대장균과 황색포도상구균에 대한 복분자 추출물의 항균효과분석

본 연구에 사용된 미생물은 E. coli (ATCC 25922), E. coli O157:H7 (ATCC C7927)와 S. aureus (ATCC 33592) 였으며, 균주들은 American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA, USA)로부터 구매하였다. 각 균은 접종하기 전에 멸균된 Trypic soy broth (TSB; Becton, Dickinson and Company(BD) Bacto^TM, Franklin Lakes, NJ, USA)를 이용하여 37℃ 배양기에서 24시간 동안 2번 연속 계대 배양하여 실험에 이용하였다.

복분자박, 복분자 미숙과, 복분자 완숙과 추출물은 (재)베리&바이오식품연구소(전라북도 고창군)로부터 제공 받았다. 추출 방법은 복분자 열수 추출물 (DW)은 복분자박, 미숙과, 완숙과 시료 각각 100 g을 1 L 증류수에 녹인 후 환류냉각장치가 부착된 히팅 맨틀을 이용하여 100℃에서 2시간 동안 2회 추출하였다. 복분자 에탄올 추출물은 복분자박, 미숙과, 완숙과 시료 각각 100 g을 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 100% 에탄올을 1 L에 넣은 후 환류냉각장치가 부착된 히팅 맨틀을 이용하여 80℃에서 2시간 동안 2회 추출하였다. 이렇게 추출된 추출액은 감압농축기를 이용하여 당도가 5 °Brix 되도록 농축한 후 각각 동결 건조 하였다. 건조된 각 복분자 추출물을 4% Dimethyl sulfoxide (DMSO; Sigma Aldrich, Co., ST. Louis, MO, USA)에 녹여 11종의 복분자 추출물 추출액을(Table 1)을 제조하였다.

복분자 추출물의 항균 활성 정도를 평가하기 위해 미생물의 생육을 억제하는 각 복분자 추출물의 최소농도를 측정하였다. 11종의 건조된 복분자 추출물 500 mg을 1 mL의 4% DMSO에 녹여 추출액을 제조하고, 다시 추출액을 4% DMSO를 사용하여 2-24 mg/100 μL로 희석하였다. TSB에서 37℃로 24시간 배양한 E. coli와 S. aureus 배양액(10⁹ CFU/mL)을 TSB를 이용하여 약 10⁶ CFU/mL까지 희석한 후 그 배양액 100 μL를 96-well plate에 접종하였다. 접종한 96-well plate에 상기에 희석된 복분자 추출물 4-48 μL를 각 well에 첨가한 후 96-well plate를 24시간 37℃에서 배양하였다. 이때 복분자 추출물을 첨가하지 않은 100 μL의 4% DMSO용액에 배양액만 첨가한 대조군도 같이 배양하였다. 배양 후 각 well에서 100 μL를 취하여 멸균 희석액(3M, science applied to life^TM, Saint Paul, MN, USA)을 이용하여 적절히 10배수 단계희석법으로 희석하여 Trypic soy agar (TSA; BD)에 도말한 후 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. 배양한 TSA에서 생육한 집락수를 계수하여 희석배수로 곱한 후 시료 1 mL에 존재하는 각 세균의 집락 수 (CFU/mL)를 계산하였다. 복분자 추출액이 첨가된 well에 존재하는 세균 집락수를 복분자 추출액이 첨가되지 않은 대조군에 존재하는 세균 집락수와 비교하여 MIC를 계산하였다. 본 연구에서의 MIC는 24시간 37℃에서 세균의 생육을 억제 하는 최소한의 복분자 추출물의 농도로 정의하였다.

MIC 측정결과에 따라 비교적 낮은 MIC를 갖는 복분자 추출물을 선택하여 Time kill assay방법을 이용하여 항균활성을 비교하였다. 본 실험에서는 MIC방법에 사용된 비병원성 E. coli를 사용하지 않고 병원성인 E. coli O157:H7과 S. aureus를 이용하였다. 각 균을 TSB상에서 37℃에서 24시간 배양한 후 멸균 TSB를 이용하여 약 10⁶ CFU/mL까지 희석하였다. MIC 농도로 희석된 배양액 880 μL와 선택된 복분자 추출물 120 μL를 멸균된 eppendorf tube에서 혼합시켰다. 혼합액을 약 25℃에서 보관하며 일정 시간별로 100 μL를 취한 후 멸균희석수로 희석하여 TSA에 도말하여 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. 배양한 TSA에서 생육한 집락수를 계수하여 희석배수로 곱하여 세균의 집락수를 계산하였다.

각각의 실험은 모두 3회 반복 실시하였으며, 그 평균과 표준편차로 나타내었다. 본 연구의 통계처리는 IBM SPSS(version 21, Armonk, NY, USA) 프로그램을 이용하였고, 신뢰수준 95%(p<0.05)에서 분석하였다.

본 연구에서는 초기 균수가 약 6.8 log CFU/mL였기 때문에 복분자 추출물이 첨가된 well에서 균수가 그와 비슷하거나 이하가 되는 복분자 추출물의 최소 농도를 MIC로 결정하였다. 먼저, 복분자 추출물이 첨가되지 않은 대조군의 경우, 24시간 후에 약 10⁹ CFU/mL까지 E. coli와 S. aureus의 균수가 증가한 것을 확인하였다 (data not shown). 따라서 복분자 추출물이 첨가된 well에서 균수가 초기균수와 비슷하거나 혹은 낮아진다면 그 추출물의 항균효과가 있음을 나타낸다. 총 11종류 복분자 추출물의 MIC는 Table 2와 같이 4-16 mg/100 μL으로 다양하게 나타났고. 이 중 복분자박 10%, 20%, 30% 에탄올 추출물, 복분자 완숙과 DW 추출물은 MIC 약 4-6 mg/100 μL로 다른 추출물에 비해 상대적으로 높은 항균효과를 갖고 있음을 확인하였다.

Song 등(18)은 감귤박 에탄올추출물과 열수추출물의 영양성분 및 항산화 활성에 대해 비교하였고, 추출용매에 따른 전체 폴리페놀 함량은 차이가 없지만 열수추출물보다는 에탄올추출물의 항산화 활성이 더 높게 나타났으며, 이는 항산화능에 기여하는 폴리페놀 성분이 에탄올 추출물에 상대적으로 더 많이 포함되어있기 때문인 것으로 보고하였다. 또한 복분자 추출물의 항고혈압 활성에 대한 Lee 등(10)의 연구에서 사용된 추출물의 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량 분석 결과 열수추출물보다 에탄올추출물에서 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량이 더 높게 나타났다고 보고한 바 있다. 암대극 추출물의 항산화 및 항균활성 연구(19)에 따르면 총 폴리페놀 함량이 높게 나타난 추출물에서 가장 우수한 항균활성을 나타내며, 항균성에 관여하는 물질이 단일성분이라고 단정 짓기는 어려우나 항산화 결과와 마찬가지로 주된 항균활성 물질을 페놀성 화합물로 사료된다고 보고하였다. 따라서 복분자 에탄올 추출물에서 항균활성이 높게 나타난 것은 이 추출물에 더 높은 폴리페놀화합물이 존재하기 때문으로 사료된다. 이는 폴리페놀화합물이 미생물의 대사에 관여하는 여러 단백질과 결합하여 대사활동을 방해하기 때문일 것으로 여겨진다(20).

MIC를 이용한 복분자 추출물의 항균활성 비교는 최소저해농도만 확인할 수 있을 뿐 균수의 감소를 정확하게 측정하기 불가능하므로, 본 연구에서는 Time kill assay를 이용하여 자세한 복분자 추출물의 항균활성을 비교하였다. 앞서 언급한 MIC 결과에서 복분자박 10%, 20%, 30% 에탄올 추출물, 복분자 완숙과 DW 추출물의 MIC값이 4-6 mg/100 μL에서 항균효과를 나타내었으므로 이를 고려하여 위의 4 종류의 추출물에 대해서 Time kill assay를 진행하였다. Time kill assay에서는 실제로 이러한 추출물들이 식중독 원인균에도 효과가 있는지 검증하기 위해 비병원성 E. coli 대신 E. coli O157:H7을 대상으로 실험을 실시하였다. Fig. 1과 같이 복분자박 10% 에탄올 추출물은 E. coli O157:H7와 S. aureus에 대해 각각 0.7 log CFU/mL 감소하였으며, 복분자박 20% 에탄올 추출물은 E. coli O157:H7에 대해 1.0 log CFU/mL, S. aureus에 대해 1.4 log CFU/mL 감소하였다. 복분자박 30% 에탄올 추출물은 E. coli O157:H7에 대해 1.1 log CFU/mL, S. aureus에 대해 1.4 log CFU/mL 감소하였다. 복분자박 20%와 30% 에탄올 추출물은 E. coli O157:H7보다 S. aureus에 더 효과가 있는 것으로 나타났다. E. coli O157:H7에 대해서는 4 종류의 복분자 추출물 중 완숙과 DW가 가장 효과적인 생육저해 효과를 나타냈으며 약 1.5 log CFU/mL 정도 감소시켰다. 마찬가지로, S. aureus에 대해서도 완숙과 DW가 24시간 동안 2.4 log CFU/mL 감소시키는 것으로 나타나 가장 효과적이었다.

Fig. 1. Inhibitory effect of various Bokbunja extracts on the growth of E. coli O157:H7 (a) and S. aureus (b) for 24 h at 25℃. Asterisk (*) indicates a significant difference (p<0.05) among ripened DW, pomace 10% EtOH, pomace 20% EtOH and pomace 30% EtOH.

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본 연구에서 사용된 Rubus occidentalis와 비슷한 복분자 딸기(Rubus coreanus)의 성숙 단계별 생리활성을 비교한 연구(21)에 따르면 복분자 딸기가 완숙되어 짐에 따라 상대적으로 미숙과와 중간숙과에 비하여 총 폴리페놀 함량이 유의적으로 증가하여 완숙과가 가장 높은 총 폴리페놀 화합물 함량을 가진다고 보고되었으며 항산화 작용을 하는 비타민 E, 플라보노이드, 안토시아닌 함량 등이 미숙과와 비교했을 때 완숙과에서 더 높은 함량을 가진다고 보고된 바 있다. 천연물 속에 있는 총 폴리페놀, 플라보노이드는 항산화 작용뿐만 아니라 세균의 DNA gyrase와 같은 효소활성을 억제하고 증식을 차단하여 항균활성을 가진다(22). 따라서 총 폴리페놀 함량과 플라보노이드 함량이 미숙과보다 상대적으로 높은 완숙과에서 상대적으로 높은 항균활성을 나타내었다.