장류용 주요 콩품종 및 Bacillus subtilis HJ18-9 균주에 따른 청국장의 품질특성 변화

본 실험에서 사용한 콩은 장류용으로 대원콩, 대풍콩, 새단백콩 및 태광콩(농협하나로마트, 수원) 4개 품종을 사용하였고, 발효 균주로는 선행연구에서 선발 된 메밀 속성장 유래 혈전 용해능과 항균활성이 뛰어난 저영양성 B. subtilis HJ18-9를 starter로 사용하였다(19).

청국장은 콩을 정선, 선별 및 세척 후 실온에서 24시간 침지하였고, autoclave(VS-1321-100, Vision Sci. Co., Seoul, Korea)를 이용하여 증자(121℃, 50 min) 하였다. 증자된 콩을 40℃이하의 온도로 방냉 한 후, 액체배지에 전배양 된 B. subtilis HJ18-9(600 nm, OD 0.5)를 원심분리(8,000 rpm, 10 min)하여 동일한 양의 saline용액으로 재현탁 한 후, 1% (w/w, 10⁶ CFU/mL)의 농도로 접종하여 발효(37℃, 48 hr) 하였다.

수분함량은 AOAC 법(20)에 따라 105℃ 상압건조법에 의해 분석하였다. 시료 2 g을 105℃ Dry oven(MOV-112, Sanyo Co., Ltd., Osaka, Japan)에서 항량이 될 때까지 건조시켜 백분율로 나타내었다.

원료콩 및 청국장의 아미노태 질소함량은 Formol 적정법(21)을 이용하여 측정하였다. 시료 10 g에 증류수를 10배 가하여 1분 동안 균질화(Homogenizer, Polytron PT-MR 2100, Kinematica AG, Lucerne, Switzerland) 한 후, 1시간동안 교반하여 원심분리(8,000 rpm, 10 min, supra 25k, Hanil Co., Ltd., Incheon, Korea)한 상층액을 시료로 사용하였다. 시료 5 mL에 중성 formalin 용액 10 mL과 증류수 10 mL을 넣은 본 시험과 시료액 5 mL에 증류수 20 mL을 넣은 공시험에 0.1 N NaOH를 이용하여 pH 8.4로 중화적정하여 아미노태 질소 함량을 산출하였다.

원료 콩 및 청국장의 암모니아태 질소함량은 Lee 등(22)의 방법에 따라 측정하였다. 시료액의 0.1 mL에 A용액과 B용액을 각각 2 mL씩 넣고 반응(37℃, 20 min) 한 후, microplate reader(Biotek Synergy Mx, Biotek Instruments, Winooski, VT)를 사용하여 630 nm에서 흡광도를 측정하였으며, (NH₄)₂SO₄를 사용하여 작성한 표준곡선을 이용 암모니아태 질소함량을 산출하였다.

A solution: phenol 10 g and sodium nitroprusside dehydrate 0.05 g in distilled water 1,000 mL

B solution: Na₂HPO₄·12H₂O 9 g, NaOH 6 g and NaOCl 10 mL in distilled water 1,000 mL

유리아미노산은 Kim 등(23)의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료 5 g에 70% 에탄올 100 mL을 가하여 균질화화한 후, 진탕추출(180 rpm, 30 min, SK-71 Shaker, Jeio Tech, Kimpo, Korea) 하였다. 추출액은 원심분리(8,000 rpm, 10 min)하여 상등액을 취하고 남은 잔사에 70% 에탄올 50 mL을 넣어 재추출한 후 진탕, 원심분리를 반복하여 상층액 모두 합하여 rotary vacuum evaporator(Rotavapor R-205, BUCHI, Flawil, Switzerland)로 감압농축하였다. 농축액은 70% 에탄올을 첨가하여 50 mL로 정용하여 시료 용액으로 사용하였다. 시료 용액은 0.45 μm의 syringe filter로 여과하여 Waters사의 AccQ-Tag Amino Acid Analysis 방법에 따라 유도체화하였다. 여과액 10 μL에 AccQ-Fluor Borate Buffer 70 μL를 넣고 잘 혼합한 후, AccQ-Fluor Reagent 20 μL를 가하여 혼합한 다음에 상온에서 1분간 방치하였다. 이를 Heating Block을 이용하여 55℃에서 10분간 가열한 후에 Acquity UPLCⓇ system(Waters, Milford, MA, USA)에 주입하여 Column(AccQ-TagTMUltraColumn　2.1×100 mm), Column temp.(55℃), Injection volume(1.0 uL), Flow rate(0.7 mL/min), Mobile phase(A, Eluent A; B,　Eluent B), Detection(UV 260 nm)의 조건으로 분석하였다.

유기산은 In 등(24)의 방법에 따라 측정하였다. 시료액을 취해 0.45 μm membrane filter를 이용하여 여과한 후 여액을 HPLC(NANOSPACE SI-2, Shiseido Co., Ltd., Tokyo, Japan) 를 이용하여 column(Unison UK-C18(250×4.6 mm, 3 μm)), detector(PDA 214 nm), mobile phase(25 mM KH2PO4 pH2.5), flow rate(700 μL/min), injectin volume(20 μL) 와 같은 조건으로 분석하였다.

단백질 분해 패턴 분석은 sodium dodecylsulfatepolyacrylamide(SDS-PAGE)분석을 실시하였다. 시료액에 SDS-PAGE용 sample buffer(0.05 M Tris-HCl [pH 6.8], 10% glycerol, 0.2%2-mercaptoethanol, 2%SDS, 0.1%bromophenolblue)를 첨가한 후, 가열(100℃, 5 min)하여 단백질 변성을 유도한 후 전기영동을 하였다. Sample buffer에 녹은 단백질을 12% separating gel로 이루어진 disc SDS-PAGE mini-gel(BioRad, Hercules, CA, USA)에 시료를 넣고 전기영동(100 V, 90 min) 하였다. 전기영동이 끝나면 gel에 분리된 단백질 bands 를 coomassie brilliant blue(CBB)로 염색하고 coomassie brilliant blue destaining 용액으로 탈색하여 단백질 분해 패턴을 분석하였다.

생균수 측정은 청국장 1 g을 멸균생리식염수로 단계 희석하고 plate count agar(Difco Lab. Detroit, MI, USA) 평판배지에 도말하여 37℃에서 24시간 배양시킨 후 나타난 colony를 계수하여 총균수를 측정하였다.

실험결과는 3회 반복으로 측정하였으며, 평균치간의 유의성 검증은 SPSS system(Statistical Pack-age for Social Sciences, SPSS Inc, Chicago, IL, USA) soft-ware package (version 12)를 이용, p<0.05수준으로 Duncan’s multiple range test에 의하여 검정하였다.

수분함량은 Table 1에 나타내었다. 원료콩의 경우 62.45~67.12%의 범위였으며, 품종별 수분함량은 대풍, 태광, 대원, 새단백 순으로 높게 나타났다. stater를 첨가하지 않은 전통방법으로 제조한 청국장(청국장c)과 starter를 첨가하여 제조한 청국장(청국장t)의 수분함량은 63.28~67.14%와 64.50~66.87%로 나타났다. 전통청국장(25)의 수분함량은 평균 57.0±3.1%로 보고된 바 있으며, 발아시킨 콩으로 제조한 청국장(26)의 경우 64.2%, 65.0%로 본 시료와 유사하였다. 이는 청국장의 증자 후, 방냉과정과 발효조건에 따라 차이를 보이는 것으로 보인다.

아미노태 질소함량은 Table 2에 나타내었다. 원료콩(a)의 경우 6.53~24.25 mg%로 대원, 새단백, 대풍, 태광의 순서로 나타났다. 청국장 c는 27.63~122.09 mg%, 청국장 t는 37.29~133.48 mg% 범위를 나타내었다. 그 중 새단백으로 제조한 청국장의 아미노태 질소함량이 가장 높은 값을 나타내었고 태광, 대풍, 대원으로 제조한 청국장 순서로 나타났다. 새단백은 단백질 함량이 48%이상으로 일반 콩(40%)보다 많은 단백질을 함유하고 있다. 청국장(t)의 경우 청국장 (c)보다 높은 아미노태 질소 값을 나타내어, 미생물 유래 단백질 분해효소로 인해 대두 단백질이 가수분해 되어 아미노산으로 더 많이 분해된 것을 알 수 있었다(27). 볏짚을 이용한 청국장 연구(28)에 따르면 48시간 발효한 청국장의 경우 169.8 mg%로 본 시료와 차이를 보였다. 이는 보통 볏집에는 Bacillus 뿐만 아니라 다양한 유산균 등 다양한 균이 분포되어 있고, 존재하는 미생물의 양에 따라 다른 발효양상을 보인 것으로 생각된다. 우수한 starter가 단백질이 풍부한 발효원이 접종되면, 발효효율 및 유용성분이 많아질 것으로 사료된다.

암모니아태 질소함량은 Table 3와 같다. 원료콩의 경우 26.92~47.95 mg%의 범위였으며, 대원, 새단백, 태광, 대풍 순이었다. 청국장 c는 45.45~156.36 mg%, 청국장 t는 28.02~121.13 mg%로 나타났다. 그 중 새단백이 가장 높은 값을 나타내었고 대원, 태광, 대풍으로 제조한 청국장순으로 낮은 값을 나타내었다. 아미노태 질소와는 반대로 청국장 c의 경우, 청국장 t보다 낮은 암모니아태 질소함량을 나타내어, 청국장 c는 단백질의 과도한 분해로 인해 더 많은 암모니아태질소를 생성하여 품질을 저하시킨 것을 알 수 있었다(29). 장류발효 균주를 이용한 청국장(30)에 따르면 암모니아태가 63~154 mg%를 나타내어 본 실험과 유사한 것을 알 수 있었다. 자연발효에 의한 발효의 경우, 다양한 미생물이 발효에 관여하게 되는 반면, 균을 접종한 경우, 접종 된 균주가 우점종이 되어 단일을 미생물분포를 나타내고, 이러한 미생물분포는 청국장 품질특성에 각각 다른 영향을 미치게 된다.

유리아미노산 함량 측정결과는 Table 4에 나타내었다. 원료콩과 청국장 c에서는 glutamic acid가 높은 함량을 보였고, 청국장 t 중에서 대원콩(7.85±0.51 mg%)과 대풍콩(11.14±0.63 mg%) 으로 제조한 청국장에서는 phenylalanine, 새단백(20.21±0.56 mg%)과 태광콩(10.04±0.49 mg%)으로 제조한 청국장에서는 glutamic acid이 높은 함량을 나타내었다. 감칠맛과 쓴맛에 관여하는 주요 아미노산의 프로파일을 Fig. 1 및 Fig. 2에 나타내었다. 감칠맛(glutamic acid 및 aspartic acid)의 양은 새단백의 경우, 원료콩(13.82±0.34 mg%), 청국장c(31.83±0.31 mg%), 청국장 t(20.71±0.60 mg%)으로 원료콩 보다 발효 시, 감칠맛 성분이 증가하였으며, 대원, 대풍, 태광의 경우, 원료콩 및 청국장 상태에서 큰 차이를 보이지 않았다. 쓴맛(valine, methionine, isoleucine, leucine 및 phenylalanine)은 콩보다 청국장에서 많은 양이 검출되어 균이 생성하는 단백질 분해 효소에 의해 단백질이 분해되면서 단맛을 내는 아미노산에 비해 쓴맛 아미노산이 더 유리된 것을 알 수 있었다(31). Bacillus sp. CS-17을 이용한 청국장(32)에서는 발효 48시간 후 phenylalanine이 가장 많이 함유되었고, leucine, lysine순이었다고 보고하였고, Bacillus sp. DC-2균을 이용하여 제조한 청국장(33)에서는 glutamic acid가 가장 많이 검출 되었고, phenylalanine, alanine 순으로 나타났다고 하였으며, 이는 본 실험과 일부 유사한 경향을 보였다. Park 등(34)은 청국장에 접종되는 균주에 따라 최종제품의 구수한 맛, 쓴맛, 그리고 단맛을 내는 아미노산의 함량이 변하고 이를 이용하여 청국장의 맛을 조정 할 수 있을 것이라고 보고하였다.

Fig. 1. Free amino acids content in soybean and Chunggukjang based on senses of umami taste. ¹⁾Glutamic acid, Aspartic acid. ²⁾Any means in the same soybean state (A-B) or soybean cultivars (a-d) followed by different letters are significantly (p<0.05) different by Duncan’s multiple range test.

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Fig. 2. Free amino acids content in soybean and Chunggukjang based on senses of bitter taste. ¹⁾Valine, Methionine, Isoleucine, Leucine, Phenylalanine. ²⁾Any means in the same soybean state (A-B) or soybean cultivars (a-d) followed by different letters are significantly (p<0.05) different by Duncan’s multiple range test.

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유기산 함량 측정결과는 Table 5에 나타내었다. 대풍, 새단백, 태광 원료콩의 경우, succinic acid(1,895~2,121 mg%)가 가장 높은 함량을 나타내었고, 다음으로 citric acid(614~822 mg%), acetic acid(156~306 mg%)순이었다. 청국장의 경우 starter 첨가 유무에 상관없이 lactic acid (163~896 mg%)가 가장 높은 함량을 나타내었고, 청국장 t는 청국장 c에 비해 oxalic acid, malic acid, acetic acid가 더 높은 함량을 보였다. 원료 콩에서 청국장으로 발효되면서 oxalic acid, citric acid와 succinic acid의 경우 그 함량이 감소하였고, malic acid, lactic acid와 acetic acid는 그 함량이 증가하였다. citric acid는 원료콩에 많이 함유 되어 있지만 청국장 관련 미생물의 에너지원으로 이용되면서 급격히 감소되고, lactic acid의 경우 내염성 젖산균에 의해 생성되는 것으로 추측되며, acetic acid의 경우Bacillus 의 작용으로 증가되는 것으로 보고되었다(35). 생약초를 첨가한 청국장(36)의 경우 lactic acid가 가장 높았으며, acetic acid, succinic acid, citric acid 순으로 나타나 본 연구와 유사한 결과를 보였다.

콩 품종별 starter첨가 유무에 따른 청국장의 SDS-PAGE 분석 결과를 Fig. 1에 나타내었다. 발효전 원료콩의 주된 단백질은 7~43 KDa인 반면 청국장 c와 청국장 t의 주된 단백질은 7~28 KDa로 나타났다. 이는 발효에 의해 고분자의 단백질이 분해되어 작은 분자량의 단백질이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 홍삼을 이용한 청국장(14)의 경우, 33 KDa 이하의 단백질로 분해되었으며, 특히 11 KDa 크기의 단백질이 주를 이루었으며, B. licheniformis B1을 이용한 청국장(37)의 경우 증자대두에서는 66 KDa이상의 분자량을 보였지만 발효가 시작되면서 작은 분자량이 증가하여 24시간 후에는 36 KDa이하로 감소하여 본 연구와 유사한 결과를 보였다. 새단백 청국장의 경우, 20 KDa에 원료콩에서는 관찰되지 않은 새로운 밴드가 확인되어 추후, 물질동정을 통한 확인이 필요할 것으로 사료된다.

Fig. 3. Analysis of soybean and Chunggukjang protein by SDS-page. A, Daewon; B, Deapung; C, Seadanbeak; D, Taekwang; a, soybean; c, conventional Chunggukjang; t, Chunggukjang fermented with B. subtilis HJ18-9.

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콩 품종별 starter첨가 유무에 따른 청국장의 총 균수의 변화는 Table 6에 나타내었다. 원료콩의 경우 3.80~5.67 log CFU/mL의 범위였으며, 태광, 새단백, 대원, 대풍 순이었다. 청국장(c)은 7.48~8.85 log CFU/mL, 청국장(t)은 7.86~8.46 log CFU/mL로 나타났다. 단백질 분해정도의 주요요소는 미생물의 종류 및 양인데, 청국장 c는Bacillus외에 유산균 등 다양한 세균이 관여하게 되어 단일균으로 제조된 청국장 t와는 다른 발효양상을 보일 수 있다. Ju 등(38)에 따르면 B. subtilis을 접종하였을 경우B. subtilis의 빠른 생육이 유산균과 같은 다른 균의 생육을 억제한다고 보고하였으며 발아콩을 이용한 청국장의 총균수는 10⁸~10⁹ CFU/mL로 본 연구 와 유사한 결과를 보였다(39).