반응표면분석법을 이용한 꾸지뽕의 블랜칭 처리 및 건조 조건 최적화

본 연구에서는 전라북도 순창군에서 수확한 꾸지뽕 (Cudrania tricuspidata) 열매를 사용하였으며, 구입한 시료 는 5℃에서 냉장보관 하였다.

꾸지뽕의 블랜칭 및 건조 조건 최적화를 위해 중심합성 계획법(central composite design)과 반응표면분석법(response surface methodology)을 적용하여 실험 설계를 하였다. 독립 변수(X_n)는 블랜칭 처리 시간(X₁), 건조 온도(X₂), 건조 시간 (X₃)으로 3단계(-1, 0, 1)로 부호화하였다(Table 1). 블랜칭 처리 시간, 건조 온도, 건조 시간 등의 독립변수들은 생균수 측정, 색차 등 예비실험을 통해 범위를 설정하였다. 그리고 독립변수에 영향을 받는 종속변수(Y_n)는 total polyphenol content(Y₁), total flavonoid content(Y₂), DPPH radical scavenging activity(Y₃), 색차(Y₄)로 설정하였고 측정 결과 값은 SAS software(SAS, Version 9.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 사용하여 분석하였다. SAS software에서 산출된 예측 모델식은 Mathematica(Mathematica, Wolfram, Champaign, IL, USA)에 대입되어 4D 그래프로 나타내었다. 그리고 각 4D 그래프를 superimposing함으로써 꾸지뽕의 블랜칭 및 건조 최적 조건을 설정하였다.

꾸지뽕은 90℃의 열수에서 60-240초 간 블랜칭 처리 후 20℃ 수도수에 3분간 침지하여 냉각하였다. 시료의 열풍 건조는 열풍건조기(OTEC-004-m, Ilwon freezer, Namyangju, Korea)를 이용하여 40, 60, 80℃에서 12-36시간 동안 건조를 진행하였다.

건조 시간에 따른 꾸지뽕의 수분함량(M_c)은 아래 식을 이용하여 계산하였다(22).

$M_c=\frac{M_t}{M}\times 100$

꾸지뽕의 생균수를 측정하기 위하여 생과 15 g과 멸균된 0.1% 펩톤수 135 mL를 stomacher(SH-001, SHIMSKYU, Tokyo, Japan)를 이용하여 균질화하였다. 균질한 현탁액은 연속 희석한 후 petrifilm(3M petrifilm, 3M Co., Minnesota, USA) 에 접종 후 37℃에서 48시간동안 배양하였다. 배양한 petrifilm의 집락수를 계수하여 g당 log colony forming unit(log CFU/g)으로 나타내었다(Fig. 1).

Fig. 1. Measurement of viable cell count of Cudrania tricuspidata according to blanching times. Mean with the difference letter (a-b) are by DMRT (p<0.05).

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꾸지뽕 시료는 중심합성계획법에 의해 설계된 조건에 따라 블랜칭 처리 및 열풍 건조되었으며, 잔여 수분에 따른 분석오차를 줄이기 위해 모든 시료를 동결 건조하였다. 동 결 건조를 통해 완전히 건조된 시료는 분쇄기(RT-02, Mill powder tech solutions, Tainan city, Taiwan)를 사용하여 분말 화 되었다. 분쇄된 분말은 sieve를 사용하여 60 mesh 크기로 선별하였다. 선별된 분말 1 g과 95% 에탄올 50 mL를 추출용 기에 넣은 후 마이크로웨이브 추출장치(Soxwave 100, Prolab, Fontenay, France)를 사용하여 240 W에서 10분 간 추출하였다. 추출액은 여과지(Whatman No.1, Whatman Co., Maidstone, England)를 사용하여 감압 여과되었으며, 여과액은 mass flask를 사용하여 100 mL로 정량 후 분석용 시료로 사용되었다.

꾸지뽕 추출물의 총 폴리페놀 함량(TPC)은 Folin-Denis 법(23)을 변형시켜 측정하였다. 먼저 추출액 100 μL에 Folin-Ciocalteu reagent 50 μL를 가한 뒤 2% Na2CO3 300 μL를 넣고 실온에 15분 간 반응시켰다. 반응이 끝나면 1 mL 의 증류수를 넣은 후 UV-spectrophotometer(Shimazdu Co. UV-2550, Tokyo, Japan)를 이용하여 725 nm에서 흡광 도를 측정하였다. 검량곡선은 gallic acid(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 표준물질로 작성하였다. 측정 결과는 mg of gallic acid equivalent per g(mg GAE/g)로 나타내었다.

꾸지뽕 내의 총 플라보노이드 함량(TFC)을 측정하기 위 해 aluminum colorimetric assay(24)를 사용하였다. 먼저 추 출액 70 μL과 증류수 430 μL를 넣은 다음 5% NaNO2 50 μL를 첨가하였다. 그리고 10% AL(NO₃)₃·9H₂O를 가한 뒤 상온에서 6분간 반응시켰다. 반응 후 1 N NaOH 500 μL를 첨가한 다음 UV-spectrophotometer를 이용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준 물질은 Rutin(Sigma-Aldrich Co.)을 사용하였으며 측정 결과는 mg of rutin equivalent per g(mg RE/g)으로 나타내었다.

꾸지뽕의 DPPH radical scavenging activity 측정은 Blois 의 방법(25)을 변형하여 사용하였다. 먼저 DPPH 시약은 0.0039 g 2,2-diphenyl-1-picryhydrazyl(Sigma-Aldrich Co.)에 100 mL 에탄올을 첨가 후 magnetic stirrer(PC-420D, Corning Co., Corning, NY, USA)로 2시간 동안 교반하여 제조하였다. 제조된 DPPH 시약은 100 μL 추출액과 섞은 후 30분 간 암실에서 반응시켰다. 반응이 완료된 시약은 UV-spectrophotometer를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측 정하였으며 결과값을 아래 식에 대입하여 DPPH 소거능으 로 나타내었다.

$\text{DPPH(\%)=[1-sample absorbance/blank absorbance)×100]}$

색도 측정은 꾸지뽕 표면을 색차계(CR-300, Minolta Co., Osaka, Japan)를 이용하여 측정하였다. 측정 전 표준 백색판 (L=97.78, a=0.39, b=2.05)으로 기기를 보정하였다. 꾸지뽕 시료 하나당 무작위로 3 부분을 측정하여 Hunter's color value인 명도(L, lightness), 적색도(a, redness), 황색도(b, yellowness) value를 구한 후 결과값을 아래 식에 대입하여 ΔE value로 나타내었다.

$\Delta E=\sqrt{\Delta L^2+\Delta a^2+\Delta b^2}$

실험구 간의 유의성을 확인하기 위해 IBM SPSS software(version 22, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하 여 Duncan’s multiple range test를 하였으며, 유의성 분석은 p<0.05 수준에서 진행되었다.

블랜칭 처리 후 나타나는 꾸지뽕의 생균수 변화는 Fig. 1과 같다. 수도수에 3분 간 침지시킨 control의 생균수는 5.49 log CFU/g이었고 90℃의 열수에 60초 간 블랜칭 처리 했을 때는 4.78 log CFU/g이었다. 그리고 90, 120, 240초 간 블랜칭 처리 시 생균수는 각각 4.22, 4.24, 4.16 log CFU/g 으로 control과 비교했을 때 유의적인 차이를 나타내었다 (p<0.05). 이와 유사하게 Kim 등(26)이 연구한 참취도 블랜 칭 처리 시간이 증가함에 따라 생균수가 감소하는 결과를 나타내었다. 과채류는 수확 후 저장 중 조직손상, 미생물에 의한 부패현상, 신선도 변화 등의 품질변화가 일어날 수 있기 때문에 블랜칭과 같은 열처리는 효과적인 미생물 저감 화 처리방법이 될 수 있다(26,27).

블랜칭 및 건조 조건에 따른 꾸지뽕의 건조 추세는 Fig. 2에 나타내었다. 꾸지뽕을 40℃에서 열풍 건조하였을 때 수분함량이 10% 이하가 되기까지 무처리구는 약 146시간 이 걸린 반면, 120초 간 블랜칭 처리한 군은 약 75시간, 240초 처리군은 63시간이 소요되었다. 실험 결과로 보았을 때, 블랜칭 처리를 하게 되면 꾸지뽕의 수분 감소 속도가 증가한다는 것을 확인할 수 있었다. 이와 유사하게 Chung 등(28)이 실험한 고추에서의 blanching 처리는 고추의 건조 율 향상 및 색의 보존에 효과적이었다고 보고하였으며 또한 Pirone 등(29)은 미성숙 sweet cherry를 블랜칭 후 건조 시 수분 이동량이 증가함과 동시에 특정 수분함량에 도달하는 데 필요한 시간이 단축되었다고 보고하였다. 이는 블랜칭 처리로 인한 cellular membrane 파괴 및 조직의 물리적 변화 와 연관이 있다고 서술하였다(30). 그리고 60℃의 건조온도 에서는 무처리구와 120초 처리군은 약 24시간, 240초 처리 군에서는 약 21시간 건조했을 때 10% 이하의 수분함량을 나타냈으며 건조온도 80℃에서는 처리구간의 차이가 거의 나타나지 않았다(Table 2). 이로 미루어볼 때 블랜칭 처리는 꾸지뽕의 수분 함량 감소가 빠르게 이루어지도록 하지만 건조 온도가 높아질수록 그 효과는 줄어드는 것으로 나타났 다. 비슷한 사례로 Borges 등(31)의 연구에는 바나나를 40℃ 에서 건조하였을 때 블랜칭 처리구와 무처리구 간의 차이가 명확했지만 70℃에서는 차이가 나타나지 않았는데, 이와 같은 건조 추세의 차이는 65℃ 이상에서 발생하는 바나나 전분의 gelatinization과 연관이 있다고 보고하였다(32). 따 라서 본 연구에서 80℃에서 건조 시 블랜칭 처리군과 무처 리군 간 건조 추세가 차이가 미미한 것도 꾸지뽕의 구조적 변화와 연관이 있다고 사료된다.

Fig. 2. Exper imental drying tendency of Cudrania tricuspidata depending on blanching times and drying temperatures. A, drying at 40℃; B, drying at 60℃; C, drying at 80℃. ●, non-treatment sample; ■, 120 sec blanched sample; ▲, 240 sec blanched sample.

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페놀 화합물은 다양한 식물에 존재하는 2차 대사산물로 써 독특한 맛과 향 그리고 건강에 도움이 되는 성분이기 때문에 페놀성 화합물의 함량 증가는 품질 향상에 기여할 수 있다고 알려져 있다(33,34). 블랜칭 및 건조 조건에 따른 꾸지뽕의 TPC는 Table 3에 나타내었으며, 적합 모델식은 Table 4에 나타냈다. ANOVA 분석 결과 모델은 5% 수준에 서 유의성을 나타내었으며, R²값은 0.9161으로 확인되었다. 그리고 처리조건 중 블랜칭 처리 시간이 TPC 변화에 5% 수준에서 유의적인 영향을 보였으나 건조 온도, 시간은 TPC 변화에 크게 많은 영향을 미치지 않았다(Table 5). 그리 고 Fig. 3에서 조건에 따른 TPC의 추세를 보았을 때, 블랜칭 처리 시간이 증가할수록 총 폴리페놀 함량은 서서히 감소하 는 것을 확인할 수 있었다. 이처럼 블랜칭 처리 시간 증가에 따른 TPC의 감소는 블랜칭에 의한 시료 조직의 연화로 인해 열수로 영양성분이 용출되었기 때문에 발생된 것으로 사료된다(35).

Fig. 3. Response sur face for total polyphenol content of Cudrania tricuspidata at constant values (TPC: 8, 8.3, 8.5, 8.7 mg GAE/g) as a function of blanching time, drying temperatures and drying times.

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블랜칭 및 건조 조건에 따른 꾸지뽕의 TFC는 Table 3와 같으며, 적합 모델식은 Table 4에 나타냈다. ANOVA 분석 결과는 Table 5에 나타내었다. 모델은 5% 수준에서 유의성 을 보였으며 R²값은 0.9186이었다. TFC에 영향을 미치는 조건은 건조 온도와 시간으로 두 조건 모두 5% 수준에서 유의적으로 영향력을 나타내었다. 반면 블랜칭 처리 시간 은 TFC에 큰 영향을 나타내지 않는 것으로 확인되었다. Dewanto 등(36)은 과실에 대한 열처리는 TFC를 유의적으 로 변화시키지 않는다고 보고하였는데, 본 연구에서 꾸지 뽕에 블랜칭으로 열처리를 했을 때 TFC가 큰 변화가 없는 것도 이와 관련이 있는 것으로 생각된다. Fig. 4에서 처리조 건에 따른 꾸지뽕의 TFC 변화 추세를 확인해보았을 때, 건조 온도가 증가할수록 TFC는 감소하였다. 이는 Jin 등 (37)이 다래과실을 열풍 건조하였을 때 나타난 결과와 비슷 한 경향을 나타내었다.

Fig. 4. Response surface for total flavonoid content of Cudrania tricuspidata at constant values (TFC: 50, 55, 60, 65 mg RE/g) as a function of blanching times, drying temperatures and drying times.

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블랜칭 및 건조 조건에 따른 꾸지뽕의 DPPH는 Table 3에 나타내었으며, 적합 모델식은 Table 4에 나타냈다. ANOVA 분석 결과 모델은 5% 수준에서 유의성을 보였으 며 R²값은 0.9303으로 나타났다. 처리 조건 중 DPPH에 영향 을 미치는 인자는 건조 온도와 시간으로 5% 유의수준에서 유의성이 있으며, 블랜칭 처리 시간은 크게 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다. 항산화 효과는 페놀성 화합물, 플라보노이드, 카로티노이드 등 식물의 2차 대사산물에 의 해 발생한다고 알려져 있다(38). 본 연구에서 DPPH가 건조 조건에 따라 뚜렷한 변화 추세를 보이지 않았는데(Fig. 5), 이는 건조 조건에 따라 꾸지뽕 내의 생리활성 물질의 증감 이 다르게 일어난 것이 원인이라고 추측된다.

Fig. 5. Response sur face for DPPH radical scavenging activity of Cudrania tricuspidata at constant values (DPPH: 38, 38.5, 39, 39.5%) as a function of blanching times, drying temperatures and drying times.

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블랜칭 및 건조 조건에 따른 꾸지뽕의 색차는 Table 3에 나타내었으며 적합 모델식은 Table 4에 나타냈다. ANOVA 분석 결과 모델은 5% 수준에서 유의성을 보였으며 R² 값은 0.9782으로 나타났다. 처리 조건 중 블랜칭 처리 시간과 건조 시간은 5% 유의수준에서 색차에 영향을 미쳤으며, 건조 온도는 0.1% 유의수준에서 영향력을 나타내었다 (Table 5). Fig. 6의 그래프를 분석해보았을 때 꾸지뽕의 건조 온도가 증가할수록 색차는 점점 증가하였으며, 동일 온도 및 시간에서 꾸지뽕을 건조했을 때 블랜칭 처리 시간 을 늘릴수록 색차는 점점 감소하는 추세를 보였다. 대부분 의 과채류에는 효소적 갈변을 유발하는 polyphenol oxidase(PPO)가 존재하며, 여러 연구 결과에서 열처리 공정 을 통해 과채류의 PPO를 불활성화하여 갈변을 억제한 바 있다(39,40). 따라서 본 연구에서 블랜칭 처리가 건조 시 색차를 감소시킨 결과는 블랜칭 처리가 꾸지뽕 내의 polyphenol oxidase를 불활성화시켜 효소적 갈변을 억제한 것으로 사료된다.

Fig. 6. Response surface for color difference of Cudrania tricuspidata at constant values (ΔE: 1, 5, 10, 15) as a function of blanching times, drying temperatures and drying times.

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공정의 최적화는 식품 산업에 있어서 중요 공정의 변수 모니터링과 고품질의 제품을 생산하는데 있어 중요한 부분 이며(21), 특히 건조 공정에서는 영양분 손실을 최소화할 수 있는 mathematical model을 산출할 수 있다는 장점이 있다(41). 꾸지뽕의 블랜칭 및 건조 공정의 최적 조건을 설정하기 위해서 각 조건별 추출물의 총 폴리페놀 함량, 총 플라보노이드 함량, 항산화 활성 그리고 색차 등의 contour maps를 superimposing하여 최적 범위를 예측하였다 (Fig. 7). 블랜칭 처리 시간 200-240초, 건조 온도 50-60℃, 건조 시간 24-30 시간 범위가 최적 조건으로 예측이 되었으 며 적합 모델식에 대입한 결과 TPC는 8.62 mg GAE/g, TFC 는 56.65 mg RE/g, DPPH는 40.26% 그리고 ΔE는 11.69 로 나타났다. 예측 결과에 대해 모델식을 검증하기 위해 예측된 최적 범위 내 임의의 조건을 선정하였다. 블랜칭 처리 시간 240초, 건조 온도 60℃, 건조 시간 24시간의 조건 에서 확인실험을 진행하였고 확인실험 결과 TPC, TFC, DPPH, ΔE는 각각 10.06 mg GAE/g, 49 mg RE/g, 44.99%, 10.53으로 나타났다(Table 6). 적합 모델식에 대입한 예측값 과 비교하였을 때, 총 폴리페놀과 총 플라보노이드 함량이 다소 낮은 값을 나타냈지만 실험값은 예측값의 86.5-116.71%로 나타나 추출조건의 유효성이 인정되었다.

Fig. 7. Superimposed response sur face of total polyphenol content, total flavonoid content, DPPH radical scavenging activity and color difference for optimal drying condition range of Cudrania tricuspidata extracts. (a), TPC-8.7 mg GAE/g; (b), TFC-60 mg RE/g; (c), DPPH-38.5%; (d), ΔE-10.0 as a function of blanching time, drying temperature and drying time.

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