갈색거저리 동충하초의 Streptococcus thermophilus KCCM 3782 유산균 발효에 따른 물리화학적 특성과 산화방지 활성 비교

본 연구에 사용된 갈색거저리 동충하초는 중국 산동성농 업과학원 자원 및 환경연구소에서 구입하여 이물질을 제거 하고 분쇄하여 -50℃에서 보관하면서 시료로 사용하였다.

본 연구에 사용된 7종의 유산균주는 KCCM(Korean Culture Center of Microorganisms)에서 분양 받은 유산균주 (Lactobacillus bulgaricus KCCM 3635, Lactobacillrus lactis KCCM 2013, Enterococcus faecalis KCCM 3206, Streptococcus thermophilus KCCM 3782, Bifidobacterium breve KCCM 3441) 5종과 임실치즈앤식품연구소에서 제공 받은 김치에서 분리한 유산균주(Lactobacillus sakei ALJ 011, Pediococcus pentosaceus ALJ 016) 2종을 사용하였다.

사용 용매인 ethanol(HPLC용), acetonitrile(HPLC용) 및 methanol(HPLC용)은 J. T. Baker사(Phillipsburg, NJ, USA) 사용하였고, DPPH용액 및 potassium persulfate는 Sigma- Aldrich사(St. Louis, MO, USA), Folin-Ciocalteu reagent는 Millipore사(Darmstadt, Germany) 것을 구입하여 사용하였 고, BCP 배지는 Eiken chemical사(Tokyo, Japan) 것을 구입 하여 사용하였다.

갈색거저리 동충하초 추출물은 건조된 자실체를 분쇄하 여 30 g에 10배의 증류수를 넣고 80℃에서 30분간 열수환류 추출한 후 추출액을 여과(Whatman No.2) 하였다. 이 추출여 액을 rotary vacuum evaporator로 50℃ 수욕상에서 감압 농 축 후 증류수 100 mL로 정용하여 사용하였다.

갈색거저리 동충하초 발효 우수 균 선정 분석 조건은 건조된 자실체를 분쇄하여 30 g에 10배의 증류수를 넣고 80℃에서 30분간 열수환류추출한 후 추출액을 여과 (Whatman No.2) 하였다. 이 추출여액에 5%의 sucrose를 넣고 7종의 유산균을 각각 첨가하여 37℃로 1, 3, 6, 12, 24시간 동안 배양하면서 DPPH 자유 라디칼 소거활성을 측정하였다. 발효물 제조는 위와 같은 방법으로 전 처리 하였으며, 배양 6시간째 항산화 활성이 가장 높게 나타난 Streptococcus thermophilus KCCM 3782를 우수 균으로 선 정하고 37℃로 6시간 동안 배양하였다. 배양 후 발효액을 rotary vacuum evaporator로 50℃ 수욕상에서 감압 농축 후 증류수 100 mL로 정용하여 사용하였다.

갈색거저리 동충하초 열수 추출물과 유산균 발효물의 일반성분 분석은 AOAC 표준분석법(24)에 따라 실시하였 다. 수분은 105℃ 상압가열건조법, 회분은 550℃ 회화처리, 조단백질의 함량은 Kjeldahl법, 조지방은 Soxhlet 추출법으 로 측정하였다.

본 연구의 무기성분 분석은 습식분해법(25)으로 전처리 하여 분석 하였다. 시료 0.5 mL에 진한 질산 10 mL를 가하여 heating plate에서 백연현상이 일어날 때 까지 가열 시킨 다음 질산 0.5 mL를 가한 후 증류수 100 mL로 정용하여 검액으로 하였다. 각 무기성분의 정량은 원자흡광비색계 (Perkin Elmer Analyst 300, Perkin Elmer Co., Norwalk, CT, USA)로 각 원소(K; 766.5 nm, Mg; 285.2 nm, Na; 589.0 nm, Ca; 422.7 nm, Fe; 248.3nm, Zn; 214.9 nm)의 표준용액 농도를 1, 3 및 5 ppm으로 조제하여 표준검량 곡선을 작성하 여 분석하였다.

본 연구의 아미노산 분석은 Ohara와 Ariyosh의 방법 (26)으로 분석하였다. 시료 10 g에 증류수를 혼합하여 100 mL로 정용한 다음, 원심분리하여 상징액 10 mL를 취해 sulfosalicylic acid 25 mg을 가하고 4℃에서 4시간 동안 방치 후 원심분리 하였다. 그 상징액을 0.45 μM membrane filter로 여과한 여액을 아미노산 자동분석기(Biochrom30+ Amino Acid Analyzer, Cambridge, UK)를 이용해 분석하였다.

시료용액의 조제는 각각의 시료 1 g과 증류수 100 mL를 넣어 110℃의 열탕 속에서 1시간 추출하였다. 실온으로 냉 각한 후 4,000 rpm에서 10분간 원심분리 하고 그 상징액을 0.45 μM membrane filter로 여과하여 정제한 후 HPLC(1260 Series, Agilent Co., Darmstadt, Germany)로 분석하였다(27). 분석용 컬럼은 C₁₈(4.6×100 mm, Waters, Milford, MA, USA) 을 사용하였고, 이동용매는 20 mM potassium dihydrogen phosphate buffer KH₂PO₄를 사용하였으며, 이동상의 속도 는 0.5 mL/min, 시료 주입량은 10 μL 사용하였다. 분석 온도 는 25℃를 유지하고 표준물질(cordycepin)을 시료와 동일한 조건에서 분석하여 머무름 시간을 비교해 확인하였으며, 검량곡선으로부터 그 함량을 산출하였다.

시료를 일정량 취해 색도계(super color sp-80, Tokyo Denshoku Co., Tokyo, Japan)를 이용해 X=80.84, Y=82.22, Z=92.98인 표준 백색판(standard white plate)으로 보정하여 사용하였다. 측정값은 명도를 나타내는 L 값(lightness), 적 색을 나타내는 a 값(redness) 및 황색을 나타내는 b 값 (yellowness)으로 나타내었다.

DPPH 자유 라디칼 소거활성은 Blois의 방법(28)의 방법 에 따라 시료의 1.1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl(DPPH)에 대 한 수소공여 효과로 측정하였다. 일정 농도의 시료 2 mL에 2×10-4 M DPPH용액(dissolved in 99% methanol)을 1 mL 첨가하고, vortex mixing하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 이 반응액을 흡수분광광도계를 사용하여 528 nm에서 흡광 도를 측정 하였다. 전자공여능(electron donating ability, EDA(%)으로 측정하였으며, 3회 반복 실험하여 얻은 결과 를 평균과 표준편차로 나타내었다.

ABTS 자유 라디칼 소거활성은 과황산칼륨(potassium persulfate)의 반응에 의해 생성된 ABTS radical이 시료내의 항산화 물질에 의해 제거되면서 청록색으로 탈색되는 것을 이용한 방법(29)이다. 2.4 mM potassium persulfate 용액을 7 mM ABTS가 되도록 용해시킨 다음 암소에서 24시간 동안 반응 시켰다. ABTS solution을 형성 시킨 후 734 nm에 서 흡광도 값이 0.70±0.02가 되게 증류수로 희석하였다. 희석된 용액과 각 추출물을 1:1로 혼합 한 후 734 nm에서 흡광도를 측정하였다.

SOD activity는 Marklund와 marklund(30)의 방법에 따라 각 시료 0.2 mL에 tris-HCl 완충용액(50 mM tris+ 10 mM EDTA, pH 8.5) 2.6 mL와 7.2 mM pyrogallol 0.2 mL를 가하 여 25℃에서 10분간 반응시킨 후 1 M HCl 0.1 mL를 가하여 반응을 정지시키고, 반응액 중 산화된 pyrogallol의 양을 420 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실험결과는 3회 반복 측정하여 SPSS program을 사용하 였고, mean±SD을 구하였으며 Duncan’s multiple range test 로 시료간의 유의차를 다중 비교법으로 분석하였다. 독립 된 두 집단의 평균값 비교는 두 표본 t-검정(two sample t-test)을 이용하여 집단 간의 차이를 분석하였다.

갈색거저리 동충하초의 물과 주정 농도에 따른 추출물의 DPPH 자유 라디칼 소거 활성을 측정한 결과는 Fig. 1A와 같다. 추출 방법은 열수 추출과 주정 농도 30%, 50%, 70% 및 100%로 환류추출 하였으며 이중 열수 추출물이 74.81 EDA(electron donating ability)%로 가장 높은 활성을 보였 다. 주정 추출물의 경우 ethanol 30% 농도에서 70.31 EDA% 활성을 보였고 농도가 증가할수록 활성이 낮아졌다. 천연 소재에는 다양한 기능성을 함유하고 있으며, 기능성 성분 을 추출하기 위해 여러 추출용매를 사용하게 된다(31). 하지 만 식품에서는 직접 섭취를 통해 기능성 성분의 효능을 볼 수 있기 때문에 물과 주정으로 제한을 하고 있다(32). 또한 산업화 측면에서 주정을 사용할 경우 원가 상승으로 인해 사업성이 떨어지는 문제점이 있다. 따라서 위의 갈색 거저리 동충하초 항산화 활성을 측정한 결과 물 추출물에서 가장 높게 나와 식품으로써의 활용 가치가 충분할 것으로 사료된다.

Fig. 1. DPPH free radical scavenging ability according to extraction condition of Cordyceps militaris grown upon Tenebrio molitor . A, DPPH free radical scavenging ability of Cordyceps militaris extracts by different solvent; B, DPPH free radical scavenging ability of Cordyceps militaris water extracts by different time. L-ascorbic acid (10 ppm), All values are mean±SD, Means in the same column followed by different uppercase letters are significantly different (p<0.05, a>b>c>d>e>f).

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갈색거저리 동충하초의 추출 시간에 따른 DPPH 자유 라디칼 소거 활성을 측정한 결과는 Fig. 1B와 같다. 열수 추출물과 주정 농도 30%, 50%, 70% 및 100%로 추출한 추출물의 DPPH 자유 라디칼 소거 활성 측정에서 가장 높은 활성을 나타내었던 물을 용매로 하였으며 80℃에서 30분, 1시간, 2시간, 3시간 및 4시간 동안 환류 추출 후 DPPH 자유 라디칼 소거 활성을 측정하였다. 30분 추출에서 76.49 EDA%로 가장 높았으며 1시간 추출에서는 75.43 EDA%로 30분 추출에 비해 낮은 활성을 나타내었다. 그 이후로도 2시간, 3시간 및 4시간은 66.42-70.06 EDA% 활성을 보여 시간이 증가할수록 활성이 낮아지는 경향을 확인하였다.

프로바이오틱스 유산균주 7종을 갈색거저리 동충하초 열수 추출물에 첨가 후 배양 시간에 따른 DPPH 자유 라디칼 소거 활성을 측정한 결과는 Fig. 2와 같다. 즉 균주 첨가 후 37℃에서 1시간, 3시간, 6시간, 12시간 및 24시간 배양 하였을 때 DPPH 자유 라디칼 소거 활성을 EDA%로 표시하 였다. 배양 1시간에서 균주를 첨가하지 않은 control군과 P. pentosaceus 접종 시료구를 제외한 모든 시료구가 75.07-79.01 EDA%로 control군의 71.62 EDA% 보다 높은 활성을 나타내었다. 배양 6시간에서는L. sakei 첨가 시료구 가 72.69 EDA%로 배양 1시간째인 79.01 EDA% 보다 활성 이 낮아지는 것을 확인 하였으나 control군을 제외한 모든 시료구가 73.20-80.01 EDA%로 1시간 배양보다 높아진 것 을 확인 할 수 있었다. 배양 12시간, 24시간에서는 6시간에 비해 상대적으로 활성이 높아진 시료구도 있었으나 전체적 으로 발효 시간이 6시간을 초과하였을 때 활성이 낮아지는 것을 확인 하였다. 배양 조건으로 설정한 7가지 프로바이오 틱스 유산균주 첨가 후 1시간, 3시간, 6시간, 12시간 및 24시간 동안 배양한 결과 배양 6시간째S. thermophilus 균주 가 80.01 EDA%로 가장 높게 나타났으며, Ahn(33) 등의 보고에 의하면 갈색거저리 동충하초의 지표물질인 cordycepin의 함량과 균주를 통한 발효가 항산화 활성의 증가와 상관관계가 있다고 보고하였다. 본 연구에서 사용 된 갈색거저리 동충하초 열수 추출물의 추출수율은 28.1% 로 나타났으며 7가지 균주를 첨가하였을 때S. thermophilus 균주가 다른 균주에 비하여 항산화 활성이 우수하다고 판 단되어 갈색거저리 동충하초 발효 우수 균주로 최종 선정 하였다.

Fig. 2. DPPH free radical scavenging ability of fermented C. militaris water extracts during fermentation time with var ious lactic acid bacter ia strains. All values are mean±SD. Means in the same column followed by different uppercase letters are significantly different (p<0.05, a>b>c>d>e>f>g>h).

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갈색거저리 동충하초 물 추출물과 유산균 발효물의 일반 성분 함량을 측정한 결과는 Table 1과 같다. 측정 결과 수분 은 물 추출물, 유산균 발효물 각각 85.27%, 68.54%, 조단백 질 2.97%, 3.56%, 조지방 0.32%, 1.06%, 조회분 0.06%, 0.06%의 함량을 보였다. Choi(34)는 녹차의 발효정도에 따 라 조단백질 함량이 37.31%에서 40.25%로 증가하였고 조 지방의 함량도 2.25%에서 2.84%로 증가하였으며 수분과 조회분의 함량은 변화가 없다고 보고하였다. 본 연구의 조 단백질, 조지방 및 조회분 함량의 변화는 Choi(34)의 보고와 유사한 경향을 나타내었으나 발효물의 수분은 물 추출물에 비해 더 낮게 나타났다. 이는 발효물 제조시 당의 첨가에 의한 차이로 사료된다.

갈색거저리 동충하초 물 추출물과 유산균 발효물의 무기 성분은 potassium, sodium, magnesium, calcium, zinc을 분석 하였으며 그 결과는 Table 2와 같다. 무기성분 조성 중 potassium의 함량이 물 추출물 5.75 mg%, 유산균 발효물 5.92 mg%로 가장 높게 나타났으며 물 추출물의 경우 magnesium 0.90 mg%, sodium 0.86 mg%, zinc 0.05 mg%, calcium 0.03 mg% 순으로 높게 나타났으나 유산균 발효물 의 경우 sodium 1.69 mg%, magnesium 1.00 mg%, calcium 0.31 mg%, zinc 0.07 mg% 순으로 높게 나타났다. Kim(35)은 백련잎차의 무기성분을 분석한 결과 동충하초 균사체로 백련잎차를 발효시킨 경우 발효시키지 않은 백련잎차보다 potassium, magnesium, calcium의 함량이 높게 나타나 본 연구와 일치하는 경향을 나타내었다.

갈색거저리 동충하초 물 추출물과 유산균 발효물의 유리 아미노산을 분석한 결과는 Table 3과 같다. 총 유리아미노 산 함량은 물 추출물 10,221.02 mg%, 유산균 발효물 9,458.66 mg%로 물 추출물의 함량이 더 높게 나타났다. 필수아미노산은 8종이 검출되었으며 8종의 함량은 물 추출 물 2,714.64 mg%, 유산균 발효물 2,581.85 mg%로 필수아미 노산 또한 물 추출물의 함량이 더 높게 나타났다. 아미노산 종류에 따른 함량을 비교해 보면 glutamic acid의 함량이 2,059.97 mg%로 물 추출물이 가장 높은 함량을 나타내었고 유산균 발효물이 1,922.64 mg%로 나타났다. 그 외에 물 추출물은 aspartic acid, alanine 순으로 높게 나타났으며 유 산균 발효물은 alanine, aspartic acid 순으로 높게 나타났다. 필수아미노산 8종의 경우 물 추출물은 threonine의 함량이 644.04 mg%로 가장 높았으며 lysine, valine 순으로 높았다. 유산균 발효물의 경우 lysine이 621.15 mg%의 함량으로 가장 높게 나타났으며 threonine, valine 순으로 높게 나타났 다. Yoon과 Yu(36)는 S. thermophilus의 생육촉진에 가장 큰 역할을 하는 유리아미노산은 glutamic acid라고 보고하 여 본 연구와 일치하는 경향을 나타내었으나 물 추출물과 유산균 발효물의 유리아미노산 함량은 발효에 따른 유산균 의 자화능력과 발효환경 및 발효조건에 의한 차이로 판단된 다.

갈색거저리 동충하초 물 추출물의 유산균 발효 전후의 cordycepin 함량 변화를 HPLC로 분석한 결과는 Table 4와 같다. 갈색거저리 동충하초의 cordycepin 함량은 물 추출물 이 7.02 mg%, 유산균 발효물이 8.66 mg%로 나타나 발효 후 cordycepin 함량이 증가하였다. Kim (27)은 cordycepin 함량 변화가 발효가 진행됨에 따라 함량이 증가하는 것으로 보고하였으며, 본 연구의S. thermophilus KCCM 3782 균주 발효에 있어서 cordycepin 생성에 기여하는 발효 대사 작용 에 의해 cordycepin 함량이 증가한 것으로 추정되나 정확히 어떠한 발효 대사 작용에 의한 차이 인지 추가 확인이 필요 할 것으로 사료된다.

갈색거저리 동충하초 열수 추출물의 발효 전후에 따른 시료의 색도를 측정한 결과는 Table 5와 같다. 적색도를 나타내는 a 값은 물 추출물 66.72, 유산균 발효물 149.92로 발효를 통해 a 값이 높아진 것을 확인하였고, 색의 명도를 나타내는 L 값은 물 추출물과 유산균 발효물 각각 15.79, -15.75 황색도를 나타내는 b 값은 54.45, 0.01로 유산균 발효 물이 물 추출물 보다 낮은 것으로 나타났다. 이러한 결과는 발효과정에서 생성된 부산물과 성분 조성의 변화로 인한 차이로 판단된다.

갈색거저리 동충하초 물 추출물의 유산균 발효 전후 DPPH 자유 라디칼 소거 활성을 측정한 결과는 Fig. 3A와 같다. 동충하초 열수 추출물의 발효에 따른 항산화 활성을 측정하기 위하여 시료구의 상등액을 취하여 DPPH 자유 라디칼 소거 활성을 측정하였다. 물 추출물과 유산균 발효 물의 DPPH 자유 라디칼 소거 활성은 유산균 발효물이 91.92 EDA%로 물 추출물의 84.69 EDA%보다 더 높게 나타 났다. Bae와 Ye(37)의 보고에 의하면 뽕잎차를 발효시켜 DPPH 자유 라디칼 소거 활성을 측정한 결과 발효물의 활성 이 더 높게 나타났으며 본 연구의 물 추출물과 유산균 발효 물의 DPPH 자유 라디칼 소거 활성과 유사한 경향을 나타내 었다.

Fig. 3. Antioxidant activities before and after lactic acid bacter ia fermentation of C. militaris grown upon T. molitor . A, DPPH free radical scavenging ability of fermented water extract by lactic acid bacteria of Cordyceps militaris; B, ABTS radical scavenging ability of fermented water extracts by lactic acid bacteria of Cordyceps militaris. C, SOD activities of fermented water extracts by lactic acid bacteria of Cordyceps militaris NP, non-fermented product; FP, Fermented product. L-ascorbic acid (10 ppm), All values are mean±SD, Means in the same column followed by different uppercase letters are significantly different (p<0.05, a>b>c).

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갈색거저리 동충하초 물 추출물의 유산균 발효에 따른 ABTS+ 자유 라디칼 소거 활성은 Fig. 3B와 같다. 갈색거저 리 동충하초 유산균 발효물은 60.82 EDA%로 나타났고 물 추출물 시료구는 54.57 EDA%로 나타났다. 유산균 발효물 이 물 추출물에 비해 6.25 EDA% 가량 높았고 DPPH 자유 라디칼 소거 활성과 ABTS+ 자유 라디칼 소거 활성 측정 결과가 유사한 경향을 보였으며 발효로 인하여 갈색거저리 동충하초 물 추출물의 항산화 활성이 높아지는 것을 확인하 였다.

갈색거저리 동충하초 물 추출물의 유산균 발효 전후의 SOD 활성은 Fig. 3C와 같다. SOD는 세포 속 환원산소종 ROS(reactive oxygen species)를 과산화수소로 촉매작용 하 여 전환시키는 항산화 효소 중의 하나이다(30). 유산균 발효 물이 49.43%로 물 추출물의 46.67%보다 2.76% 가량 활성이 더 높게 나타났으며 이는 superoxide anion의 활성을 억제시 키는 유사활성도를 확인할 수 있었다. Song (38)등의 보고 에 따르면 Lactobacillus에 의하여 천마의 지표성분인 gastrodin이 발효 전 146.63 ppm에서 발효 후 166.26 ppm으 로 미량 증가하였다고 보고하였다. 본 연구 또한 발효를 통하여 동충하초 지표성분인 cordycepin이 증가하였으며 cordycepin의 함량에 의하여 항산화 활성이 증가한다는 연 구(33)를 미루어 보아 본 연구 또한 균주를 통한 발효로 cordycepin의 함량이 증가하여 항산화 활성이 높아진 것으 로 판단된다.