청국장 중 바이오제닉 아민 및 무기원소함량 분석

대전 및 순창지역에서 청국장을 수거하여 실험을 진행하였다. 수거된 37종은 전국으로 유통되는 청국장으로 2016년 11월부터 2017년 6월까지 이루어졌으며, 마트(26건)와 시장(11건)에서 구매하였다. 수거된 시료는 sampling 전까지 냉동고(GC-124HGFP, LG, Changwon, Korea) -20℃에 보관하였으며, 실험시에는 상온으로 유지시킨 후 분쇄기(HMF-3000, Hanil, Wonju, Korea) 를 이용하여 균질화하였다. 이 중 6건에 대하여는 무기원소 실험도 함께 진행되었다.

본 연구에 사용한 BAs의 표준품으로 putrescine(PUT), cadaverine(CAD), spermidine(SPD), spermine(SPM), tryptamine (TRY), histamine(HIS), tyramine(TYR), β-phenylethylamine (PHE)은 각각 1,000 mg/L(0.1 N HCl)로 제조하여 사용하였다. 유도체 시약 dansyl chloride(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)와 L-proline(Sigma-Aldrich Co.)은 각각 10%, 1%로 제조하여 사용하였다. 포화탄산나트륨용액은 Na₂CO₃(sodium carbonate anhydrous, Daejung Chemicals, Siheung, Korea) 46 g을 증류수 100 mL에 용해 사용하였다. 추출용 시약으로는 반도체급의 HCl(Dongwoo Fine-Chem, Iksan, Korea)을 희석하여 사용하였고, 기기분석 용매로는 HPLC 등급의 acetonitrile(J.T Baker, Center Valley, PA, USA)를 사용하였다. 무기원소 전처리에 사용된 시약은 반도체급의 HNO₃과 H₂O₂(Dong Woo Fine- Chem)이며, 사용된 물은 초순수장치(Milli-Q, Millipore, Billerica, MA, USA)로 18 MΩ이상 수준으로 정제된 초순수를 사용하였다. 무기원소 표준용액은 NIST(National Institute of Standards and Technology, Gaithersburg, PA, USA) 표준용액을 2% HNO₃으로 제조하여 사용하였다.

BAs의 분석은 Garcia-Garcia 등(14)의 방법과 일본위생시험법의 불휘발성 부패아민 분석법(15)을 변형하여 사용하였다. 시료 약 5 g을 취하여 0.1 N HCl 25 mL를 가한 후 균질화하여 4,000 G, 4℃, 15 min의 조건으로 원심분리(Combi 514R, HANIL, Wonju, Korea)하였다. 원심분리 후 여과하여 취하는 조작을 2회 반복하여 상층액을 합치고 0.1 N HCl을 가해 50 mL로 한 것을 추출용액으로 하였다. 표준용액 및 추출용액 각각 1 mL 를 마개 달린 유리시험관에 취한 후 포화탄산나트륨용액 0.5 mL와 유도체화시약인 1% dansyl chloride 0.8 mL을 가하여 혼합한 후 마개를 닫아 45℃에서 1시간 유도체화하였다. 유도체화 시킨 용액에 10% proline 용액 0.5 mL 및 에테르 5 mL을 가하여 10분간 vortex mixer(099A VB4, Glas-Col, Terre Haute, IN, USA)로 진탕하고 상층액을 취하여 질소농축기(HV-300, INTERFACE, Seoul, Korea)에 농축하였다. 농축한 시료에 acetonitrile 1 mL를 가하여 0.45 μm로 여과한 것을 시험용액으로 하였다. 분석은 HPLC(Prominace series, Shimadzu, Kyoto, Japan)로 하였으며, column은 Agilent polaris 3(C₁₈-A 150×4.6 mm, 3 μm, 40℃)를 이용하였다. 기기분석 시 용매는 gradient elution조건(A:ACN, B:water, 0 min 55% B/10 min 55% B, 15 min 65% B/20 min 80% B, 25 min 80% B/30 min 90% B, 33 min 90% B/35 min 55% B, 40 min 55 % B)으로 UV-254 nm에서 분석을 진행하였다.

시료전처리는 식품공전(식약처 고시 「식품의 기준 및 규격」)의 마이크로웨이브법(16)을 사용하였다. 균질화된 시료 약 0.2 g을 microwave(Xpress, CEM, Matthews, NC, USA) vessel에 취하고 질산과 과산화수소를 첨가하여 1,200 W로 15 min동안 180℃까지 온도를 높인 후 20 min동안 180℃로 유지시켜 분해하였다. 30 min동안 cooling 후 초순수를 이용하여 20 g으로 최종 시험액이 되도록 하였다. 기기분석은 ICP-AES(Arcos, Spectro, Kleve, Germany)와 ICP-MS(icapQ, Thermo, Waltham, MA, USA)를 이용하였다. 함량이 높은 Na, K, Mg, P, Ca, S는 ICP-AES로 미량성분인 Fe, Mn, Zn, Cu, Sr, Mo, Ba, Se은 ICP-MS로 분석하였다.

불확도는 GUM(Guide to the Expression of the Uncertainty in Measurement) 및 국제표준화기구(ISO)의 측정불확도 표현 지침서(Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement)(17)에 따라 산출되었다. 불확도 추정절차는 모델식(계산식 등)을 설정한 후 불확도 요인을 산출하며, 요인별 표준불확도(A형, B형)와 자유도를 계산한 후 감도계수 또는 불확도 요인의 측정값으로 나누어 각 요인별 상대표준불확도를 구하였다. 여러 개의 불확도 요인에 대한 표준불확도를 구하여 합성된 값의 합성표준불확도를 구한 후 포함인자 k를 구하기 위해서 합성표준불확도의 유효자유도를 추정하였다. 확장불확도는 합성표준불확도에 포함인자 k를 곱하여 산출하였다.

인증표준물질(Certified reference material, CRM)인 canned fish(T27176QC, FAPAS)를 이용해서 회수율을 확인한 결과 histamin은 인증값에 대해 97.8% 값을 얻었으며, 자세한 결과는 Table 1과 같다. 직선성은 10-100 mg/L의 범위에서 검량선을 확인하였다. 그 결과 8종 모두 R²는 0.998 이상의 직선성을 나타내었다. BAs 8종의 회수율실험은 혼합표준용액을 각각 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 농도수준으로 첨가하여 80-110%의 결과를 얻을 수 있었으며, 자세한 결과는 Table 2와 같다.

무기원소 또한 인증표준물질의 회수율을 확인하여 분석법을 검증하였다. 한국표준과학연구원(Korea Research Institute of Standards and Science, KRISS)의 쌀 분말과 미국표준기술연구소(National Institute of Standards and Technology, NIST)의 Tomato leaves, Rice flour을 이용하여 Pb, Cd, As의 회수율을 구하였다. 그 결과 85.3-107.1%의 회수율을 얻을 수 있었으며, 자세한 결과는 Table 1과 같다.

BAs 중 histamine 분석에서 표준용액조제, 시료전처리, 검정곡선에서 발생할 수 있는 불확도값을 요인으로 추정하였다. 각각의 불확도인자에 대해 상대표준불확도를 구하고 포함인자 k를 이용하여 측정불확도를 산출하였다. 표준용액 조제 시 사용된 저울은 교정 성적서상의 불확도 95% 신뢰수준에서 0.0004 g의 불확도값으로 표준불확도는 0.0002가 된다. 표준물질조제에 대한 합성표준불확도는 0.0154이었다. 표준물질 희석은 저울과 부피용기가 사용되었으며, 100 mL 부피플라스크의 교정성적서상의 불확도 95% 신뢰수준에서 0.0610 mL의 불확도값으로 표준불확도는 0.0305이 된다. 표준용액 희석에 대한 합성표준불확도는 0.0004이었다.

시료전처리 불확도는 각각 저울과 pipet이 사용되었으며, 각각의 상대표준불확도는 0.0002 g, 0.007 mL, 0.007 mL, 0.0004 mL, 0.0004 mL로 합성표준불확도는 0.0007이었다.

검정곡선의 불확도는 희석된 표준용액 1.0 mg/L, 2.0 mg/L, 4.0 mg/L, 10 mg/L을 3회 반복측정하여 회귀분석을 이용하여 산출하였다. 직선성의 표준불확도는 0.0382 mg/L, 자유도는 10, 상대표준불확도는 0.0071 mg/L이었다.

합성상대불확도 0.017에 측정농도 5.37 mg/L을 곱하여 합성표준불확도 0.091 mg/kg을 산출하며, 포함인자는 유효자유도가 323(유효자유도 10 이상)이므로 신뢰수준 약 95%, k=2로 계산되었다. Histamine의 확장불확도는 희석배수를 고려하여 53.7 mg/kg±1.82 mg/kg으로 약 3% 이내의 오차값을 나타내었다. 불확도 요인에 따른 기여도는 표준물질 조제 66.9%, 시료전처리 2.91%, 검정곡선 30.2%로 불확도요인 중에 표준물질 조제와 검정곡선이 90%이상의 기여를 하고 있음을 알 수 있었다.

본 연구에서는 유통중인 청국장 37건에 대하여 TRP, PHE, PUT, CAD, HIS, TYR, SPD, SPM 총 8항목의 BAs을 분석하였으며 분석결과는 Table 3과 같다. BAs의 검출된 항목중에 TYR이 평균 113.7 mg/kg 로 다른 BAs의 평균 농도에 비해 약 2.5배에서 최대 약 30배 정도 높은 결과를 나타내었으며, 8.4-905.0 mg/kg의 농도범위로 시료간 농도의 차이가 매우 크게 나타남을 알 수 있었다. Han 등(12)의 연구에서 TYR 4.2-483.1 mg/kg의 범위를 보여주어 다른 amine에 비해 높게 나타났다. 식중독 원인이 되는 것으로 밝혀진 HIS의 평균농도는 3.8 mg/kg으로 가장 낮은 수치를 나타냈으며, 37건 중 10건에서는 검출이 되지 않았다. 이는 Cho 등(18)의 연구의 10.1 mg/kg보다는 다소 낮은 수치였다. 또한 ND-22.3 mg/kg의 농도범위로 Han 등(12)의 연구의 0.2-70.3 mg/kg에 비해 낮은 농도범위를 보여주었다. PHE PUT, CAD, SPM는 각각 11.8 mg/kg, 10.6 mg/kg, 10.3 mg/kg, 11.5 mg/kg으로 비슷한 평균값을 나타내었고, Cho 등(18)의 연구의 22.0 mg/kg, 26.4 mg/kg, 9.7 mg/kg, 10.7 mg/kg와 비교하였을 때 PHE, PUT를 제외하고는 비슷한 평균값을 나타내었다. TRP와 SPD 또한 43.8 mg/kg, 37.6 mg/kg으로 비슷한 평균값을 나타내었고, Cho 등(18)의 연구의 69.9 mg/kg, 52.0 mg/kg보다는 약간 낮은 값을 나타내었다. 8항목의 BAs중 PUT, CAD, TYR, SPD는 37건의 시료에서 모두 검출이 되었다. 분석대상 BAs 중 위해성과 관련된 보고가 있었던 물질은 PUT, CAD, HIS, TYR, PHE이며 나머지 이 외의 항목들은 위해성과 관련된 결과가 보고된 바가 없다(19).

현재까지 우리나라를 비롯하여 외국의 경우 BAs에 대한 총체적인 기준이나 규격을 정하여 관리하는 국가는 없다. 우리나라의 경우 HIS의 냉동 및 염장어류, 통조림 등 수산물에 대하여 200 mg/kg로 규격을 설정하고 있으며, 미국이나 EU의 경우 자국 내 히스타민에 대한 어류 및 가공어육에 대해서만 권장규격이 있는 실정이다. 추후 바이오제닉아민에 대한 유해성 연구가 진행이 되면 발효식품 내 바이오제닉아민에 대한 규제로 인해 청국장의 제조 유해물질의 저감화 기술이 필요하다. 현재 유통되고 있는 청국장은 BAs 생성에 관여하고 있는 미생물 Enterobacteriaceae, Clostridium spp, Lactobacillus spp. 등이 있으며, 식품의 미생물의 분포 및 제조발효 시간 등에 따른 공정의 차이에 따라 유해물질의 함량은 다르게 나타는 것으로 보인다(13,20). 유통되는 청국장의 BAs의 함량 결과에 따른 시료의 상관관계를 파악하기 어려웠으며, 앞으로 안전한 청국장을 제공하기 위해 청국장 제조공정의 표준화 및 규격설정이 필요하다고 생각된다. 추후 시중 유통되는 청국장의 제조공정별 검사를 실시하여 지속적인 안전관리가 필요할 것이다.

우리나라에서 유통 중인 청국장의 무기성분 18성분 중 주요무기원소(Na, K, Ca, P, Mg, S)와 미량무기원소(Fe, Mn, Zn, Cu, Sr, Mo, Ba, Se) 및 유해중금속(Pb, Cd, As, Hg) 함량을 분석한 결과는 Table 4와 같다. 주요무기원소 중 Na의 평균함량이 가장 높았으며, 평균 0.93%, 0.34-2.03%의 농도 범위로 최대 6배 정도 차이가 났다. Na 함량은 청국장 자체의 농도에 따른 차이보다 제조 과정에서의 첨가물 등에 의해 기인된 현상이라고 생각된다. K는 평균 0.55%, 0.43-0.63%의 농도 범위를 나타냈으며, 청국장 종류에 상관없이 비슷한 값을 나타내었다. Na은 섭취량이 높을수록 고혈압 등 심혈관 질환의 발생률을 높이는 것으로 알려져 있다(21). 한편 K은 Na의 과잉 섭취로 유발되는 고혈압에 대해 방어 작용을 한다고 알려져 있다. Na/K ratio을 1에 가깝게 낮추면 고혈압을 개선시키는 효과가 있으며, Na과 K 각각의 섭취보다 Na/K의 비율이 고혈압에 대한 연관이 더 크다고 보고되고 있다(22). 본 연구에서 시판 청국장의 Na/K ratio를 분석한 결과, 0.56-4.76 수준으로 나타났다.

Na과 K 외에 주요무기원소 중에서 Ca, P, Mg, S와 주요미량원소 중에서 Fe, Mn, Zn, Cu, Sr의 경우에는 시료 종류에 상관없이 비슷한 수치를 나타내었다(Table 4, 5). 청국장과 유사한 발효식품 중 하나인 된장의 모니터링 결과 Zn 16.7 mg/kg, Cu 5.09 mg/kg, Mn 15.9 mg/kg(23)로 비슷한 수치를 나타냈으며, 또 다른 보고서에서도 Zn 19.4 mg/kg, Cu 5.5 mg/kg(24)로 나타났다. 다량 무기질 이외의 미량 무기질의 경우에는 제조공정보다는 생콩 자체로 인해 나타나는 결과로 보인다.

유해중금속인 Pb, Cd, As, Hg의 경우에는 정량한계 이하로 검출이 되지 않거나 0.011-0.049 mg/kg 수준으로 나타났다. 모니터링 결과 국내 보고서에 나타난 된장의 함량과 비교하였을 때 큰 차이가 없었으며, 유해중금속은 검출이 되지 않거나 검출이 되더라도 0.1 mg/kg이하로 나타나는 것을 알 수 있었다. 현재 장류에 대한 중금속의 기준치는 없는 상태이며, 다른 나라에도 없는 실정이다.