% (w/w) 첨가하여 37℃ 진탕배양기(Maxturdy 45, Wisd, Wonju, Korea)에서 2시간 동안 진탕시켰다. 진탕 완료 된 시료 20 g을 투석막(dialysis tubing cellulose membrand, Sigma)이 모두 잠길 수 있는 비이커(약 250 mL)에 넣고 3차 증류수 25 mL과 0.5 N NaHCO3가 함유 된 투석막을 잠기도록 넣은 후 pH 5에 도달할 때 까지 37℃ 진탕배양기에서 75 rpm으로 진탕시켰다. 이때 0.5 N NaHCO3는 진탕 완료한 시료 20 g에 pancreatin-bile extract mixture을 5 mL 혼합하고 0.5 N KOH를 이용하여 pH 7.5로 보정한 양과 동일하게 첨가하였다. pH 5에 도달된 시료에 pancreatin-bile extract mixture 5 mL 첨가 후 37℃ 진탕배양기에서 75 rpm으로 2시간 추가 진탕 시켰다. 진탕 종료 후 투석막 안의 투석액을 membrane filter(pore size 0.45 μm, Advantec MFS, Tokyo, Japan)를 이용하여 철분생체이용률을 측정하였다. 돈혈분말로 만들어질 철분 보조제의 우수성을 확인하기 위하여 판매중인 철분 보충용 제품 1제품을 시중에서 구입하여 같은 방법으로 측정하여 비교하였다. In vitro 철분 생체이용률은 아래의 식을 따라 계산하였다.

국내 도축장에서 수급 받은 혈액에 6종의 단백질 가수분해 효소를 처리하여 pH, 총 고형분 함량 및 무기질 분석을 실시한 결과를 Table 1, 2에 나타내었다. 분석 결과 6종의 가수분해 효소 처리시 pH는 Thremoase 처리시 pH 6.65로 가장 낮게 측정되었으며, 총 고형분 함량은 6종의 효소처리 구간에서 모두 증가하였고 Thermoase 처리구에서는 2배 정도 증가한 것을 확인하였다. Kim 등(17)은 단백질 가수분해 효소 처리과정 중 총 고형분의 함량이 처리하지 않은 구에 비하여 상승하였다고 보고하고 있으며, Noh 등(18) 또한 상업적 효소를 이용한 가수분해 후 총 고형분 함량이 증가하였다고 보고하고 있어, 본 결과와 유사하였다. 무기질 분석 결과, 효소처리시 Fe, Ca, K, Mg, Na, 및 Zn 함량이Esperase 처리구에서 약 30% 높게 측정되었으며, Fe 흡수를 돕는 Zn의 경우 약 28% 높게 측정되었다. 용해도 확인을 위해 각 돈혈 분말을 1% (w/w) 농도로 증류수에 용해시켜 확인한 결과 Thermoase 처리시 가장 용해도가 높은 것으로 확인되었다.

Thermoase를 이용하여 돈혈의 분리도에 따른 무기질 분석 및 용해도 평가를 진행하였으며 그 결과는 Table 3,4에 나타내었다. 돈혈의 전혈, 응고혈 및 응고혈을 제외한 잔혈을 이용하여 동일한 조건에서 Thermoase를 처리한 결과, 전혈에 Thermoase를 처리한 구에서 158.11 mg/100 g으로 Fe 함량이 가장 높은 것을 확인하였다. 용해도 확인을 위한 1% 용해액의 색차 측정 결과 전혈의 Thermoase 무처리구 색차값인 69.44보다 감소한 것으로 나타났다.

Thermoase 0.2%, 4시간처리 후 열풍건조 조건 하에서 돈혈분말을 제조하여 생체이용률을 확인하였으며 그 결과를 Table 5에 나타내었다. 선정된 시중의 철분 보조제와의 비교한 결과, 돈혈 분말은 22.00%의 체내흡수율로, 시중의 철분 보조제의 체내 생체이용율 7.50%보다, 약 2.9배 높은 것으로 나타났다.

즉, 폐기되는 돈혈의 철분제제로서의 활용 가능성 검토 결과, Thermoase 0.2%, 4시간 처리 후 열풍건조를 거친 돈혈분말에서 Fe, Zn 등의 무기질 함량 및 용해도가 증가하는 것을 확인하였다. In vitro 생체이용률에서도 판매중인 제품에 비해 약 2.9배가 높으므로 돈혈의 철분제제로서의 개발시 생체이용율이 높을 것으로 판단된다.

가공처리가 간단하여 도살 직후 폐혈액을 수급하여 가공처리가 가능한 장점과 열풍건조를 거친 분말형태를 통하여 폐혈액의 활용도를 증가시킬 수 있을 것으로 기대되므로, 혈액 부산물 활용에 대한 제도적인 개선이 이루어져야 하며, 생체이용률이 높으면서도 저렴한 철분제에 대한 연구가 계속적으로 보고되고 있는 만큼(19-22) 현재 시중 판매 중인 제품과의 차별성에 대한 보완 연구가 진행되어야 할 것이다. 특히, 특유의 향 개선에 대한 제제연구가 추가적으로 더 진행되어야 할 것으로 사료된다. 또한 돈혈 수급에 있어서 구제역 등의 여파로 인해 일정한 공급이 원활하지 않고, 공급 루트 자체가 정형화 되지 않은 점 등의 문제점으로 인하여 철분제의 대량 생산시 어려움이 있을 것으로 예상된다. 2014년 농림축산식품부 및 농림축산검역본부 주체로 도축장 식육부산물 위생관리 매뉴얼이 발간되어 도축장의 위생관리감독 및 유통관리감독의 체계가 구축됨에 따라 추후 추가 연구 및 관리의 병행이 이루어진다면 국내 철분시장에서의 돈혈을 이용한 고부가가치 제품 창출에 도움이 될 것으로 판단된다.