루꼴라(Eruca sativa) 추출물의 항균활성과 피부장벽 개선 효과

루꼴라(Eruca sativa) 잎은 가락동 농수산물 시장에서 구 입하여 사용하였다. 신선시료 30-40 g에 에탄올 200 mL를 첨가하고 용매추출장치(ASE300 Accelerated Solvent Extractor, Dionex Corporation, Sunnyvale, CA, USA)를 이용 하여 50°C, 1,500 psi에서 20분 동안 추출하였다. 이후 건조 기(Modul spin 40, Biotron Corporation, Marysville, WA, USA)에서 40°C에서 24시간 동안 건조하고 실험에 사용하 였다.

항균효과는 agar disc diffusion방법(8)을 이용하여 측정 하였다. 즉, 시료액을 0.22 μm membrane filter로 여과하여 제균하고 멸균된 paper disc에 흡수시킨 후 시험용 평판배지 표면에 놓아 밀착시키고 각 균주(Bacillus subtilis, Escherichia coli, Candida albicans 분양기관: KCTC 생물자원센터) 의 배양조건에 따라 24-48시간 동안 배양한 다음 paper disc 주위의 clear zone 및 inhibition zone의 크기로 항균성을 조사하였다. 또한, 시간별로 항균작용이 어떤 변화를 보이 는지 알아보기 위해 broth dilition 방법으로서 time-curve를 작성하였다. 선행연구(7)에서 세포독성이 나타나지 않으며 여러 생리활성 효과를 보인 농도인 루꼴라 추출물 최종농도 가 50 mg/L이 되도록 맞추기 위하여 각각 균주 배양액 100 mL에 5 mg으로 처리한 후, 일정 시간별로 배양액을 채취하 였다. 채취한 배양액을 십진희석법으로 희석하고 각각 균 주평판배지에 접종하여 배양한 후, 생성되는 군락(colony) 의 수를 측정하고 colony forming unit(CFU)/mL로 환산하 였다.

케라티노사이트(Keratinocyte) 분화에 관련된 단백질인 인볼루크린(involucrin) 단백질 발현에 대한 루꼴라 추출물 의 영향을 분석하기 위하여 인공피부 실험을 시행하였다. MatTek Corporation(Ashland, MA, USA)에서 구입한 EpiDerm™ 3차원 피부모형 모델을 EPI-100-New maintenance medium(NMM, MatTek Co.)에서 24시간동안 안정화시킨 후 DMEM 배지(Gibco-BRL/Life Technologies, Grand Island, NY, USA)에서 배양하였다. 선행연구(7)에서 세포독 성이 나타나지 않으며 여러 생리활성효과를 보인 농도 50 mg/L 기준으로 맞추어 루꼴라 추출물을 처리하였다. 12시 간 처리 후에 인공피부를 면역조직화학 분석을 위해 수확하 였다. 인공피부 조직을 파라핀에 고정시키고 60°C에서 1시 간 동안 정치시킨 후 자일렌(xylene)으로 10분 동안 2회 반복 처리 및 100% 에탄올로 5분 2회 반복, 70% 에탄올로 5분 2회 반복 후 Tris-buffered saline(TBS)에서 10분 동안 배양하였다. 배양 후, 3% 과산화수소에 30분 동안 정치시키 고 TBS 버퍼로 3회 세척하였다. 세척 완료된 인공피부조직 을 1차 항체(rabbit anti-involucrin: 1:500, Santa Cruz Biotechnology, Carlsbad, CA, USA)를 1시간 동안 37°C에서 처리하였다. 이후 10분 간격으로 TBS로 5회 세척하고 2차 항체(mouse anti-rabbit IgG-HRP: 1:5,000, Santa Cruz Biotechnology)로 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 이후 10분 간격으로 TBS로 5회 세척하고 인공조직을 DAB chromogen(Dako, Glostrup, Denmark)이 포함된 3,3´- diaminobenzidine(DAB)버퍼에 2분 동안 정치시킨 후 증류 수를 넣어 반응을 종료하였다. 준비된 조직시료는 현미경 (Carl Zeiss Inc., Oberkochen, Germany)으로 관찰하였으며 이미지 정량분석 프로그램(image quantitative analysis software, NIH images, version 1.61)을 이용하여 분석하였다.

모든 실험은 독립적으로 3회 반복 시행하고 실험결과는 평균±표준편차로 표기하였으며, 통계적 유의성은 Student’s t-test로 하였으며 p 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하 다고 판단하였다. 통계분석프로그램은 Prism v3.0–statistical software(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)을 사용 하였다.

루꼴라 추출물에 대한 항균활성 측정은 디스크 확산법 (Disc diffusion method)을 이용하였다. 시료를 Dimethyl sulfoxide (DMSO) 10 μL에 10 mg이 되도록 만든 후, DMSO 만을 함유한 disc를 대조군으로 하고, 각 농도의 시료액을 포함한 disc를 시험균으로 광범위한 균들에 대한 항균효과 를 보기 위하여 그람양성균 대표로서B. subtilis, 그람음성 균 대표로서 E. coli, 효모균 대표로서 특히, 무좀균으로 잘 알려진(9) C. albicans를 균일하게 접종된 배지위에 올려 놓고 30°C에서, E. coli 만 37°C에서 48시간 동안 배양하여 disc주변의 투명환을 관찰하여 항균활성을 측정하였다(Fig. 1A). 대조군에서는 균의 증식이 억제되지 않았으나 루꼴라 추출물에 대하여는 항균활성이 나타났으며, 특히, 그람양 성균인B. subtilis에 대한 항균활성이 가장 높게 나타났다. 또한, 선행연구에서 보고(7)한 바와 같이 루꼴라 추출물에 대한 세포독성이 없으며 생리활성 효과를 보인 시료농도로 서 최종농도가 50 mg/L가 되도록 처리한 후, 시간별로 각각 시험군에 대한 항균작용을 알아보기 위해, time curve를 작성하였다(Fig. 1B). 대조군의 경우 시간이 경과함에 따라 균의 증식에 변함이 없었으나 추출물 시료처리 경우는 배양 12시간 경과 후, B. subtilis, E. coli, C. albicans 각각 대조군 에 대하여 61.5%, 43.9%, 26.1%의 증식 억제가 확인되었다. 즉, 모든 시험균의 증식이 억제됨을 확인 할 수 있었으며 Disc 확산법과 마찬가지로 그람양성균인B. subtilis에 대한 증식억제 효과가 가장 높게 나타났다. 또한, 다른 천연소재 중 우수한 항균효과를 보고된 바(10) 있는 소라쟁이 에탄올 추출물에 대한B. subtilis, E. coli 항균활성이 약하게 보이는 것과 비교하였을 때, 루꼴라 추출물(ES)의 높은 항균력으로 천연방부제 및 아토피 피부염 악화인자인 세균증식을 억제 (11)함으로써 피부염을 개선할 수 있는 천연물 기반의 소재 개발 가능성을 기대할 수 있을 것으로 생각한다.

Fig. 1. Anti-microbial effect of Eruca sativa extract (ES). A, a clear zone was examined around paper disc. 10% DMSO was used as a negative control; B, time-curve of ES against B. subtilis, E. coli and C. albicans. 10% DMSO was used as a negative control (●) and ES was dissolved in 10% DMSO to a final concentration of 50 mg/L (▲).

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피부장벽 기능 향상을 위한 케라티노사이트 분화에 관련 된 바이오마커로서 알려진 인볼루크린 발현에 대한 면역조 직화학 분석을 인공피부를 이용하여 시행하였다(12). 루꼴 라 추출물을 처리(50 mg/L)한 경우에 0.1% DMSO로 처리 한 대조군에 비하여 인볼루크린 발현이 뚜렷하게 증가하였 으며 동일농도로 처리된 합성물질 WY14643과 비교하였을 때에도 비슷한 발현양상을 보여 주었다(Fig. 2). 본 연구에 양성대조군으로 사용된 WY14643과 clofibrate등 합성화합 물들은 케라티노사이트 분화 증진에 영향을 주어 피부장벽 기능개선에 효과를 보이는 것으로 이미 알려져 있다 (13,14). 따라서 본 연구자들이 최근에 루꼴라 추출물이 독 성이 적은 안전한 물질로 보고한 바(7)와 같이 루꼴라 추출 물이 천연소재로서 피부장벽 기능 향상을 위해 활용가치가 높을 것으로 생각되며, 루꼴라 추출물 성분분석 결과로 플 라보노이드들에 대하여 보고된 바(15)와 같이 항균활성과 피부장벽 기능향상에 플라보노이드 성분들이 활성소재로 서 기능을 나타낸 것으로 사료된다.

Fig. 2. Immunohistochemical analysis of involucr in in a 3D skin equivalent model. WY14643 and Eruca sativa extract were treated at 50 mg/L concentration. 0.2% DMSO was treated as a control. The skin fragments were subjected to immunohistochemical analysis by using anti-involucrin antibody and observed by microscope. The area was analyzed by involucrin with image quantitative analysis software (NIH images, version 1.61.). Values are presented as mean±SEM. Differences were considered statistically significant when *p<0.05.

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