LPS 자극 RAW 264.7 세포에서 제주산 올리브 추출물의 항염 활성

본 연구에 사용된 올리브는 2016년 제주도에서 채집하여, 부위별(잎과 줄기)로 나누어 충분히 건조시킨 후 분쇄하였다. 올리브 잎과 가지는 80% 에탄올 용매를 첨가하여 24시간 실온에서 침출하였고, 여과 후 감압농축기를 사용하여 농축하였다. 올리브 잎과 가지 추출물의 수율은 각각 25.6%와 19.5%로 올리브 잎 추출물의 수율이 가지 추출물에 비해 약 1.3배 정도 높게 측정되었다. 올리브 부위별 추출물은 phosphate buffer saline(PBS)에 용해하여 실험에 사용하였다.

Murine macrophage cell line인 RAW 264.7 cell을 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)로 부터 분양 받아 10% fetal bovine serum(FBS)와 100 units/mL penicillin-streptomycin이 함유된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM, Gibco, Grand Island, NY, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 3일 간격으로 계대 배양을 실시하였다.

올리브 추출물이 세포의 성장에 미치는 영향을 측정하기 위하여 LDH assay를 이용하여 실험하였다. RAW 264.7 세포(3.0×10⁵)를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 24 well plate에 분주한 후 24시간 동안 배양한 후 시료와 LPS(1 μg/mL)를 동시 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 이후 배양 배지를 3,000 rpm에서 5분간 원심 분리하여 LDH cytotoxicity detection kit(Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 측정하였다. 96-well plate에 원심 분리하여 얻은 배양 배지 50 μL와 reconstitude substrate mix 50 μL를 넣고, 실온에서 빛 차단하여 반응 시켰다. 반응 후 50 μL의 stop solution을 넣고 microplate reader(Bio-TEK instrument Inc., Vermont, WI, USA)를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 독성 정도를 평가하였다.

RAW 264.7 세포(3.0×10⁵)를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 24-well plate에 분주한 후 24시간 동안 배양한 후 시료와 LPS(1 μg/mL)를 동시 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 생성된 NO는 Griess 시약을 이용하여 세포 배양액 중에 존재하는 NO₂^-의 형태로 측정하였다(27). 세포배양 상등액 100 μL와 Griess 시약 100 μL를 혼합하여 96-well plate에서 10분간 실온암소로 반응시킨 후 microplate reader(Bio-TEK instrument Inc.)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준농도 곡선은 sodium nitrite(NaNO₂)를 serial dilution하여 얻었다.

RAW 264.7 세포(3.0×10⁵)를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 24-well plate에 분주한 후 24시간 동안 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 농도별로 조제된 시료와 LPS(1 μg/mL)를 함유한 배지를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 24시간 후 배양 배지를 원심분리(12,000 rpm, 3 min)하여 얻어진 상층액의 PGE₂ 함량을 측정하였다. 모든 시료는 정량 전까지 냉동보관(-20℃)하였고, PGE₂는 mouse enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) kit(R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 정량 하였으며 standard에 대한 표준곡선의 R²값은 0.99 이상이었다.

RAW 264.7 세포(3.0×10⁵)를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 24-well plate에 분주한 후 24시간 동안 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 농도별로 조제된 시료와 LPS(1 μg/mL)를 함유한 배지를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 24시간 후 배양 배지를 원심분리(12,000 rpm, 3 min)하여 얻어진 상층액의 전염증성 cytokine 함량을 측정하였다. 모든 시료는 정량 전까지 냉동보관(-20℃)하였다. 전염증성 cytokine은 mouse enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) kit(R&D Systems Inc.)를 이용하여 정량 하였으며 standard에 대한 표준곡선의 R²값은 0.99 이상이었다.

RAW 264.7 세포(3.0×10⁵)를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 6-well plate에 분주한 후 24시간 동안 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 농도 별로 조제된 시료와 LPS(1 μg/mL)를 함유한 배지를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 이후 세포를 PBS로 2회 세척하고 lysis buffer[1×RIPA(Upstate Cell Signaling Solution, Lake Placid, NY, USA), 1 mM pheylmethylsulfonyl fluoride(PMSF), 1 mM Na₃VO₄, 1 mM NaF, 1 μg/mL aprotinin, 1 μg/mL pepstain, and 1 μg/mL leupeptin]를 이용해 1시간 동안 lysis 시킨 후 원심분리(15,000 rpm, 15 min)하여 단백질 상등액만 분리하였다. 단백질 농도는 bovine serum albumin(BSA)를 표준으로 Bio-Rad protein assay regent(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)를 사용하여 정량 하였다. 정량한 단백질을 10%의 polyacrylamaide gel에 전기영동하고 Poly-vinylidene difluoride(PVDF) membrane (Millipore, Billerica, MA, USA)에 200 mA, 2시간 동안 전이시켰다. 단백질이 전이된 membrane을 5% 탈지분유를 포함한 0.05% Tween20/Tris-buffered saline(0.05% T/TBS)에 넣고 상온에서 blocking 시킨 후, 1차 항체와 반응시켰다. 1차 항체 반응은 iNOS antibody(1:5,000, Calbiochem, San Diego, CA, USA), COX-2 antibody(1:1,000, BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA, USA), β-actin antibody (1:10,000, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 이용하여 4℃에서 24시간 반응시켰다. 1차 항체 반응이 끝난 membrane은 0.05% T-TBS로 10분씩 4회 세척한 다음 2차 항체(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA)를 1:5,000 또는 1:10,000으로 희석하여 상온에서 1시간 반응한 뒤 0.05% T-TBS로 20분씩 3회 세척하였다. 단백질은 Enhanced chemiluminescance(ECL) 방법을 이용하여 imaging densitometer(model GS-700, Bio-Rad Laboratories, Inc.)를 통해 측정하였다.

모든 실험은 3회 반복하여 측정하였고, 그 결과는 평균값±표준편차로 나타냈으며 통계적 분석은 SPSS 10.0 프로그램을 이용하여 각 처리구 간의 유의성(p<0.05, 0.01)을 검증을 위해 분산분석(analysis of variance, ANOVA)후 tukey test로 다중비교를 실시하였다.

RAW 264.7 세포에 올리브 각 부위별(잎, 가지) 추출물(200, 400, 800 μg/mL)과 LPS(1μg/mL)를 동시 처리하여 24시간 배양한 후 LDH 분석법을 이용하여 세포 생존률을 확인하였다. Fig. 1에서 보는 것과 같이, 올리브 부위별 추출물의 LDH 활성은 모든 농도에서 올리브 추출물 미처리군과 비교할 경우 0% 이하의 활성을 나타내는 것으로 보아 유의적인 차이가 없음을 확인하였다. 세포막이 손상되거나 괴사가 일어나면 원형질 및 핵 내에 LDH 활성이 증가되고, 세포 밖으로 유출되어 배양배지 내의 LDH 활성이 증가되는 것으로 알려져 있다(16). 따라서 NO 생성 억제 활성과 PGE₂, 전염증성 cytokine 생성 억제 활성 연구는 800 μg/mL의 농도까지 실험을 진행하였다.

Fig. 1. Inhibitory effects of Olea europaea extract on nitric oxide production in RAW 264.7 cells. The production of nitric oxide was assayed in the culture medium of cells stimulated with LPS (1 μg/mL) for 24 h in the presence of Olea europaea extract (200, 400, and 800 μg/mL). Cytotoxicity was determined by LDH assay. Data represent the means±SD with three separate experiments. One-way ANOVA was used for comparisons of multiple group means followed by t-test (significant as compared to control. *p<0.05; **p<0.01).

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본 연구에서는 활성산소 중 하나이며 염증 유발에 중요한 역할을 한다고 알려진 nitric oxide(NO)의 생성에 올리브 추출물이 어떤 영향을 미치는지 알아보았다. RAW 264.7 세포에 올리브 각 부위별(잎, 가지) 추출물(200, 400, 800 μg/mL)과 LPS(1 μg/mL)를 동시 처리하여 24시간 배양하였다. 배양 후 생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포 배양액에 존재하는 NO₂^-의 형태로 측정하였다. 측정한 결과, LPS 단독 처리군은 NO의 생성을 유도하였고, LPS 단독 처리군과 비교했을 때 잎과 가지 추출물은 200 μg/mL농도에서 각각 19.5%, 22.2%로 NO 생성을 억제하였으며 최고 농도인 800 μg/mL에서는 각각 72.7%, 84.4%로 억제하는 것으로 나타나 가지 추출물이 잎 추출물보다 강한 NO 생성 억제 활성이 있는 것으로 생각된다(Fig. 1).

Nitric oxide(NO) 생성 억제 활성 측정과 동일한 조건으로 PGE₂ ELISA kit를 이용하여 PGE₂ 생성 억제 활성을 측정한 결과, 잎과 가지 추출물은 LPS 단독 처리군과 비교했을 때, 각각의 처리 농도에서 PGE₂의 생성에 농도 의존적으로 억제 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2). 최고 농도인 800 μg/mL농도에서는 잎과 가지 추출물의 활성이 각각 95.2%와 96.2%로 나타나 올리브 잎과 가지 추출물 모두 PGE₂ 생성을 효과적으로 억제하는 것으로 나타냈다.

Fig. 2. Inhibitory effects of Olea europaea extract on PGE2 production in RAW 264.7cells. The production of PGE₂ was assayed in the culture medium of cells stimulated with LPS (1 μg/mL) for 24 h in the presence of Olea europaea extract (200, 400, and 800 μg/mL). Data represent the means±SD with three separate experiments. One-way ANOVA was used for comparisons of multiple group means followed by t-test (significant as compared to control. *p<0.05; **p<0.01).

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Cytokine은 면역세포가 분비하는 단백질로서 면역세포의 활성, 증식 및 분화를 조절하여 염증반응을 매개하는 인자이다. 염증성 질환의 원인과 치료를 규명하기 위하여 cytokine의 역할은 매우 중요하며, TNF-α, IL-1β 및 IL-6은 in vitro 및 in vivo 모두에서 염증반응을 조절하는 물질로 대표적인 pro-inflammatory cytokine으로 알려져 있다(15). RAW 264.7 세포에서 올리브 각 부위별(잎, 가지) 추출물이 전염증성 cytokine인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 발현에 미치는 영향을 ELISA kit를 이용하여 조사하였다. 올리브 각 부위별(잎, 가지) 추출물(200, 400, 800 μg/mL)과 LPS(1 μg/mL)를 동시 처리하여 24시간 배양한 후 TNF-α의 생성 억제 활성을 확인한 결과 LPS 단독 처리군과 비교했을 때 잎과 가지 추출물 모두 농도 의존적으로 TNF-α의 생성을 억제 시키는 것으로 확인되었으며 최고 농도인 800 μg/mL에서 올리브 잎 추출물의 억제 활성이 33.6%, 가지 추출물의 억제 활성이 30.5%로 나타났다(Fig. 3). 다음으로 IL-6 생성억제 활성을 측정한 결과, IL-6의 생성 억제 활성은 800 μg/mL에서 잎과 가지 추출물은 68.0%, 63.2%의 활성이 나타나 IL-6 생성 억제에 효과가 있는 것으로 확인되었다(Fig. 4). 또한, IL-1β의 발현에 미치는 영향을 조사한 결과, 올리브 잎 추출물은 농도 의존적으로 IL-1β 생성 억제하는 것을 확인할 수 있었으나, 가지 추출물은 200 μg/mL에서부터 뚜렷하게 IL-1β 생성을 억제하는 것으로 관찰되었다(Fig. 5).

Fig. 3. Inhibitory effects of Olea europaea extract on TNF-α production in RAW 264.7 cells. The production of TNF-α was assayed in the culture medium of cells stimulated with LPS (1 μg/mL) for 24 h in the presence of Olea europaea extract (200, 400, and 800 μg/mL). The data represent the means±SD with three separate experiments (significant as compared to control. *p<0.05).

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Fig. 4. Inhibitory effects of Olea europaea extract on IL-6 production in RAW 264.7 cells. The production of IL-1β was assayed in the culture medium of cells stimulated with LPS (1 μg/mL) for 24 h in the presence of Olea europaea extract (200, 400, and 800 μg/mL). The data represent the means±SD with three separate experiments (significant as compared to control. *p<0.05).

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Fig. 5. Inhibitory effects of Olea europaea extract on IL-1β production in RAW 264.7 cells. The production of IL-1β was assayed in the culture medium of cells stimulated with LPS (1 μg/mL) for 24 h in the presence of Olea europaea extract (200, 400, and 800 μg/mL). Data represent the means±SD with three separate experiments. One-way ANOVA was used for comparisons of multiple group means followed by t-test (significant as compared to control. *p<0.05; **p<0.01).

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염증상태에서 iNOS에 의해 생성된 NO는 혈관투과성, 부종 등의 염증반응을 촉진시킬 뿐만 아니라 염증매개체의 생합성을 촉진하며, macrophage에서 LPS나 cytokine에 의해 염증성 매개물질들이 과잉 생산되는 중요한 메카니즘이 된다(28). 또한, COX는 arachidonic acid를 PGE₂로 전환시키는 효소로 COX-1은 정상적인 생체기능에 작용하며, 많은 염증 억제 약물들의 작용기전은 prostaglandin 합성 억제를 나타내는데 이러한 메카니즘은 COX-2의 생성 및 활성 저해에 의한 것으로 알려져 있다(29,30). 따라서 올리브 부위별(잎, 가지) 추출물의 iNOS 및 COX-2의 단백질 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 western blot 방법을 이용하여 iNOS 및 COX-2 단백질의 발현량을 조사하였다. Fig. 6과 같이 LPS 처리로 인해 iNOS 단백질의 발현이 증가하였고, 올리브 부위별 추출물을 농도별로 처리 하였을 때 200 μg/mL에서부터 유의적으로 억제되는 것을 확인 할 수 있었다. 반면, 염증반응에서 중요한 역할을 하는 COX-2 단백질 발현량을 확인한 결과 COX-2의 발현의 변화가 거의 없었다.

Fig. 6. Inhibitory effects of Olea europaea extract on the protein level of iNOS and COX-2 expression in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. Cells (1.0×10⁶ cells/mL) were pre-incubated for 18 h, and then treated with LPS (1 μg/mL) and Sample for 24 h. The protein levels of iNOS, COX-2 were analyzed by Western blot.

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