서 론
호박(Cucurbita spp.)은 박목 또는 박과에 속하는 일년생 의 덩굴성 식물로 열대 아메리카 지역과 한국, 일본 등의 아시아 지역에서 자생하거나 재배되고 있으며(1), 다른 박 과 채소에 비하여 기후 환경에 대한 적응력이 높고 병해충 에도 비교적 강하여 농약사용이 적은 무공해 식품으로서 최근 그 가치가 더 높게 평가되고 있다(2). 호박은 크게 동양계 호박(Cucurbita moschata Duch.), 서양계 호박 (Cucurbita maxima Duch.), 페포계 호박(Cucurbita pepo L.) 등으로 구분되는데(1), 우리나라에서 재배되는 호박은 대 부분 동양계 호박으로(3) 애호박, 늙은 호박 등이 이에 속하 며(2), 재래종호박인 늙은 호박은 예로부터 약리적인 효과 를 기대하는 용도로 사용되어 왔다(1). 식품공전상의 호박 은 동양계 호박에 한하여 열매, 잎, 종자, 줄기 부위가 식용 으로 허가되어 있는데 반해, 서양계 호박은 열매와 종자만 식용이 가능하다. 국내에서 주로 열매, 잎, 종자를 주로 섭취 하고 있지만 줄기는 식품으로 이용되지 않고 있다. 호박잎 추출물은in vitro실험에서 항산화 및 항암효과가 보고되었 고(4), 호박의 과육부위의 탄수화물로는 포도당, 과당, 설탕 등이 주를 이루며, 세린과 아스파르트산 등의 아미노산 함 량이 높아 위장이 약한 사람이나 회복기의 환자, 부종의 완화(5). 늙은 호박 추출물의 지방세포에 대한 항비만 효과 등이 보고되고 있다(6). 또한, 염증억제 효능을 보인 소재로 서 출산 후 산후 조리나 미용의 목적으로 호박은 많이 섭취 되어 왔다(7). 호박 줄기의 일부분인 호박 덩굴손의 효능이 알려지며 상품화 되어 인기를 끌고 있으나 이에 대한 연구 는 미비한 실정이다. 지금까지 다양한 호박부위에 관한 연 구가 존재하지만(4-9), 호박 덩굴손에 존재하는 유효성분과 염증억제 활성은 보고되지 않았다. 또한, 경제성을 고려하 더라도 호박덩굴손은 원예농가에서 사용하지 않고 버리고 있어 농업부산물로서 이를 활용하여 염증억제효능을 지닌 소재를 발굴한다면 부가가치를 높이는 수단이 될 것이다. 이는 농가에서 버려지는 호박 덩굴손의 부가가치의 향상을 통해 농가의 2차 소득원 증대로 농가에 활력을 불어 넣어 줄 수 있을 것으로 기대된다.
본 연구에서는 호박 덩굴손 열수추출물 및 활성성분들을 분획·분리하여 염증억제 효능실험을 통하여 염증 억제 효 과에 대하여 검증하였다.
재료 및 방법
본 실험에 사용된 시료는 광주광역시 근교의 농가에서 시설 재배한 애호박(Young of Cucurbita moschata Duch.)과 쥬키니(Cucurbita pepo L.)의 덩굴손, 잎, 줄기, 열매, 꼭지 등을 시료로 사용하였고, 전라남도 순천시 농가에서 노지 재배한 늙은 호박(Old of Cucurbita moschata Duch.)의 덩굴 손, 잎, 줄기, 열매, 꼭지의 시료를 사용하였다. 그 외에 실험 에 사용된 모든 시약 및 용매는 HPLC등급을 사용하였다.
열수추출물은 호박 덩굴손 시료 200 g에 증류수 1,000 mL을 가하고 90℃에서 4시간동안 가열한 다음 원심분리하 여 상등액을 여과 및 감압농축(EYELA, Tokyo, Japan)후 -20℃, 48시간 냉동고에서 보관한 후 동결 건조(TFD8503 Ilshin Lab Co., Ltd., Siheung, Korea)한 시료를 사용하였다. 동결 건조된 호박덩굴손 열수 추출물은 3.5 g에 물 15 mL를 가하여 Diaion HP-20 레진에 충진된 컬럼(2.5 cm×20 cm, 50 mL)을 이용하여 물과 에탄올로 순차적으로 용매분획 하였다. 각 획분을 진공농축기(EYELA)를 사용하여 35℃에 서 감압농축하여 물 획분과 에탄올 획분으로 용매 분획하였 다(Fig. 1). 이중 에탄올층 획분을 이용하여 ODS column chromatography(Nacalai Tesque, Kyoto, Japan)과 Sephadex LH-20 column chromatography(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)를 이용하여 유효성분을 순수 분리하였다. 각 획분 의 정성분석을 위해 thin-layer chromatography(TLC, silica gel 60 F254, 0.2 mm, Merck, Darmstadt, Germany)에 spotting 하고, chloroform/ethyl acetate/acetic acid/H2O /methanol= 10:10:2:3:10 (v/v/v/v/v)를 전개용매로 하여 전개하여 분석 하였고, 정량분석은 high performance liquid chromatography (HPLC, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 다음과 같은 분석조건에서 실시하였다. ODS column(4.6×250 mm, ZOBRA 30 ODS-C18, Agilent, Santa Clara, CA, USA)을 사용 하였고, 분석파장은 254 nm를 이용하였고, 이동상으로는 acetonitrile의 농도구배(10, 20, 30, 60, 80, 100%-v/v)를 달리 하여 분석하였다. 유효성분인 rutin의 정량분석을 위해 표준 품인 rutin(Extrasynthese, Genay, France)의 농도(0.10, 0.20, 0.40, 0.80 mg/mL)를 달리하여 얻어진 피크 면적을 이용하 여 표준곡선을 작성하였다. 표준물질과 B4획분의 머무름 시간(retention time, RT)은 동일한 10.95분으로 조사되었다. 표준품인 rutin(10 mg/mL)과 B4획분(16.6 mg/mL)을 DMSO-d6에 용해시킨 후, 1H(500 MHz)와 13C(125 MHz) NMR(Nuclear magnetic resonance) spectrum을 분석하여 분 자구조를 확인하였다.
8 주령에서 12 주령 사이의 C57BL/6 수컷 생쥐의 대퇴골 (femur)과 NNN(tibia)에서 골수를 분리하였다. 30% L-sup, 10% fetal bovine serum(FBS), 1% penicillin streptomycin (PS), non-essential amino acid(NEAA) 및 sodium pyruvate가 첨가된 Iscov`s modified Dulbecco`s medium(IMDM)배지에 배양하였다. L-sup은 macrophage stimulating factor (M-CSF)가 포함되어 있으며, mouse fibroblast cell line 인 L929 세포를 키운 배지(10% FBS와 1% PS가 첨가 된 IMDM 배지) 상층액을 사용하였다. 150 mm petri-dish에서 37℃ 및 5% CO2 조건에서 6일간 배양하였으며, 배양 3일째 에 배지를 첨가하였다. 배양 6일째 48well plate에 2×105 cells/well의 밀도로 24시간 배양하였다.
세포에 대한 호박덩굴손 열수 추출물의 세포 독성평가를 위해 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide(MTT) assay를 시행하였다. Bone Marrow-Derived Macrophages(BMDMs)을 48-well plate에 2×105 cells/well의 밀도로 분주하여 호박덩굴손 추출물 및 lipopolysaccharide (LPS, 100 ng/mL)를 24시간 처리하였고, 상층액을 제거한 plate 에 노란색의 4 mg/mL MTT solution(tetrazolium)을 배지에 10 배 희석하여 200 μL/well에 넣고 37℃및 5% CO2 배양기에서 4시간 동안 빛을 차단해주었다(10). 보라 색을 띠는 비수용성의 formazan이 형성되면 MTT solution 을 제거한 후, dimethyl sulfoxide를 200 μL/well을 넣어서 용해시켰다. Microplate reader를 사용해서 570 nm로 측정 하며, control의 상대적인 정량값을 그래프화하였다.
호박덩굴손 열수 추출물 및 정제과정에서 얻어진 분획물 을 각각 2시간 동안 전처리하였다. 염증반응을 유발시키기 위해서 LPS를 100 ng/mL 농도로 처리해주었다(11). 24시간 후 상층액을 제거하여 Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay(ELISA)를 통해 염증성 사이토카인인 IL-6 및 TNF-α를 측정하였다. BMDMs을 48-well plate에 2×105/well의 밀 도로 분주하여 24시간 배양하였다. 추출물을 처리한 후 세 포에서 분비된 사이토카인을 측정하기 위해 상층액은 -80℃에 보관하였다. 384well plate에 capture antibody를 분주한 후, 코팅시키기 위해 상온에서 24시간 방치시켰다. Reagent diluent로 1시간 blocking시켰다. 세포 상층액을 넣고 2시간 동안 반응시켰다. 세척 후 detection antibody를 넣고 2시간 동안 반응시켰다. 세척 후 Streptavidin-HRP를 넣고 20분 동안 반응시켰으며 이 단계부터 빛을 차단해주었다. 세척 후 substrate solution을 첨가하여 20분 동안 반응시켰다. Stop solution(2 N H2SO4) 을 첨가한 후 microplate reader를 사용해서 450 nm로 측정하였으며, control의 상대적 정량값 으로 그래프화하였다(12).
결과 및 고찰
국내에서 재배되는 애호박덩굴손 200 g을 90℃에서 4시 간 동안 열수추출, 여과, 감압농축 및 동결 건조하여 최종적 으로 3.5 g의 열수 추출물을 획득하였다. MTT assay를 통해 열수 추출물(0.313 mg/mL-2.5 mg/mL)의 세포 독성 평가를 실시한 결과 모든 농도에서 독성이 없는 것으로 확인 되었 다(Fig. 2C).
호박덩굴손 열수 추출물에 대한 항염 효과를 실험하기 위해 LPS에 의한 염증반응 유발 시 염증성 사이토카인 IL-6 및 TNF-α의 발현이 증가한다고 알려져 있어서 positive control로 설정하였다. 호박덩굴손 열수 추출물의 항염효과 를 확인하기 위해서 호박덩굴손 열수 추출물을 2시간 전처 리하고 LPS를 처리하였고, 세포에서 분비된 염증성 사이토 카인을 측정하였다. 염증성 사이토카인을 측정한 결과 LPS 단독 처리군과 비교했을 때 1.25 mg/mL 또는 2.5 mg/mL 열수 추출물에서 IL-6와 TNF-α의 수치가 유의적으로 감소 한 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2A and B). 호박덩굴손 열수 추출물에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제를 확인하였 다. 특히 호박덩굴손 열수 추출물의 IL-6 감소 효과가 더 확연히 드러났다(Fig. 2A). 따라서 추후 연구는 호박덩굴손 열수 추출물로부터 활성 분획을 분리하여 실험을 진행하였 다.
호박덩굴손 열수 추출을 수행한 후 동결 건조한 호박 덩굴손 열수추출물 4.5 g을 물 15 mL에 녹여 Diaion HP-20 레진에 충진된 컬럼을 이용하여 물과 에탄올로 순차적으로 용매분획을 실시하여 최종적으로 물 획분 980 mg과 에탄올 획분 2,900 mg의 용매 분획물을 얻었다(Fig. 1). 이중 에탄올 층에서 얻어진 획분을 ODS 컬럼 크로마토그래피(Nacalai Tesque)에 로딩하여 acetonitrile 농도구배(0, 20, 40, 60%-v/v)를 이용하여 4개의 획분(A-1,215 mg. B-250 mg, C-1,224 mg, D-114 mg)을 얻을 수 있었다. 얻어진 4개의 획분에 대해 염증억제효과를 분석한 결과 B와 D 획분이 효과적인 억제활성을 보였다. 활성을 보인 B획분과 D획분 으로 부터 항염활성을 보이는 유효성분으로부터 Sephadex LH-20과 ODS 컬럼 크로마토그래피를 통해 5개의 획분 (B1-143 mg, B2-43 mg, B3-6.5 mg, B4-4.4 mg, B5-53 mg)을 얻을 수 있었으며, D획분으로 부터는 3개의 획분(D1-91 mg, D2-19.5 mg, D3-2.5 mg)을 얻을 수 있었다. 동일한 방법으로 각각의 얻어진 획분에 대한 염증억제효과를 분석 한 결과 B4획분과 D3획분에서 효능이 확인되었다. 구체적 으로 호박덩굴손 유래 열수 추출물의 유효성분의 항염 활성 을 확인하기 위해 0.1 mg/mL-1.0 mg/mL의 농도의 B4와 D3을 2시간 전처리하고 LPS를 반응시킨 후 염증성 사이토 카인을 측정하였다. LPS 단독 처리군과 비교했을 때 IL-6은 1 mg/mL에서 억제됨을 확인하였다(Fig. 3와 Fig. 4). 특히 B4 및 D3획분에서 높은 IL-6생성 억제능을 보였고 동일한 방법으로 TNF-α를 측정한 결과 IL-6과 마찬가지로 대부분 의 활성물질의 1 mg/mL 농도에서 억제됨을 확인할 수 있었 고 D3와 B4획분이 IL-6 및 TNF-억제능을 보여 항염증 활성 의 주요성분임을 알 수 있었다. B4와 D3획분의 구조해석을 통한 유효성분의 검증을 위해 1H또는 13C-NMR(Nuclear Magnetic Resonance)을 시도하였으나 D3의 구조해석에는 도달하지 못하였다. 염증억제 활성이 강한 B4성분은 표준 품인 rutin과 동일한 머무름 시간(10.95분)을 보였고, 1H-과 13C-NMR spectrum의 비교를 통해 rutin(quercetin-3-Orutinoside) 과 동일 구조임을 확인하였다.
Rutin(B4획분): 1HNMR(chemical shift δ in ppm, coupling constant J in Hz) 12.62(1H, s, C5-OH), 10.86(1H, s, C7-OH), 9.71(1H, s, C4’-OH), 9.21(1H, s, C3‘-OH), 7.56(1H, dd, J=9, 2.1, C6‘-H), 7.55(1H, d, J=2.1, C2‘-H), 6.86(1H, d J=9, C5’-H), 6.40(1H, d, J=2, C8-H), 6.21(1H, d, J=2.0), 5.35(1H, d, J=7.4, H1-G), 5.12(1H, d, J=1.9, H1-R), 1.00(3H, d, J=6.1, CH3-R); 13CNMR(chemical shift δ in ppm) 178.2, 164.9, 162.1, 157.5, 157.3, 149.3, 145.6, 134.1, 122.5, 122.0, 117.1, 116.1, 104.8, 102.2, 101.6, 99.5, 94.5, 77.3, 76.7, 74.9, 72.7, 71.4, 71.2, 70.8, 69.1, 67.9, 18.6[R과 G는 각각 람노스와 포도당으로 표시한다].
기존의 다른 식물유래 rutin에 관한 연구에서 항염증에 관한 연구보고들과 유사하게 호박 덩굴손유래에서 단리·정 제된 rutin도 염증억제 활성을 보였다(13-15). 호박덩굴손으 로부터 얻어진 유효성분인 rutin은 본 연구를 통해 처음으로 단리·정제 및 염증 억제능을 확인할 수 있었고, rutin의 기본 어글리콘인 quercetin의 유도체에 대한 연구도 함께 진행된 다면 보다 강력한 염증억제소재 개발이 가능하리라 사료된 다.
각 호박 종류별 유효성분을 포함하는지 여부를 확인하기 위해 애호박, 쥬키니 호박, 늙은 호박의 덩굴손, 열매, 꼭지 또는 잎의 성분을 조사하기 위해 추출물에 포함된 성분을 HPLC를 통해 조사하였다(Fig. 5). 호박부위별로 조사한 결 과, 유효성분인 B4는 호박 열매, 꼭지, 잎에 비해 호박 덩굴 손 부위에서 확인되었다. 호박종류별 덩굴손 시료 분석결 과, B4는 애호박, 늙은 호박 및 쥬키니 호박에서 원물대비 0.02, 0.035 및 0.04% 함유하였고, 동아에서는 검출되지 않 았다(Fig. 5). 특히, 쥬키니 호박에서 B4의 유효성분을 더 많이 함유하였고, 동아의 경우 B4의 성분을 포함하지 않아 항염증 소재로는 적합하지 않았다. 최종적으로, 항염증활 성의 유효성분인 B4인 rutin은 호박부위 중 덩굴손에 현저 하게 많이 포함되었고, 염증억제를 위한 식·의약소재로 대 량추출 정제를 위해서는 애호박, 늙은 호박, 또는 쥬키니 호박이 적합하리라 사료되었다.
요 약
애호박의 부위 중 덩굴손 유래의 열수 추출물에 대한 세포 독성 및 염증제어활성 대하여 조사하였다. 애호박 덩 굴손의 열수에 대한 세포의 독성에 미치는 영향을 조사한 결과 0.313-2.5 mg/mL의 농도일 때 물 추출물은 세포의 생장에 영향을 미치지 않아 세포에 대한 독성이 없다고 판단되었다. BMDMs를 배양한 세포에 호박덩굴손 열수 추출물과 LPS와 함께 처리한 결과 염증성 사이토카인인 IL-6 및 TNF-α의 농도 의존적으로 감소함을 확인하였다. 호박 덩굴손 열수 추출물로부터 단리·정제된 rutin에 의한 염증성 사이토카인의 분비가 억제되었다. 국내에서 재배되 고 있는 호박의 부위별로 조사해본 결과 호박부위 중 유일 하게 덩굴손부분에서 염증억제 활성을 보였다. 쥬키니 호 박, 애호박 및 늙은 호박의 덩굴손에서 유효성분인 rutin을 함유하고 있었고 향후 염증 억제 소재로서의 활용가능성을 시사하였다.
