김치 유래 복합 종균 적용이 김치의 발효과정에 미치는 영향

본 실험에 사용한 김치 유래 젖산균은 시판 김치(대상 종가집, CJ 비비고, 풀무원, 동원 양반김치, 아워홈 등 5개 제조사 생산 배추김치를 이마트 월계점에서 구매 후 pH 4.2-4.4까지 숙성함)에서 분리하였으며, 분리한 균주를 단독 또는 복합 적용하여 김치 발효에 따른 품질 특성을 확인하였다. 본 연구 재료로 사용한 김치의 배합비는 배추 80%, 무 10%, 파 1%, 마늘 3%, 생강 0.8%, 멸치액젓 2.2%, 설탕 1%, 고춧가루 2%로 최종염도는 1.8±0.2% 기준으로 제조하였다. 제조 과정은 배추는 3×3 cm 크기로 썰어 10% 소금물에서 2-3시간 절여 3회 세척 후 자연 탈수하고 양념 원료는 세척, 절단 등 전처리하여 배합 기준으로 정량을 잰 후 혼합하여 김치를 제조하였다. 김치에 사용한 균주는 Chang과 Chang(2011)의 방법에 따라 bacteriocin 생성능을 강화시켜 24시간 배양된 젖산균을 사용하였다. 균체 배양액은 원심분리 후 멸균 수로 2회 세척해 얻은 균체를 김치 양념에 혼합하였으며, 균주 접종량은 약 7 log CFU/g이 되도록 첨가하였다. 제조 후 500 g씩 포장하여 저장 온도 10°C에서 저장 기간별로 pH, 유리당 함량 변화, CO₂ 생성량을 이화학 특성으로 분석하였고, 저장 기간별 발효 품질 변화를 확인하기 위하여 스타터 균주 우점률을 분석하였다. 김치의 균주 적용은 김치에서 분리한 젖산균을 단일 균주, 복합 균주, 균주 무첨가로 설계하였으며, 조건은 Table 1과 같다.

pH 측정은 각 시료의 착즙액을 pH meter(Orion 3 Star, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 3회 반복 측정하였다.

유리당은 fructose, glucose, mannitol로 분석하였다. 김치 시료를 blender로 파쇄하고 착즙하여 0.45 μm filter로 여과한 다음 HPLC(Waters 484, Waters, Milford, MA, USA)를 사용하여 분석하였다. 칼럼은 carbohydrate analysis column (3.9×300 mm, Waters)를 사용하였고, solvent는 acetonitrile과 water의 비율(v/v)을 87:13으로 사용하였다. Flow rate는 1.2 mL/min 설정하였고, RI detector(Refractive index Detectors RI-500 series, SHODEX, Tokyo, Japan)를 사용하였다. 유리당 분석을 위한 표준 용액은 glucose, fructose, mannitol로 하였고, 시험용액 및 표준용액의 injection volume은 각각 20 μL 주입하였다. 시료 내 유리당은 표준용액과 비교하여 확인 후 표준 검량곡선을 작성하여 함량을 산출하였다.

CO₂ 생성량은 포장 후 내부의 기체(CO₂) 농도를 측정하였고, 분석방법은 필름 표면에 septum을 부착한 뒤 헤드 스페이스 부분에 가스분석기(Checkmate 9900, PBI Dansensor Co., Skanderborg, Denmark)를 사용하여 측정하였다.

시료를 20 g 취한 후 멸균된 0.85% saline 용액으로 균질화 및 희석하여 각 배지에 접종하였다. 젖산균은 MRS(Lacto-bacilli MRS Agar, Difco Co., Franklin Lakes, NJ, USA) 배지에 bromocresol purple(BCP) 지시약 25 ppm을 넣어 제조한 BCP 배지를 사용하여 pouring culture method로 30°C에서 48시간 배양 후 노란색을 띠는 colony를 계수하였다.

스타터 균주로 첨가한 젖산균의 우점율 확인은 1차적으로 집락의 특이적 형태를 관찰하고 광학현미경(Olympus BX41TF, Olympus Co., Tokyo, Japan)으로 세포의 형태를 관찰한 후, 2차적으로 16S rRNA 및 18S rRNA 염기서열 분석을 통하여 스타터의 rRNA 염기서열과 동일함을 확인하였다.

모든 실험은 3 반복 실험의 결과 값을 SPSS version 21.0 software(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 각 실험구간 평균치와 표준편차를 계산하였다.

스타터 균주별로 적용한 김치를 저장 온도 10°C에서 26일간 발효하며 측정한 pH 변화는 Fig. 1과 같다. 김치 제조 직후 pH는 5.29-5.37 정도였고, 스타터 균주별 pH 변화를 살펴보면 단일 균주 첨가구는 제조 직후부터 발효가 시작되어 발효 8일 차의 pH가 4.3-4.4로 급격히 감소하였다. 대조구와 복합 균주 첨가구는 발효 4일차까지 pH가 5.25-5.27로 일정하게 유지되다가 발효 4일 후부터 pH 5.34-4.5까지 급격히 감소하였다. 발효 8일 후부터는 스타터 균주 첨가구 및 대조구 모두 pH가 유사하게 감소하였다. 스타터 균주별로는 단일 균주 첨가구의 초기 pH가 복합 균주 첨가구에 비해 낮게 나타났다. 이는 스타터 첨가 시 pH가 초기 유지되었다가 3일 이후 급감하고, 스타터 비접종시 pH가 상승 후 7일 후부터 급감한다(So와 Kim, 1996)는 선행연구와 약간 차이는 있으나, 이는 사용 스타터 균주 종류 및 복합 여부에 따른 차이로 사료된다.

Fig. 1. Changes in pH of kimchi with various conditions during fermentation at 10°C. Con, no starter application; LC A, L. citreum A; LM B, L. mesenteroides B; LC A+LM B, L. citreum A+L. mesenteroides B; LC A+LM D, L. citreum A+L. mesenteroides D.

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스타터 균주별로 첨가한 김치의 발효기간별 유리당 함량 변화는 Table 2와 같다. 유리당 함량 변화는 발효 초기 평균 fructose 1.5 g/100 g, glucose 1.75 g/100 g이었으나 발효기간이 점차 경과하면서 감소하는 경향을 보였고, mannitol은 제조 직후에는 없었으나 발효기간이 지남에 따라 생성되어 발효 후기에 1.2 g/100 g으로 나타났다. 스타터 균주 첨가구 대비 대조구의 유리당 함량은 유의적 차가 없었으며, 유리당의 감소 경향도 유사하였다. 단일 균주 첨가 대비 복합 균주 첨가의 fructose, glucose 감소율이 높았으나 유의적 차는 없었고, 젖산균의 발효 산물인 mannitol은 단일 균주 첨가 대비 복합 균주 첨가 시 mannitol 생성량이 약 1.5배 높았고, 대조구의 mannitol 생성량이 가장 적었다. 유리당 함량 감소는 김치 발효과정 중 당류가 젖산의 기질로 쓰이기 때문에 감소한다는 Ha와 Cha(1994)의 보고와 유사한 결과를 나타내었으며, Park 등(2011)의 유리당 함량이 급격히 감소한 시기와 pH 변화 패턴이 일치한다는 연구결과와 비슷한 유리당 감소 유형을 확인하였다. 또한, 발효 기간에 mannitol 생성 능에 따라 김치의 관능 품질이 달라지는데, 이는 알코올 당인 mannitol에 의해 김치의 시원한 맛에 영향이 미치기 때문이며, mannitol 생성력이 높은 복합 균주 첨가가 김치 품질 향상에 적합할 것으로 사료된다.

발효 기간별 스타터 균주별로 발효과정 중 생성되는 CO₂ 함량 변화를 분석한 결과는 Fig. 2와 같다. CO₂ 함량은 미생물의 발효 산물로 미생물 생육 패턴과 같이 증가하였다가 일정 함량 유지 후 급격히 감소하는 경향을 보였으며, 스타터 균주별로 CO₂ 생성량의 차이가 있었다. 특히 복합 균주 첨가는 단일 균주 첨가 대비 CO₂ 생성량이 높았고, 단일 균주 첨가는 대조구 대비 약간 높은 경향을 보였으나, 유의적 차를 나타내지 않았다. 김치 발효과정 중에 생성된 CO₂ 함량의 변화는 김치 발효과정에 관여하는 hetero-type 젖산균에 의한 것으로 hetero-type 젖산균 중 발효초기에 빠르게 우점하는 L. mesenteriodes는 김치의 맛과 숙성에 관여하며, 젖산, 초산 등을 생성하여 김치를 산성화하고 탄산가스를 급속히 발생하여 혐기상태로 만드는 것으로 보고되었다(Cheigh 등, 1994;Lee, 1996). 본 연구에서 L. mesenteriodes 균주첨가 시 CO₂ 생성량이 대조구 및 L. citreum 단일 균주 첨가 시보다 높게 나타난 것은 선행 연구에서 확인된 L. mesenteriodes 특성에 의한 것으로 사료된다.

Fig. 2. Changes in amount of CO₂ generated of kimchi with various conditions during fermentation at 10°C. Con, no starter application; LC A, L. citreum A; LM B, L. mesenteroides B; LC A+LM B, L. citreum A+L. mesenteroides B; LC A+LM D, L. citreum A+L. mesenteroides D.

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스타터 균주별 발효기간에 따른 젖산균 수 변화를 측정한 결과는 Fig. 3과 같다. 발효 초기 대조구의 젖산균 수는 10⁵ CFU/g이었으며, 스타터 첨가구는 평균 10⁷ CFU/g으로 초기 젖산균 수는 스타터 첨가구가 높게 나타났다. 발효 4일 후부터 대조구와 스타터 첨가구 모두 젖산균 수가 증가하여 발효 8일 차에 평균 10⁸-10⁹ CFU/g으로 나타났으며, 발효 8일에서 15일까지 일정하게 유지하다가 발효 후기에 약간 감소하는 경향을 보였다. 단일 균주 첨가구와 복합 균주 첨가구의 젖산균 증가 양상이 유사하였으며, 최고 발효 시점의 젖산균 수도 단일 균주 첨가구 2종, 복합 균주 첨가구 2종 모두 유의적 차이가 없었다. 대조구와 Leuconostoc. sp.를 첨가한 김치는 발효 정상기 이후 비교적 느리게 변화하며, 높은 젖산균 수를 유지하나, Lactobacillus sp.를 첨가 김치는 정상기 후 재정상 기로 증가한 후 급속히 감소하였다(So 등, 1996)고 보고한 결과와 본 연구에서 정상기(발효 8일차) 이후 Leuconostoc sp.의 젖산균 수 감소가 Lactobacillus sp.에 비해 느리게 나타난 결과와 유사하였다. 그러나 Lactobacillus sp.와 Lactobacillus sp.를 복합 첨가한 김치의 젖산균 수 변화는 단일 균주 첨가구와 패턴의 차이가 있고, 복합 균주 첨가구와 스타터 균주 종류에 따라 감소 패턴이 다르게 나타나 균주 종류 차이와 균주 복합 첨가가 젖산균 생육 패턴을 유지하는 효과에 의한 것으로 사료된다.

Fig. 3. Changes in lactic acid bacteria count of kimchi with various conditions during fermentation at 10°C. Con, no starter application; LC A, L. citreum A; LM B, L. mesenteroides B; LC A+LM B, L. citreum A+L. mesenteroides B; LC A+LM D, L. citreum A+L. mesenteroides D.

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스타터 균주별 젖산균 군의 우점율은 Fig. 4와 같다. 대조구는 발효 15일차에 우점율이 49%로 나타나고, 스타터 균주 첨가구는 우점율이 62-82%까지 높았으며, 발효 26일까지 스타터 균주 첨가 시 우점율은 60% 이상 유지되었다. 사용 균주별로는 발효 15일 기준 L. mesenteriodes D의 복합 균주를 첨가한 김치의 우점율이 84%로 가장 높았으며, L. mesenteriodes B를 복합 균주로 첨가한 김치의 우점율은 81%로 나타났다. 동일 발효 기간 비교 시 L. citreum A의 단일 균주 첨가 김치의 우점율은 62%로 스타터 균주 첨가군 중 가장 낮은 점유율을 보였다. 발효 기간이 지남에 따라 젖산균 군의 우점율은 hetero type는 점차 감소하고, Lactobacillus sp.와 같은 homo type가 증가하였다. 김치 내 Leuconostoc sp.와 같은 hetero type 젖산균이 우점할 경우 가식 기간이 연장되고 관능 기호도를 높인다(Mheen과 Kwon, 1994; So와 Kim, 1995)는 연구 결과와 같이 hetero type Leuconostoc sp. 균주를 스타터로 사용함으로써 Leuconostoc sp.가 우점할 경우 가식 기간이 길어짐에 따라 김치 유통기한 연장에 영향이 있을 것으로 사료된다.

Fig. 4. Changes in dominance rate of kimchi with various conditions during fermentation at 10°C.

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