수확시기에 따른 까마중 열매의 유용성분 및 생리활성 변화

본 실험에 사용한 까마중은 2015년 10월에 채종한 자생 종의 까마중 종자를 2016년 4월 20일에 순천대학교약초원 에 파종하였으며, 까마중 열매의 결실기인 9월 27일부터 11월 1일까지 1주일 간격으로 6회 채취하였다(23). 채취한 까마중 열매를 동결건조 한 후 마쇄한 분말을 100 mesh 체로 걸러서 통과한 분말만을 시료로 사용하였다.

본 실험에 사용한 시약은 Sigma-aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였으며, 아미노산 분석은 AccQTag amino acids assay kit(Waters, Milford, MA, USA)를 사용하였다. 추출 및 분석에 사용한 용매는 시판 특급 및 일급 시약을 사용하였다.

유리당 함량은 Wilson 등(24)의 방법에 준하여 분석하였 다. 즉, 시료 5 g에 증류수를 가하여 교반시킨 후 100 mL로 정용하여 원심분리(50,000 rpm, 30 min)하고 상징액을 취하 여 여과(Whatman No. 2)하였다. 여과한 여액을 Sep-pak C₁₈으로 정제시킨 다음, 0.45 μm membrane filter(Millipore Co, USA)로 여과 후 HPLC system(1200 series, Agilent, Palo Alto, CA, USA)을 이용하여 수행하였으며, 검출기는 ELSD(1200 series, Agilent, Les Ulis, France), column은 carbohydrate column(250×4.6 mm, Agilent, Richardson, TX, USA)을 사용하였고, 이동상은 75% acetonitrile을 사용하였 다. 유속은 분당 1.0 mL였으며, 시료 주입량은 10 μL로 하여 실험을 진행하였다.

유기산 함량은 유리당의 방법과 동일하게 처리 후 HPLC system(Agilent, USA)을 이용하여 분석하였으며, column은 organic acid column(250×4.6 mm, Alltech Co., Deerfield, IL, USA)을 사용하였고, 이동상은 25 mM NaHPO₄를 사용 하였다. 유속은 분당 1.0 mL였으며, 검출 파장은 210 nm, 시료 주입량은 10 μL로 하여 실험을 진행하였다.

동결건조된 시료 1 g을 absolute ethanol 50 mL에 침지하 고 상온에서 3시간동안 150 rpm으로 교반하여 추출하였다. 교반은 Obital shaker(VS-201D, Vision scientific Co., Bucheon, Korea)를 사용하였으며 추출이 끝난 추출물은 Whatman paper No. 2로 filter 하였다. 시료에 에탄올을 증발 시키기 위해 진공회전증발농축기(N-1000S-W, Tokyo rikakikai Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 감압 농축하였다. 각 시료는 conical tube 에 넣어 초저온냉장고(MDF-794, Sanyo electric Co., Tokyo, Japan)에서 동결한 후 동결건조기 (PVTFD10R, Ilshin lab Co., Dongducheon, Korea)로 건조하 여 추출물의 분말을 얻었다. 까마중 에탄올추출물 동결건 조 분말들은 아래 Table 1과 같은 수율을 나타내었으며, 실험에 시료로 사용하였다.

페놀함량 측정은 Velioglu 등의 법을 변형한 방법(25)으 로 측정하였다. 1 mg/mL에 시료 5 μL에 10배 희석한 Folin-Ciocalteau 시약을 100 μL씩 첨가한 후 상온에서 5분 간 둔다. 반응 후 각 tube에 7.5% Na₂CO₃를 500 μL씩 첨가하 고 30℃에 90분간 반응한 다음 흡광도 725 nm 측정한다. 총 페놀함량은 100, 300, 500 및 1,000 μg/mL gallic acid를 이용하여 표준검량선을 작성하여 총 폴리페놀 함량을 시료 1 mg중에 μg gallic acid equivalent로 나타내었다.

전자공여능 측정은 Blois의 방법(26)을 수정하여 측정하 였다. 10, 50, 100, 500 μg/mL 농도의 sample 10 μL에 2×10^-4 mM DPPH 용액(dissolved in absolute methanol)을 90 μL 첨가하고 상온에서 30분간 반응한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능은 아래의 식과 같이 백분율(%)을 계산한 후 IC₅₀(50% inhibition concentration)값은 50% DPPH free radical을 제어시키는 시료농도를 계산하였다.

$\begin{array}{c}\text{전자공여능(\%)=(1-시료 첨가구의 흡광도/무처리 구의}\\ \text{흡광도}\hspace{0.17em}\hspace{0.17em}\text{)}\hspace{0.17em}\text{×}\hspace{0.17em}\text{100}\end{array}$

ABTS radical을 이용한 항산화력 측정은 ABTS^+• cation decolourisation assay 방법(27)으로 시행하였다. 7 mM 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)와 2.45 mM potassium persulfate를 혼합하여 4℃인 암소에서 overnight 동안 반응하여 ABTS^+•을 형성시킨 후 734 nm에 서 흡광도 값이 0.70(±0.02)이 되도록 phosphate buffer saline(PBS, pH 7.4)로 희석하였다. 시료 10 μL에 희석된 용액 90 μL를 첨가하여 정확히 5분 후 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS radical 소거활성은 DPPH scavenging activity 계산방법과 동일하게 백분율(%)로 계산한 후 IC₅₀(inhibitory concentration 50%)로 표현하였다.

RAW 264.7 세포는 10% FBS와 1% antibiotics가 첨가된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하 였다. 세포는 culture dish에 80-90% 정도 자랐을 때 계대배 양하였고 cell passage number는 20을 넘기지 않은 세포로만 실험하였다.

시료의 세포독성을 측정하기 위해 Green 등(28)의 방법 에 따라 3-(3,4-dimethyl-thiazolyl-2)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) assay를 실시하였다. RAW264.7 cell 세포가 1×10⁵ cells/mL의 농도가 되도록 96-well plate에 100 μL씩 분주하고 37℃, 5% CO₂ incubator에서 18시간 동안 배양하 였다. LPS(Lipopolysaccharide, Sigma, MO, St. Luis)와 시료 처리는 0.5% FBS가 첨가되어 있는 DMEM에 희석하여 24 시간 처리하고 0.5 mg/mL의 MTT 용액을 포함하는 배지로 교체하여 incubator에서 4시간 배양하였다. 배양 종료 후 상등액을 제거하고 각 well에 150 μL DMSO를 첨가하여 formazan 결정을 용해시켜 microplate reader(BioTek, Winooski, VT, USA)로 흡광도 540 nm로 측정하였다. 세포 독성은 시료 무처리군의 흡광도에 대비하여 백분율로 나타 내었다.

RAW264.7 세포로부터 생성되는 활성 질소종인 nitric oxide(NO)의 양은 Green 등(29)의 방법을 이용하여 세포 배양액 중 존재하는 NO²-형태를 Griess Reagent와 반응시켜 측정하였다. RAW264.7 cell을 1×10⁵ cells/mL 농도로 96-well plate에 분주한 후 시료를 농도별로 처리하여 24시간 배양 하였다. 세포배양 상등액 100 μL와 Griess 시약(A reagent, 1% sulfanilamide; B reagent, 0.1% naphthylethylendiamine in 25% phosphoric acid) 각 50 μL를 혼합하여 96-well plate에 서 10분간 반응시킨 후 microplate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. NO²- 표준곡선은 NaNO₂를 농도별로 조제하여 사용하였다.

모든 실험은 3회 반복하였으며, 실험결과를 SPSS 통계프 로그램(Statistical Package for Social Science, version 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 을 이용하여 평균값과 표준편 차를 산출하였다. 생리활성 실험은 Duncan's multiple test를 통해 그 유의성(p<0.05)을 확인하였다.

까마중 열매의 수확 시기별 유리당 함량을 측정한 결과 fructose, glucose, sucrose, maltose 4가지 유리당이 검출되었 으며, 주요 유리당은 fructose와 glucose로 나타났다(Table 2). 수확시기별 까마중 열매의 총 유리당 함량은 10월 18일 수확한 까마중에서 7.26%로 가장 높게 나타났으며, 10월 25일 수확한 까마중, 10월 11일 수확한 까마중 순으로 유리 당 함량이 높게 나타났다. 모든 시료구에서 fructose 함량이 가장 높게 나타났으며, 다음으로 glucose 함량이 높게 나타 났다.

Sucrose는 9월 27일 수확한 까마중 열매, 10월 4일 까마중 열매 및 10월 11일에 수확한 까마중 열매에서만 검출되었 으며, maltose는 9월 27일부터 10월 18일까지 수확한 까마 중에서만 검출되었다. 식물에 함유되어 있는 유리당은 항 산화 효과, 항염증 효과 등과 관련되는 것으로 알려져 있는 데(30), 기존 연구에서 인삼열매의 수확시기에 따른 유리당 함량은 개화 후 수확기가 늦어짐에 따라 총 유리당 함량이 증가하였으며, fructose 함량은 수확시기가 늦어짐에 따라 감소한다고 보고하여 본 연구와 차이를 보였다(31). 본 연구 에서 최종 수확시기인 11월 1일 수확한 까마중 열매에서 sucrose 및 maltose의 함량감소가 나타났는데, 까마중과 같 은 가지과 식물인 가지의 수확시기에 따른 유리당 함량은 수확시기가 늦어짐에 따라 glucose 및 sucrose 함량이 낮아 졌다는 보고(32)와 유사성을 나타내었다.

까마중 열매의 수확 시기별 유기산 분석결과 oxalic acid, malic acid, citric acid 및 acetic acid 총 4종이 검출되었으며, malic acid와 acetic acid의 함량이 모든 시료구에서 높게 나타났다(Table 3). 수확기별 총 유기산 함량은 10월 18일과 10월 19일에 수확한 까마중 열매에서 가장 높았으며, 10월 25일 수확한 까마중 열매, 11월 1일 수확한 까마중 열매와 10월 11월에 수확한 까마중 열매 순으로 높은 함량을 나타 내었다. 검출된 유기산 중 malic acid 함량은 10월 18일에 수확한 까마중 열매에서 가장 높게 나타났으며, 10월 11일 수확한 까마중 열매, 10월 4일 수확한 까마중 열매 순으로 높은 함량을 보였다.

기존 보고에서 까마중의 주요 유기산은 acetic acid, tartaric acid, malic acid 및 citric acid 라고 보고 된 바 있으나 (33), 본 연구에서는 tartaric acid는 검출되지 않았고, oxalic acid가 검출되는 차이점을 보였다.

수확시기에 따른 까마중 열매 ethanol 추출물의 총 polyphenol 함량을 측정한 결과는 Table 4와 같다. 10월 18일 에 수확한 까마중 열매 ethanol 추출물의 총 polyphenol 함량 은 311.26 μg/mg으로 가장 높게 나타났고, 10월 11일에 수확 한 까마중 열매 ethanol 추출물(289.33 μg/mg)과 10월 25일 에 채취한 까마중 열매 ethanol 추출물(278.12 μg/mg)에서도 높은 수준의 총 polyphenol 함량이 나타났다.

폴리페놀계 물질은 식물계에 널리 분포되어 있는 2차 대사산물 중 하나로 항산화 활성, 항암 및 항균 작용을 하는 생리활성물질로 알려져 있다(34). 까마중의 주요 폴리페놀 성분은 gallic acid, protocatechuic acid, epicatechin, rutin, caffeic acid을 비롯하여 다수의 성분들이 포함된 것으로 보고된 바 있으며(35), 항균, 항염증 및 항산화 효과를 나타 낸다고 알려져 있다(36,37) 본 연구 결과 10월 11일에서 10월 25일 수확한 까마중 열매 ethanol 추출물의 폴리페놀 함량은 까마중 열매 추출물의 총 폴리페놀 함량이 235 mg/g 이라는 기존의 보고(38) 보다 높게 나타났으며, 포도의 수확 시기에 따른 catechin 함량은 품종별로 차이가 있었지만 대부분의 품종에서 수확시기가 늦어짐에 따라 증가한다는 보고(39)와 유사한 결과를 보였다.

수확시기에 따른 까마중 열매 ethanol 추출물들의 DPPH radical의 소거능을 확인한 결과는 Table 5와 같다. 수확시기 에 따른 까마중열매 ethanol 추출물들의 DPPH radical 소거 활성은 10월 18일에 수확한 까마중 열매 ethanol 추출물과 10월 11일에 수확한 까마중 열매 ethanol 추출물에서 낮은 IC₅₀ 값을 나타내어, 높은 항산화 효과를 확인하였다. 다음 으로 10월 25일에 수확한 까마중 열매 ethanol 추출물, 10월 4일 수확한 까마중 열매 ethanol 추출물, 9월 27일에 수확한 까마중 ethanol 추출물, 11월 1일에 수확한 까마중 열매 ethanol 추출물 순으로 낮은 IC₅₀ 값을 나타내었다. 본 연구 결과 까마중 열매 ethanol 추출물의 DPPH radical 소거능은 까마중 지상부 ethanol 추출물(IC₅₀, 159.62-184.89 μg/mL) 와 지하부 ethanol 추출물(IC₅₀, 137.90-179.87 μg/mL)의 IC₅₀ 값(19)보다 낮게 나타나, 까마중 열매 ethanol 추출물의 항산 화 효과가 다른 부위 추출물보다 높음을 확인하였다.

까마중 열매 ethanol 추출물들의 ABTS 라디칼의 소거능 을 확인한 결과는 Table 5와 같다. 수확시기에 따른 까마중 열매 ethanol 추출물들의 ABTS radical 소거능은 10월 11일 에 채취한 까마중 열매 ethanol 추출물과 10월 18일에 수확 한 까마중 열매 ethanol 추출물들에서 낮은 IC₅₀ 값을 나타내 어, ABTS radical 소거활성이 가장 강하였으며, 10월 4일 수확한 까마중 열매 ethanol 추출물, 9월 27일에 수확한 까 마중 열매 ethanol 추출물, 10월 25일에 수확한 까마중 ethanol 순으로 높은 ABTS radical 소거작용이 나타났다. 대조구인 ascorbic acid는 2.84 μg/mL의 IC₅₀ 값을 나타냈으 며, BHT는 3.56 μg/mL의 IC₅₀ 값을 보였다. 또한 식물유래 항산화 물질은 인체내에서 생성된 자유라디칼의 활성을 억제하여 항산화 효과를 나타낸다는 기존 보고(40)와 같이 까마중 열매 ethanol 추출물은 천연 항산화제로서의 활용이 기대된다.

수확시기를 달리하여 수확한 까마중 열매 ethanol 추출물 들의 세포독성을 평가하고자 3-(3,4-dimethyl- thiazolyl-2)- 2,5-diphenyl tetrazolium bromide assay(MTT assay)를 수행 하였으며(41), RAW 264.7은 외인성 산화 스트레스로부터 세포보호효과 검정 및 염증을 유발하는 lipopolysaccharide (LPS)나 sodium nitroprusside(SNP)의 방어 기작 연구에 주 로 사용되는 세포주다(42). 까마중 열매 ethanol 추출물들의 세포독성 평가에서 까마중 열매 ethanol 추출물들을 10, 50, 100 μg/mL의 농도로 처리한 시험구들에서 100 μg/mL의 농도에서도 RAW 264.7 cell의 세포생존율이 90%이상을 나타내어, 세포독성은 없는 것으로 확인하였다(Fig. 1). 세 포독성은 나타나지 않았으나 세포 생존율은 까마중 열매의 수확시기가 늦어질수록 높아짐을 확인하였는데, 이는 까마 중 열매 결실기에 작은 열매에서는 독성을 유발 할 수 있는 solasodine의 함량이 높게 나타났으나 성숙함에 따라 solasodine의 함량은 낮아진다는 보고와 관련성이 높은 것 으로 생각된다(43).

Fig. 1. The effect of Solanum nigrum fruits ethanol extracts on the cell viability of RAW 264.7 cells. Mean with different superscripts (a-c) are significantly different at p<0.05 in same concentrations by Duncan's multiple range test.

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RAW 264.7 cell에 1 μg/mL LPS를 처리하여 NO 생성량이 13.23 μM로 증가됨을 확인하였으며, 10월 18일에 수확한 까마중 열매 ethanol 추출물을 10, 50, 100, 500 μg/mL의 농도로 LPS와 동시 처리한 배지에서 NO 생성량을 측정한 결과 10.3, 10.7, 10.1, 9.6 μM로 가장 낮게 나타났다(Fig. 2). 10월 11일에 수확한 까마중 열매 ethanol 추출물은 11.2, 11.0, 10.1, 9.4 μM의 NO 생성량을 보였으며, 10월 4일에 채취한 까마중 열매 ethanol 추출물 처리군의 NO 생성량은 11.6, 11.5, 11.2, 10.4 μM로 약간 감소하였다. 그리고 9월 27일에 채취한 까마중 열매 ethanol 추출물의 처리군에서 NO 생성량은 11.9, 11.5, 11.2, 10.6 μM로 나타났으나, 10월 25일 채취한 까마중 열매 ethanol 추출물과 11월 1일 채취한 까마중 열매 ethanol 추출물은 오히려 NO 생성량이 높아져 항염증 효과가 나타나지 않았다. 기존 연구에서 까마중 전 초는 항염증 작용과 진통작용이 있는 것으로 알려진 바 있으며(44), 본 연구 결과 항산화 효과와 항염증 작용은 연관관계가 있다는 기존 보고(19)와 유사성을 나타내었다. 본 실험의 폴리페놀 함량, 항산화 효과 및 항염증 활성은 연관성을 보였다. 항염증 실험 결과를 종합해 볼 때, 10월 18일에 채취한 까마중 열매 ethanol 추출물의 항염증 효과 가장 높게 측정되었으며, 10월 18일 이전에 수확한 까마중 열매 ethanol 추출물들은 농도 의존적으로 NO의 함량 감소 효과를 나타내었다.

Fig. 2. Anti-inflammation effect of Solanum nigrum fruits ethanol extract lipopolysaccharide(LPS)-induced on RAW264.7 cells. Mean with different superscripts (a-c) are significantly different at p<0.05 in same concentrations by Duncan's multiple range test.

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