서 론
염증반응은 기본적인 면역반응으로 인체 내 대부분 기관에서 유발된다(Chae 등, 2011). 염증반응은 물리·화학적 자극이나 세균감염과 같은 외부 유해물질에 대응하기 위한 생체의 방어기작이며, 손상된 조직이나 장기를 회복시키는 역할을 한다(Lee 등, 2017). 대식세포(macrophage)는 동물 체내 모든 조직에 존재하며, 면역기능과 항상성 유지를 담당하는 세포로 유해물질, 바이러스, 세균 및 노화 세포 등을 외부로 배출시키는 역할을 하고, 염증 유발 물질이 유입되면 염증 매개 물질을 분비하여 신체를 보호하고 기능을 유지할 수 있게 한다(Kim 등, 2018; Min과 Park, 2009). 그러나 지속적인 염증반응으로 인하여 대식세포가 과도하게 반응하면 염증 매개 물질이 과발현되어 종양, 자가면역질환 및 제2형 당뇨 등 다양한 질병을 일으키는 요인이 된다(Hofseth와 Ying, 2006). 염증반응은 lipopolysaccharide(LPS), 활성산소종, 사이토카인 등을 통해 염증반응이 활성화되어 nitric oxide(NO) 및 prostaglandin E2 등의 염증인자나 tumor necrosis factor-α(TNF-α), interleukin-1β(IL-1β), interleukin-6(IL-6)과 같은 염증성 사이토카인의 생성에 관여한다(Kim 등, 2019). NO는 reactive nitrogen species(RNS)의 일종이며, O2-과 반응하여 peroxynitrite를 생성한다(Lee와 Jeong, 2006). Peroxynitrite는 산화제로 작용하여 지질과 단백질의 과산화를 유도시키고, 세포독성을 일으킨다(Radi 등, 1991). 따라서 염증반응 억제는 염증질환을 치료하는 데 있어 중요한 목표가 된다.
최근 우리나라의 주요 암종별 유병률은 갑상선암 21.7%, 위암 15.5%, 대장암 13.4%, 유방암 11.6%이며(Healthcare Bigdata Hub, 2018), 이 중 위암의 유병률이 높은 것은 우리나라 사람들의 서구화된 식생활 환경 등 다양한 요인이 존재하지만 Helicobacter pylori(H. pylori)와 같은 위염 원인균의 감염도 중요한 요인 중 하나이다(Park과 Kim, 2006). 만성 위염, 위궤양, 소화불량 등 소화기 질환을 일으키는 인자로 알려진 H. pylori의 국내 감염률은 51%이다(Ahn, 2019). H. pylori는 일반적으로 프로톤 펌프 억제제(proton pump inhibitor)를 기초로 하여 아목시실린(amoxicillin), 클라리트로마이신(clarithromycin) 또는 레보플록사신(levofloxacin)로 치료하는 것으로 알려져 있다(Choi 등, 2018). 그러나 삼제요법의 치료는 질병의 재발, 내성균주의 출현 및 환자의 약제 부적응 등 여러 문제를 발생시킨다(Francesco 등, 2011). 이에 따라 최근에는 로즈마리(Yoon 등, 2011), 돌나물(Choi 등, 2012), 강황(Oh 등, 2020), 소함흉탕 및 황련(Lee 등, 2014) 등 천연소재를 활용한 H. pylori에 대한 항균활성 연구가 증가하고 있다.
두릅(Aralia elata)은 두릅나무과(Araliaceae)에 속하는 식물로 크기는 4-5 m 정도이며, 봄철에는 새순을 식용으로 섭취하고, 뿌리는 약용으로 사용한다(Moon 등, 1999). 두릅에는 사포닌, 올리에놀산, 트라이터펜, 베타 카로텐, 아스코르브산 등의 성분이 함유되어 있는 것으로 알려져 있으며(Kwon 등, 2018), 항산화 효과(Cha 등, 2009), 항고혈압 효과(Jin 등, 2017), 당뇨예방 효과(Kim 등, 2004) 등이 보고된 바 있다. 이 외에도 항염증(Lee 등, 2009), 살모넬라와 대장균의 생장억제(Ma 등, 1996) 등에 대한 연구가 보고되어 있지만, H. pylori의 항균효과에 관한 보고는 찾아보기 힘든 실정이다.
이에, 본 연구에서는 두릅을 이용하여 H. pylori의 항균활성을 확인하고, 염증발생에 대한 억제능은 대식세포를 이용하여 NO, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 평가를 통해 조사하였다.
재료 및 방법
2020년 5월 전북 순창군 농특산물 직판장에서 구매한 두릅(Aralia elata)은 수돗물로 수세하여 이물질을 제거하고, 2 mm 두께로 자른 후 건조기를 이용하여 60℃에서 건조하였다. 건조한 두릅은 20 mesh에 통과할 정도로 분쇄기(Philips, HR3752/00, Amsterdam, Nederland)로 분쇄하였으며, 얻어진 분말은 4℃에서 저온 저장하며 실험에 사용하였다. 본 연구에서 항산화 성분 분석, 항균활성 및 항염증 활성 측정에 사용된 시약은 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS), ascorbic acid, Folin-Ciocalteu’s phenol reagent, gallic acid, quercetin, potassium persulfate(K2S2O8), amoxicillin, lipopolysaccharide(LPS), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)은 Sigma-Aldrich Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS), penicillin-streptomycin(PS)은 HyClone(Pittsburgh, PA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
건조된 두릅을 증류수로 80℃의 water bath에서 5시간 동안 추출하였다. 추출액은 원심분리기(3,000 ×g)에서 10분간 원심분리하고, 여과지(Advantec No.2, Toyo Roshi Co., Ltd., Tokyo, Japan)를 사용하여 여과하였다. 여과한 추출액은 freezer (CLN-50C, Nihon freezer Co., Ltd., Tokyo, Japan)를 사용하여 동결한 다음 동결건조기(FD 8508, IlShin BioBase Co., Ltd., Dongducheon, Korea)를 사용하여 −80℃에서 동결건조하였다. 건조된 시료(수율 12.8%)는 증류수에 완전히 용해하여 시료액으로 사용하였다.
두릅 열수추출물의 총폴리페놀 함량은 Folin-Denis법(Singleton과 Rossi, 1965)으로 측정하였다. 농도별로 조제한 두릅 열수추출물 1 mL에 1 N Folin-Ciocalteu’s reagent 0.5 mL를 첨가하여 혼합한 다음, 5% Na2CO3 1 mL를 첨가하여 암소에서 1시간 동안 반응시킨 후 분광광도계(Agilent 8453, Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 725 nm에서 흡광도를 분석하였다. 두릅에 함유된 총폴리페놀 함량은 gallic acid의 표준곡선(25-200 μL/mL)을 이용하여 측정하였고, 회귀식은 y=0.0055x-0.0318(R2=0.9969)로 나타났으며, 총폴리페놀 함량은 mg gallic acid equivalent(GAE)/g으로 나타내었다.
두릅 열수추출물의 총플라보노이드 함량은 Moreno 등(2000)의 방법을 응용하여 측정하였다. 두릅 열수추출물 0.5 mL에 10% aluminum nitrate 0.1 mL와 1 M potassium acetate 0.1 mL를 순차적으로 첨가한 후, ethanol 4.3 mL를 가하여 혼합하고, 40분간 실온에서 반응시킨 다음 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총플라보노이드 함량은 quercetin의 표준곡선(20-100 μL/mL)을 이용하여 측정하였고, 회귀식은 y= 0.0014x+0.0011(R2=0.9989)로 나타났으며, 총플라보노이드 함량은 mg quercetin(QE)/g으로 나타내었다.
두릅 열수추출물의 DPPH 라디칼 소거활성은 Blois (1958)법으로 측정하였다. 여러 농도로 조정된 시료 40 μL와 메탄올로 제조된 0.2 mM DPPH 용액 180 μL를 96-well plate에 혼합하고 37℃에서 30분간 반응시켰다. Microplate reader(Infinite M200 Pro, Tecan Group Ltd., Zurich, Switzerland)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거활성은 아래 식에 대입하여 산출하였으며, 라디칼 소거활성(%) 값을 50% 감소시키는 scavenging concentration(SC)50 값으로 표시하였으며, 대조군은 ascorbic acid을 사용하였다.
두릅 열수추출물의 ABTS 라디칼 소거활성은 Van den Berg 등(1999)의 방법을 일부 변형하여 측정하였다. 증류수로 제조한 7 mM ABTS 용액에 2.4 mM의 potassium persulfate를 첨가한 다음 12시간 동안 반응시키고, 734 nm에서 흡광도 1.0이 되도록 증류수로 조정하였다. 농도별로 조제된 두릅 열수추출물 10 μL와 ABTS 용액 190 μL를 96-well plate에 혼합하고 10분간 상온에서 반응시킨 다음 microplate reader를 사용하여 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 두릅 열수추출물의 ABTS 라디칼 소거활성은 아래 식에 대입하여 산출하였으며, 라디칼 소거활성(%) 값을 50% 감소시키는 SC50 값으로 표시하였으며, 대조군은 ascorbic acid을 사용하였다.
Helicobacter pylori(H. pylori) 균주는 경상대학교 의학전문대학원 헬리코박터 균주은행으로부터 분양받아 실험에 사용하였다. 균주배양은 10% FBS가 첨가된 brucella agar 배지에 균주를 접종하고, 37℃, 10% CO2 배양기에서 배양하였다.
두릅 열수추출물의 항균 활성은 paper disc diffusion method를 이용하여 측정하였다. 농도별로 제조된 두릅 열수추출물을 paper disc에 100 μL씩 주입하고 30분간 건조한 다음, H. pylori가 도말된 brucella agar 배지에 삽입한 후 37℃, 10% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 이후 두릅 열수추출물에 의해 생성된 clear zone을 측정하였으며, 대조군은 amoxicillin을 사용하여 두릅 열수추출물과 항균 활성을 비교하였다.
두릅 열수추출물의 H. pylori에 대한 최소저해농도(minimal inhibitory concentration)는 broth-microdilution method(Takarada 등, 2004)를 이용하여 측정하였다. 96-well plate에 brucella broth 배지를 100 μL씩 분주하고, 농도별 두릅 추출물을 50 μL 분주한 다음 OD600 0.2로 조절한 균주액을 50 μL(0.5×107 CFU/mL) 첨가하여 24시간 동안 37℃의 10% CO2 배양기에서 배양하였다. 이후 microplate reader를 이용해 600 nm에서 균주의 생장을 확인할 수 없는 농도를 MIC로 하였다. 균이 생장하지 않은 혼합액을 brucella agar 배지에 도말하여 37℃에서 24시간 배양한 뒤, colony가 확인되지 않은 최소농도를 최소사멸농도(minimal bactericidal concentration)로 결정하였다.
RAW264.7 대식세포는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 분양 받아 10% fetal bovine serum, 100 unit/mL의 penicillin-streptomycin이 첨가된 Dulbecco’s Modified Eagle Medium 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
두릅 열수추출물의 처리에 따른 RAW264.7 대식세포의 생존율 측정은 Chamichael 등(1987)의 방법을 이용하여 측정하였다. 세포를 96-well plate에 1×105 cell/well로 분주하고, 24시간 동안 배양한 후 농도별로 희석된 두릅 추출물을 100 μL 첨가한 후 37℃의 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 배양한 후 0.5 mg/mL의 MTT 용액을 well에 50 μL 첨가하고 4시간 동안 반응시킨 다음 용액을 제거하고 실온에서 건조하였다. 이후 DMSO 200 μL를 첨가하여 각 well에 생성된 formazan 결정을 완전히 용해하고 microplate reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
두릅 열수추출물의 NO 생성억제능은 Green 등(1982)의 방법을 이용하여 측정하였다. RAW264.7 세포를 24-well plate에 5×105 cell/well로 분주하고 24시간 배양한 후, 농도별로 제조한 두릅 시료를 세포에 2시간 처리한 다음 LPS 1 μg/mL를 첨가하여 24시간 염증반응을 유도하였다. 이후 세포배양 상등액 100 μL와 griess 시약(0.1% N-(1-naphtyl) ethylenediamine과 1% sulfanilamide 1:1) 100 μL를 새로운 96-well plate에 혼합하여 10분간 반응시킨 후 microplate reader를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
RAW264.7 세포를 24-well plate에 5×105 cell/well이 되도록 분주하고, 24시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 농도별로 제조한 두릅 열수추출물을 세포에 2시간 처리한 다음, 각 well에 LPS 1 μg/mL를 처리하고 24시간 배양하였다. 이후 배양 상층액을 수거하여 실험에 사용하고, ELISA kit(ELISA MAXTM Deluxe Set, BioLegend, San Diego, CA, USA)를 이용하여 TNF-α, IL-1β, IL-6의 분비량을 측정하였다. 실험방법은 manufacturer’s instruction을 따라 측정하였다.
결과 및 고찰
식물계에 널리 분포되어 있는 식물성 polyphenol은 식물세포의 생성과 활성화에 영향을 주는 것으로 알려져 있다(Kim, 2009). 또한, 식물이 자외선 또는 병원성 미생물의 침입을 방어하기 위해 방출하는 물질로서 phenylalanine과 tyrosine으로부터 합성되며, 항산화, 항암, 항염증, 항균 등의 효능을 갖고 있다(Kim 등, 2018). 총폴리페놀 함량은 폴리페놀 산화·환원반응을 응용한 것으로 phosphomolybdic acid와 반응하여 청색으로 발색되는 원리를 이용하였다(Singleton과 Rossi, 1965).
두릅 열수추출물의 총폴리페놀 함량과 총플라보노이드 함량을 측정하여 Table 1에 나타내었다. 두릅을 80℃에서 물로 추출하였을 때, 총폴리페놀 함량은 186.8±2.7 mgGAE/g으로 나타났다. 두릅 열수추출물의 총폴리페놀 함량을 다른 식용 및 약용 식물 추출물과 비교하면, 아로니아 70% 에탄올 추출물의 117.2 mgGAE/g(Chung, 2014)보다는 높고, 돌단풀 물추출물의 183.8 mgGAE/g(Lee 등, 2011)과 비슷하였으며, 복분자 잎 물추출물의 190.7 mgGAE/g(Lee 등, 2014)보다는 낮게 나타났다. 플라보노이드는 폴리페놀에 속하는 성분으로 활성 산소종을 효과적으로 제거하여 항산화능이 높다고 알려져 있으며, 폴리페놀과 마찬가지로 항암, 항염증 및 항바이러스 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Kim 등, 2012). 두릅 열수추출물의 총플라보노이드 함량은 81.9±1.5 mgQE/g으로 나타내었다. 항산화능이 높다고 알려진 한방 식물류인 감초 및 오갈피나무의 플라보노이드 함량은 각각 55.3 mg QE/g, 44.0 mgQE/g으로 보고된 바 있는데(Kim 등, 2004), 두릅 열수추출물의 플라보노이드 함량이 이들 식물류보다 높은 수준이므로 항산화능이 높을 것으로 사료된다.
| Total polyphenolics (mg GAE1)/g) | Total flavonoid (mg QE2)/g) |
|---|---|
| 186.8±2.73) | 81.9±1.5 |
인체 내 항산화의 불균형은 질병을 유발하게 되므로 radical scavenging activity는 항산화 시스템의 중요한 인자로서 질병 예방에 효과적이다(Reis 등, 2012). 본 연구에서 DPPH와 ABTS 라디칼 소거활성을 측정한 결과는 Table 2와 같다.
| Sample | DPPH radical SC501) (μg/mL) | ABTS radical SC50 (μg/mL) |
|---|---|---|
| AHWE2) | 3,274.7±47.73) | 2,660.1±50.3 |
| Ascorbic acid | 192.2±2.1 | 101.8±1.2 |
항산화 활성 측정에 자주 활용되고 있는 DPPH는 항산화 물질과 반응하여 anion radical이 소거되면서 보라색에서 노란색으로 변하는 원리를 이용하여 항산화 활성을 측정한다. 두릅 열수추출물을 312.5-10,000 μg/mL의 농도 범위에서 DPPH 라디칼 소거활성을 측정한 결과, 19.0-73.2%의 활성을 나타내었으며 SC50 값은 3,274.7±47.7 μg/mL로 나타났다. 대조군으로 사용된 ascorbiac acid의 SC50 값인 192.2±2.1 μg/mL를 100%로 기준하여 두릅 열수추출물의 relative activity를 환산한 결과, 5.87%에 해당하는 수준으로 나타났다.
ABTS 라디칼 소거활성 측정도 DPPH를 이용한 방법과 함께 항산화 활성을 측정하는 데 자주 이용되는 방법이다. ABTS가 항산화 물질과 반응하여 cation radical이 소거되면서 청록색에서 무색으로 변하는 원리를 이용하여 측정한다(Pellegrini 등 1999). ABTS 라디칼 소거활성을 측정한 결과, 312.5-10,000 μg/mL의 농도 범위에서 8.2-63.7%의 활성이 측정되었으며, SC50 값은 2,660.1±50.3 μg/mL로 나타났다. 대조군으로 사용된 ascorbic acid의 SC50 값(101.8±1.2 μg/mL)을 기준으로 두릅 열수추출물의 relative activity를 확인한 결과, 3.83%에 해당하는 수준으로 나타났다.
두릅 열수추출물의 H. pylori에 대한 항균활성을 Paper disc diffusion 분석법을 이용하여 측정하였으며, 측정 결과는 Table 3, Fig. 1에 나타내었다. 일정하게 균을 도말한 배지에 두릅 열수추출물을 1-3 mg을 접종한 paper disc를 배치하고 24시간 후 disc 주변에서 clear zone을 확인하였다. 접종된 paper disc에서 1, 2 mg을 접종한 결과 각각 1.89 mm, 2.14 mm의 clear zone으로 확인되었고, 가장 고농도인 3 mg은 2.85 mm의 clear zone으로 확인되었다. 이를 통해 두릅 열수추출물이 H. pylori에 대해 항균활성 있음이 확인되었으나, 대조군 항생제인 amoxicillin은 0.1 mg 용량에서 9.62 mm의 clear zone으로 두릅보다 높은 항균활성이 나타났다. 하지만 amoxicillin은 담마진, 소양증, 천식 등 알레르기 반응을 유발시키는 부작용이 있으며, pbp1A 유전자의 돌연변이가 H. pylori의 amoxicillin에 대한 내성을 발현시키는 것으로 알려져 있다(Kim과 Oh, 2017; Lee 등, 2019).
| Sample | Concentration (mg/disc) | Diameter of clear zone (mm) |
|---|---|---|
| H. pylori | ||
| AHWE1) | 1 | 1.89 |
| 2 | 2.14 | |
| 3 | 2.85 | |
| Amoxicillin | 0.1 | 9.62 |
두릅 열수추출물이 H. pylori의 생육을 저해하는 데 필요한 최소농도를 확인하기 위하여 흡광도를 측정해 생장이 검출되지 않는 농도를 측정하였다. 또한, 최소의 사멸농도를 확인하기 위하여 최소저해농도가 나타난 이상의 농도를 배지에 도말하여 최소사멸농도를 확인하였다(Table 4). 두릅 열수추출물의 150 mg/mL 농도에서 최소저해농도를 나타났으며, 최소사멸농도는 400 mg/mL로 확인되었다. Lee(2014)의 연구에 따르면 소함흉탕 에탄올 추출물과 황련 총 알칼로이드의 H. pylori에 대한 최소저해농도는 각각 250 μg/mL, 50 μg/mL이었다고 보고되었으며, 백지 메탄올 추출물(Choi 등, 2018)의 최소사멸농도는 250 μg/mL이었다고 보고되었다.
| Sample | MIC (mg/mL) | MBC (mg/mL) |
|---|---|---|
| AHWE1) | 150 | 400 |
| Amoxicillin | 0.75 | 1.5 |
H. pylori의 감염에 의하여 위점막이 손상되면 대식세포가 침윤하고 염증세포는 NO의 독성에 의하여 위점막이 손상된다고 보고되었다(Mannick 등, 1996). 또한, 인체 내 과발현된 NO는 toxic radical로 작용하여 위점막을 손상시킬 뿐만 아니라, 파킨슨 병, 뇌막염 및 알츠하이머병과 같은 퇴행성 질환에 중요한 요인으로 작용한다(Chung 등, 2001; Kawamata 등, 2000). 따라서 본 연구에서는 MTT assay를 이용하여 RAW264.7 대식세포에 대한 두릅 열수추출물의 세포 독성을 확인하였다(Fig. 2). 두릅 열수추출물을 농도별(0, 25, 50, 75, 100 μg/mL)로 처리한 결과, 100 μg/mL 이하의 농도에서 99% 이상의 생존율을 보여 독성을 나타내지 않음을 확인하였다. 그러므로 독성이 나타내지 않은 100 μg/mL 이하의 농도에서 NO 생성 및 염증성 cytokine의 분비량을 측정하였다. LPS로 염증이 유도된 RAW264.7 세포에 두릅 열수추출물을 25, 50, 75, 100 μg/mL 농도별로 처리하여 NO 생성을 측정한 결과를 Fig. 3에 나타내었다. LPS 처리군에 대비 두릅 열수추출물 25, 50, 75, 100 μg/mL의 농도에서 각각 76.6±0.6, 72.5±0.5, 66.4±3.1, 56.3± 2.6%로 농도 의존적으로 NO 생성량이 감소됨을 확인하였다. 이를 통해 두릅 열수추출물에서 NO 생성의 억제가 확인됨에 따라 두릅은 다양한 염증인자들을 억제할 수 있을 것으로 사료된다.
Cytokine은 대식세포와 같은 면역세포가 분비하는 단백질로서 면역세포의 증식, 활성 및 분화 조절을 통해 염증을 활성화시키는 매개하는 인자이며, 염증반응을 조절하는 TNF-α, IL-1β, IL-6은 대표적인 pro-inflammatory cytokine으로 알려져 있다(Namkoong 등, 2015). LPS로 염증이 유도된 RAW264.7 세포에 두릅 열수추출물을 농도별로 처리한 후, 생성되는 TNF-α, IL-1β, IL-6의 생성량을 측정함으로써 두릅 열수추출물에 의한 염증성 cytokine의 생성 억제 효과를 검토하였다(Fig. 4). LPS로 인하여 RAW264.7 세포에서 TNF-α, IL-1β, IL-6 생성이 증가하였으나, 두릅 열수추출물(25, 50, 75, 100 μg/mL) 처리군에서는 농도 의존적으로 억제되었다. 두릅 열수추출물의 100 μg/mL 농도에서 TNF-α, IL-6의 생성량을 각각 31.9, 39.2%로 억제됨을 확인하였고 특히, IL-1β의 생성량을 61.1%로 억제시킴으로써 cytokine 중 가장 높게 억제되었다. 따라서 두릅 열수추출물은 염증성 cytokine의 생성 억제를 통해 항염증 효과를 나타냄을 확인하였다.
