서 론
천년초(Opuntia humifusa)는 다년초 선인장과 식물로 줄기의 형태가 손바닥과 비슷하여 손바닥 선인장이라고도 불리며, 주로 전라남도 신안, 충청남도 아산, 경기도 일부 지역을 포함한 내륙지방에서 재배되고 있다. 천년초는 작은 솜털 가시를 가지고 있으며, 영하 20°C의 혹한에서도 자체의 수분을 절반으로 감소시켜 얼어 죽지 않고 생장하는 강한 생존력을 가지는 한국토종 식용 선인장이다(Shin 등, 2015; Kim 등, 2016). 천년초는 열매, 줄기, 뿌리 등 모든 부분이 식용가능하며, 특히 줄기는 연중 수확이 가능하고 열매보다 무기질 함량이 높다고 보고되고 있다(Kim 등, 2016). 또한 천년초는 폴리페놀 화합물, 식이섬유, 비타민, 칼슘, 무기질, 아미노산, 복합 다당류 등의 영양성분을 다량 함유하고 있으며, 그 중에서 식이섬유 함량은 건조물 기준 줄기 및 열매에 각각 약 70% 및 45%로 다른 식물에 비해 식이섬유가 다량 함유되어 있다(Shin 등, 2015).
식이섬유는 ‘인간의 소화효소에 의해 가수분해되지 않는 식물성 다당류와 리그닌(lignin)의 합’으로 정의되면 물리적·화학적 특징에 따라 수용성 식이섬유(soluble dietary fiber) 및 불용성 식이섬유(insoluble dietary fiber)로 구분된다. 수용성 식이섬유는 대장 내 미생물에 의해 발효되는 식이섬유로 내당능 개선 효과와 혈청 콜레스테롤 조절 기능을 가진다. 반면, 불용성 식이섬유는 대장 내 미생물에 의해 대사되지 않는 섬유소로 분변량 증가, 분변의 장내 통과시간 촉진 및 대장암의 예방 등에 효과적인 것으로 보고된다(Ebihara와 Nakamoto, 1998; Im 등, 2016; Schneeman, 1987). 이런 특성 때문에 식이섬유를 다량 함유한 식물로부터 식이섬유 추출을 통해 기능성 소재로서 식품산업에 활용하려는 연구가 이루어지고 있다. 식물 속에 함유된 생리활성성분인 식이섬유의 추출 효율을 높이기 위한 방법으로는 용매추출법과 열수추출법 등이 있다. 용매추출은 분배에 의한 것으로 목적 성분과 용매와의 용해도 및 극성 등에 의하여 용매의 선택은 달라지며, 주로 유기용매가 추출에 사용되고 있으나 이들은 독성이 있어 잔류 용매의 안정성과 추출 후 유기용매의 환경오염에 대해 우려되는 부분이 있다(Oh 등, 2017; Shin과 Lee, 2011). 따라서 일반적으로 식물의 생리활성 물질을 추출하기 위해 열수추출법이 가장 많이 사용되고 있으나, 열수추출법 또한 에너지 소비가 많고 고온에 의한 유효성분의 파괴 등의 문제점이 있다. 이와 같은 각 추출 방법들이 가진 단점을 보완할 수 있는 다양한 추출 방법이 모색되고 있으며, 그 중에서도 효소를 이용한 추출 방법은 안정성이 높으며, 분해생성물 및 부산물이 적어 환경오염을 방지하고 비수용성의 기능성 성분을 수용성으로 전환시킴으로써 추출 효율을 증대시킬 수 있다는 장점을 가진다(Kim 등, 2007; Oh 등, 2015). 따라서 최근에는 식품으로부터 생리활성물질 추출을 위해 생물학적 방법인 효소가수분해가 주로 사용되고 있다.
반응표면분석법(response surface methodology, RSM)은 여러 개의 요인변수를 사용하여 최적조건을 찾고, 하나의 변수와 다른 변수들과의 상호작용으로 인한 반응변수를 측정하여 변수들의 최적값을 추론하는 방법이다. 일반적으로 반응표면분석은 여러 개의 종속변수와 상호작용을 평가하는 실험의 횟수를 줄이기 때문에 최소의 실험횟수로부터 최대의 정보를 얻을 수 있다는 이점이 있어 새로운 추출조건 또는 식품개발 및 가공조건을 확립할 때 많이 이용되고 있다(Kim과 Kim, 2019; Park 등, 2017).
따라서 본 연구에서는 RSM을 이용하여 천년초 줄기로부터 생리활성물질인 식이섬유를 효율적으로 추출하기 위해 효소를 이용하여 가수분해 조건을 최적화 하고자 하였다. 추출 조건으로 효소농도 및 반응시간을 요인변수로 선택하여 10개 추출 조건을 설정하였으며, 각 조건에 의해 추출된 추출물의 수율 및 식이섬유 함량을 측정한 후 RSM을 통해 최적의 추출조건을 도출하였다.
재료 및 방법
본 실험에 사용된 천년초는 경상북도 의성지역에서 재배된 것으로 좋은 먹거리영농조합(Uiseong, Korea)을 통해 구입하였다. 천년초의 줄기를 분리한 후, 흐르는 물에 수세한 다음 물기를 제거하여 동결건조하였다. 동결건조 된 시료는 믹서기(FM-681C, Hanil, Incheon, Korea)로 마쇄한 다음 100 mesh의 체로 체질하여 -20°C 냉동고(MDF, Sanyo, Tokyo, Japan)에 보관하면서 실험에 사용하였다.
천년초 줄기의 일반성분, 즉 수분은 자동측정기(FD-720, Kett, Tokyo, Japan)를, 조지방은 조지방 자동추출기(Soxtec 2050, Foss Hoganas, Sweden)를 이용하여 측정하였으며, 조회분은 직접회화법으로, 조단백질은 Kjeldahl법에 따라 micro-Kjeldahl 장치(Dstillation Unit B-323, Buchi, Flawil, Switzerland)를 이용하여 측정하였다. 조섬유는 조섬유자동추출기(Fiber test F-6, Raypa, Barcelona, Spain)를 이용하여 측정하였으며, 탄수화물 함량은 시료 전체함량을 100%로 하고, 수분, 조단백질, 조지방, 조회분 함량(%)을 뺀 값으로 하였다.
천년초 줄기의 효소분해 조건 최적화를 위해 세포벽 가수분해 효소인 Viscozyme L®(Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark)을 이용하였으며 중심합성계획법(central composite design)과 반응표면분석법(RSM)을 적용하여 실험 설계를 하였다. 동결건조된 천년초 줄기 5 g에 10배의 증류수를 첨가한 후, 최적조건(pH 4.8, 40°C)에서 효소농도(X1)와 반응시간(X2)을 독립변수(Xi)로 하여 효소농도(0.5-2.5%), 반응시간(1-5 h)을 -2, -1, 0, 1, 2의 5단계로 부호화한 후(Table 1), Table 2와 같이 13구간으로 설정하여 효소분해를 실시하였다. 독립변수에 영향을 받는 종속변수(Yn)는 총 수율(total yield, Y1), 총식이섬유(total dietary fiber, Y2), 수용성 식이섬유(water-soluble dietary fiber, Y3) 및 불용성 식이섬유(water-insoluble dietary fiber, Y4)로 설정하였고, 측정결과 값은 SAS software(SAS, version 9.4 SAS institute Inc., Cary, NC, USA)를 사용하여 분석하였다.
| Variables | Symbols | Coded variables | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| -2 | -1 | 0 | 1 | 2 | ||
| Enzyme concentration (%) | X1 | 0.5 | 1.0 | 1.5 | 2.0 | 2.5 |
| Reaction time (h) | X2 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
천년초 가수분해물의 식이섬유 함량 측정을 위해 10가지 중심합성계획의 효소분해 조건에서 가수분해한 가수분해물을 환류냉각장치를 이용하여 95°C에서 2시간 동안 추출한 후 추출액을 여과한 다음 얻은 여과액을 동결건조하여 분석 시료로 사용하였다. 식이섬유 함량 측정을 위해 시료 0.1 g에 증류수 50 mL를 첨가하고, 0.1 N NaOH로 pH를 6.0으로 조정한 후 α-amylase 0.1 mL를 가하여 100°C에서 30분간 가열하였다. 가열 후 온도를 60°C로 낮춘 다음 0.1 N NaOH를 이용하여 pH를 7.5로 조정한 후 protease 5 μg을 가하여 60°C에서 30분간 반응하였다. 다시 여기에 0.1 N HCl을 첨가하여 pH을 4.5로 조정한 후 amyloglucosidase 0.1 mL를 첨가하여 60°C에서 30분간 반응한 후 방냉하여 식이섬유 함량 측정을 위한 효소반응액 시료로 사용하였다. 한편, 유리여과기에 celite 1 g을 첨가하여 105°C에서 하룻밤 건조시켜 항량을 구한 후 측정에 사용하였다.
총식이섬유함량을 측정하기 위해 효소 반응액에 60°C로 가열해 둔 95% 에탄올 200 mL를 가하여 실온에서 1시간 방치하여 침전물이 형성되도록 하였다. 그 후 항량을 구해놓은 유리여과기에 78% 에탄올을 첨가하여 가라앉힌 후 반응액을 여과시키고, 78% 에탄올, 95% 에탄올, 아세톤 순으로 각각 10 mL씩 2회 세척하였다. 침전물이 들어있는 유리여과기는 105°C에서 건조시키고 1시간 방냉하여 항량을 구하였다.
수용성 식이섬유의 함량을 측정하기 위해 유리여과기에 첨가된 celite를 78% 에탄올로 가라앉힌 후 반응액을 여과시키고 70°C로 가열해 둔 증류수 10 mL로 2회 세척한 후 여과액과 세척액에 증류수를 첨가하여 전체 부피를 100 mL로 맞추었다. 미리 60°C로 맞추어 둔 95% 에탄올 400 mL를 첨가한 다음 실온에서 1시간 방치하여 침전물이 형성되도록 하였다. 유리여과기의 celite를 78% 에탄올로 가라앉힌 후 검액을 여과시키고 78% 에탄올, 95% 에탄올 및 아세톤 순으로 각각 10 mL씩 2회 세척하였으며, 유리여과기는 105°C에서 미리 항량을 측정하여 총식이섬유(total dietary fiber, TDF), 수용성 식이섬유(water-soluble dietary fiber, SDF) 및 불용성 식이섬유(water-insoluble dietary fiber, IDF) 함량을 다음 식에 의하여 계산하였다.
결과 및 고찰
동결건조된 천년초 줄기의 일반성분을 분석하였으며, 그 결과는 Table 3과 같다. 천년초의 수분함량은 2.69%이었으며, 조단백질 함량은 18.80%, 조지방 함량은 0.66%, 조회분 함량은 8.19%, 탄수화물의 함량은 69.66%이었다. Kim 등(2016)은 수확시기별 천년초 줄기의 일반성분을 측정한 결과, 봄에 수확된 여주의 수분, 조단백질, 조회분, 조지방 및 탄수화물 함량이 각각 0.40%, 6.54%, 8.89%, 1.57% 및 82.64%로 보고하여, 본 연구결과에 비해 낮은 단백질 함량 및 높은 탄수화물 함량을 나타내었다. 또한, Yoon 등(2009)은 천년초 선인장 줄기의 일반성분을 분석한 결과, 수분이 87.23%이었으며, 조회분, 조단백질, 조지방 및 조섬유의 함량이 각각 2.17%, 1.61%, 0.52% 및 1.02%로 수분을 제외한 조회분의 함량이 가장 높게 측정되어, 본 연구결과와 차이를 나타내었다. 이와 같이 천년초 줄기의 일반성분 함량 차이는 천년초의 품종 및 재배지의 차이에 기인한 것으로 판단된다. 본 연구에서 천년초 줄기의 식이섬유 함량은 58.82%로 탄수화물의 약 85%를 구성하는 것으로 나타났다. Hwang 등(1996)의 채소, 버섯, 과일 및 해조류 식품의 식이섬유 함량을 측정한 연구에서는 배추 26.28% dry weight, 양배추21.40% dry weight, 알로에 41.56% dry weight, 표고버섯 48.78% dry weight, 사과 11% dry weight, 바나나 7.51% dry weight, 생미역 39.25% dry weight, 생다시마 56.74% dry weight로 보고하여, 본 연구에 사용된 천년초 줄기의 식이섬유 함량이 다소 높은 수준으로 확인되었다. 따라서 천년초 줄기의 높은 식이섬유 함량으로 기능성 탄수화물소재로 이용가치가 높을 것으로 판단된다.
| Composition | Opuntia humifusa stem (% dry weight) |
|---|---|
| Moisture | 2.69±0.141) |
| Crude protein | 18.80±5.70 |
| Crude fat | 0.66±0.21 |
| Crude ash | 8.19±0.35 |
| Carbohydrate | 69.66±5.72 |
| Dietary fiber | 58.82±1.32 |
Viscozyme®은 cellulase, β-glucosidase, xylanase의 활성을 지니고 있어 식물 세포벽에 단단히 결합되어 있는 다당류인 cellulose, hemicellulose, β-1,4-glucan 등의 물질들을 가수분해함으로써 식이섬유를 비롯한 가용성 기능성 성분의 추출을 용이하게 한다(Oh 등, 2015). 따라서 천년초 줄기의 식이섬유 추출을 위한 최적의 효소분해조건 설정을 위하여 효소농도 및 반응 시간에 대한 중심합성계획을 실시하였다.
천년초 줄기를 중심합성계획에 의해 설계된 13구간의 효소 분해조건에 따라 효소가수분해하여 얻은 시료의 수율을 측정하였으며, 결과는 Table 2와 같다. 효소농도 및 반응시간에 따라 39.94-53.24% 범위의 수율을 나타내었으며, 효소농도가 높아짐에 따라 수율도 증가하는 경향을 보였다. 이는 천년초 세포벽 성분이 Viscozyme®에 의해 가수분해되어 arabinose, glucose, galactose, xylose 등을 포함한 단당류, 다양한 올리고당 및 가용성 다당류가 생성되어 수율이 증가한 것으로 판단된다(Yoon 등, 2006). 간장 제조 시 남은 부산물로부터 식이섬유소를 추출하고 수율을 측정한 결과, 최대 추출효율은 37.21%로, 본 연구의 추출 효율에 비해 낮게 나타나(Lin 등, 2014), 효소분해가 식이섬유소 추출방법임을 알 수 있었다. 효소적 분해와 압출 병행방법을 이용하여 쌀겨로부터 식이섬유소를 추출한 결과, 2%의 효소첨가 후 75°C에서 90분간 분해 후 얻은 식이섬유소의 추출율은 30.3%로 보고되었다(Wang 등, 2015). 또한, 메밀껍질로부터 효소분해에 의해 얻은 수용성 식이섬유소의 추출율은 12.98%로 나타나(Im 등, 2016), 본 연구에서 얻은 식이섬유소의 추출 수율이 매우 높음을 확인하였다. 수율의 결과를 이용하여 반응표면회귀분석을 이용하여 반응표면 회귀식을 얻었으며(Table 4), 수율에 대한 회귀식의 R2은 0.9073이고 5% 이내의 유의수준에서 유의성이 인정되었다. 천년초 줄기의 분해조건에 따른 수율의 다항식을 바탕으로 3차원 반응표면그래프를 확인하였으며, 결과는 Fig. 1A와 같다. 효소농도 0.5%, 1.5% 및 2.5%일 때 수율은 각각 39.94%, 44.57-44.90% 및 53.24%로 효소농도가 높을수록 수율도 증가하였으며, 반응시간에 따른 수율의 함량 변화는 큰 차이가 없는 것으로 나타났다. 천년초 줄기의 효소 분해물의 수율에 따른 예측된 정상점은 saddle point 형태로 나타났으며, 효소분해 조건을 고려하여 능선분석 결과에서 효소농도 2.46%, 반응시간 2.47시간일 때 최대값 54.12%로 예측되었으며(Table 5), 천년초 줄기 효소분해물 수율의 분해조건에 대한 영향은 반응시간보다 효소농도에 많은 영향을 받음을 확인하였다(Table 6).
| Response1) | F-Ratio | |
|---|---|---|
| Enzyme concentration | Reaction time | |
| Total yield | 11.27*2) | 1.58 |
| TDF content | 15.12* | 56.53*** |
| SDF content | 8.49* | 22.68** |
| IDF content | 0.23 | 9.72* |
중심합성계획에 의한 천년초 줄기의 효소분해 조건별 총식이섬유 함량은 Table 2와 같이 29.02-43.82% 범위의 값을 나타내었다. 효소농도 1%, 반응시간 4시간에서 29.02%로 가장 낮은 총식이섬유 함량을 나타내었고, 효소농도 1.5%, 반응시간 1시간에서 43.82%로 가장 높은 총식이섬유 함량을 나타내었다. 가수분해 조건에 있어 효소농도 및 반응시간에 따른 총식이섬유 함량 변화에 대한 반응표면 회귀식은 Table 4와 같으며, 총식이섬유 함량에 대한 회귀식의 R2은 0.9801로 높은 신뢰도를 보였으며, 1% 이내의 유의성을 보였다. 천년초 줄기 효소분해 조건에 따른 총식이섬유 함량에 대한 반응표면은 Fig. 1B와 같다. 효소농도 1.5%까지는 총식이섬유 함량이 증가하다가 그 이후에는 다시 감소하는 경향을 보였다. 또한 1시간 반응 후 총식이섬유 함량이 최고점을 보이다가 그 이후로는 감소하는 경향을 나타내었다. 천년초 줄기의 효소분해 결과에 대한 능선분석 결과는 Table 5에서와 같이 예측된 정상점은 saddle point로 나타났으며, 최대값은 효소농도 0.98%, 반응시간 1.29시간 일 때 48.54%로 예측되었다. 천년초 줄기의 효소분해 시 조건변수인 효소농도와 반응시간에 대한 총식이섬유 함량에 미치는 영향을 알아본 결과(Table 6), 효소농도보다 반응시간에 대해 더 많은 영향을 받음을 알 수 있었다. Im 등(2016)은 메밀껍질로부터 Celluclast®와 Viscozyme®을 이용하여 생산된 식이섬유의 총 수율은 효소농도보다는 반응시간에 더 영향을 받았다고 보고하여 본 연구의 결과와 유사하였다.
천년초 줄기를 조건별로 효소분해하여 수용성 식이섬유 함량을 측정하였으며, 결과는 Table 2와 같다. 수용성 식이섬유 함량은 분해조건에 따른 차이를 보였고, 효소농도 1%, 반응시간 2시간에서 40.68%로 최고함량을 보였으며, 효소농도 1%, 반응시간 4시간에서 27.25%로 최소함량을 보였다. 천년초 줄기 효소분해 조건별 수용성 식이섬유 함량 결과에 대한 반응표면 회귀식의 R2은 0.9751로 1% 이내의 유의성이 인정되었다. 효소분해 조건에 따른 천년초 줄기의 수용성 식이섬유 함량 변화에 대한 반응표면은 총식이섬유 함량의 변화와 유사한 경향이 나타났다(Fig. 1C). 즉, 수용성 식이섬유 함량은 효소농도와 반응시간에 영향을 받으며, 효소 농도 1.5%까지 증가하다가 그 이후 감소하였으며 반응시간 1시간에서 최고함량을 보이다가 이후로 서서히 감소하는 경향을 나타내었다. 국내산 주요 해조류(미역, 다시마, 톳, 파래 및 우뭇가사리)로부터 수용성 식이섬유소를 추출하기 위하여 Viscozyme®을 이용하여 효소분해한 결과, 효소농도가 증가할수록 수용성 식이섬유소의 추출 수율이 증가하였으며, 1% 첨가하여 1시간 추출 시 가장 높은 수율(3.11-13.81%)을 나타내었다(Do 등, 1997). 수용성 식이섬유 함량에 대해 효소분해 조건을 고려하여 능선분석을 통해 최대조건 및 최소조건과 그 값을 예측한 결과, Table 5와 같이 효소농도 0.96%, 반응시간 1.32시간일 때 최대값 46.97%를 나타내었다. 효소농도 및 반응시간에 대한 수용성 식이섬유의 F-ratio는 각각 8.49 및 22.68로 확인되어 효소농도보다 반응시간에 대해 더 높은 영향을 받는 것으로 나타났다(Table 6). 효소 분해를 이용하여 배추부산물로부터 수용성 식이섬유소를 생산한 Park과 Yoon(2015)의 연구에 따르면 가수분해 시 분해시간이 증가할수록 수용성 식이섬유의 수율이 증가하였다고 보고하여 본 연구의 결과와 유사하였다. 이는 식물세포벽 복합분해효소인 Viscozyme®은 식물의 세포벽에 존재하는 불용성의 고분자물질들을 저분자화하여 수용성으로 가용화함으로써 효소분해물의 수용성 식이섬유 수율이 효소농도에 비례하여 증가하는 것으로 판단된다(Im 등, 2016; Lee 등, 2014).
일반적으로 불용성 식이섬유에는 cellulose, lignin 및 hemicellulose 등이 포함되며, 이들은 장의 연동 운동을 촉진시키며, 분변의 부피를 증가시킨다. 뿐만 아니라 소화 과정 중 중금속 및 기타 독성 물질의 흡착을 빠르게 제거하는 등 소화과정에서 중요한 작용을 한다(Hua 등, 2019; Makki 등, 2018). 중심합성계획에 의한 천년초 줄기 효소분해 조건별 불용성 식이섬유 함량을 분석하였으며, 그 결과는 Table 2에 나타내었다. 효소농도 및 반응시간에 따라 0.98-3.80% 범위의 불용성 식이섬유 함량으로 나타났고, 이를 바탕으로 한 회귀식은 Table 6과 같다. 불용성 식이섬유 함량에 대한 회귀식의 R2값은 0.886으로 5% 이내의 유의성이 인정되었다. 천년초 줄기의 불용성 식이섬유 함량에 대한 분해조건별 반응표면의 변화는 Fig. 1D에 나타내었으며, 그 결과 효소농도 및 반응시간에 따른 불용성 식이섬유 함량은 큰 차이가 없었다. 효소농도 및 반응시간에 따른 불용성 식이섬유 함량 결과에 대한 예측된 정상점은 saddle point로 확인되었으며, 최대값은 효소농도 1.68%, 반응시간 1.03시간에서 불용성 식이섬유 함량은 3.64%로 예측되었으며(Table 5), 효소농도보다는 반응시간에 많은 영향을 받음을 확인할 수 있었다(Table 6).
Viscozyme®을 이용한 천년초 줄기의 효소분해에서 수율, 총식이섬유, 수용성 식이섬유 및 불용성 식이섬유가 높은 효소분해조건을 설정하기 위하여 각 항목의 반응표면을 superimposing하여 Fig. 2에 제시하였다. 각 항목의 최적 분해조건으로 도출된 최대 또는 최적값의 반응표면을 한 도면에 합한 결과, 수율, 총식이섬유 함량, 수용성 식이섬유 함량 및 불용성 식이섬유 함량 4항목의 최대값을 나타내는 반응표면의 그림이 완전 또는 부분적으로 적합하였고, 그 일치하는 부분을 각 독립변수의 범위를 읽어 최적 분해조건의 범위로 설정하였다. 이 반응표면으로부터 설정될 수 있는 효소분해의 최적 조건 범위는 Fig. 2의 짙은 부분으로 효소농도 1-1.8% 및 반응시간 1-1.8시간으로 예측되었다(Table 7).
| Treatment condition | Range of predicted condition (optimal value) |
|---|---|
| Enzyme concentration (%) | 1-1.8 (1.75) |
| Reaction time (h) | 1-1.8 (1.50) |
