1. 서론
태극삼은 맛과 향이 홍삼과 유사하여 일본, 대만, 홍콩 등에서 세절된 얇은 절편을 따뜻한 물로 장시간 우려내면서 즐겨 마시는 중요한 수출 품목(Lee와 Oh, 1995)이지만, 태극삼이 주로 생산되고 있는 우리나라에서는 널리 알려지지 않았다.
태극삼은 동남아시아 시장에서 홍삼의 수요가 급격히 증가하던 70년도에, 우리나라의 홍삼 전매제도의 시행으로 홍삼의 공급이 부족해지자 민간업자들이 홍삼 대체 품목으로 수출상품화한 것이다(Jang과 Jeong, 2014). 태극삼은 외형적으로 홍삼과 피부 백삼의 중간적 특성이 있 으나, 국내에서는 별도의 분류체계 없이 백삼으로 분류되고 있으며, 가공방법에서 원료 수삼의 증숙과 건조를 여러번 반복하여 검붉은 색을 나타내는 홍삼과는 달리, 원료 수삼을 열탕 담금 또는 증자하여 표피층만이 갈색을 나타내고 몸통의 내부는 백색이거나 아주 연한 담갈색을 나타내는 태극 모양으로 제조된다(Jang과 Jeong, 2014; Lee와 Oh, 1995).
태극삼은 태극 본삼, 태극 미삼 그리고 기타 태극삼류로 분류하며, 열탕침지공정이 홍삼가공의 증삼공정과 같이 열의 반응에 의해 사포닌이 많이 분포된 표피조직의 호화를 일으키는 과정으로 이루어져 있다(Jang과 Jeong, 2014). 초기 태극삼의 일반적인 제조방법은 수삼을 75-90°C의 열탕에서 20-25분간 침지한 후 60°C 이하에서 건조하여 제조했으나, 최근 열처리 방법으로 홍삼의 증숙 과정이 그대로 도입되면서 태극삼 제조업체별로 다양한 증숙 및 건조 방법이 개발되어 태극삼 제조방법으로 널리 사용되고 있다 (Ko 등, 1994; Lee와 Oh, 1995).
일반적으로 가공 인삼의 항산화 효과는 태극삼, 홍삼, 흑삼 등 제품의 종류에 따라 많은 차이가 있으며, 흑삼의 경우 열처리 중 Maillard 반응에 의해 생성된 갈변 물질이 홍삼보다 2배나 더 많아 높은 항산화 효능이 있는 것으로 알려져 있으나, 갈변이 많이 진행되지 않은 태극삼은 홍삼보다 항산화 효능이 더 낮은 것으로 알려져 있다(Kim 등, 2015). 태극삼, 홍삼 및 흑삼의 폴리페놀 함량은 흑삼이 8 mg/g으로 가장 많으나, 홍삼 4 mg/g, 태극삼 3 mg/g으로, 그 함량이 상대적으로 낮은 것은 증숙횟수나 열처리 시간이 증가함에 따라 폴리페놀 함량도 증가하는 것이 그 원인으로 알려져 있다(Han 등, 1992; Kim 등, 2015).
인삼의 진세노사이드 성분 중 시판 백삼의 Rg1, Re, Rb1의 평균 함량은 2.32, 2.35, 2.80 mg/g으로 조사되었으나, 일부 열처리가 된 시중 태극삼의 Rg1, Re, Rb1은 2.62, 2.13, 2.80 mg/g으로 백삼에 비해 Rg1과 Rb1은 증가하고 Re는 감소하는 것으로 알려져 있다(Hwang 등, 2005). 그러나 시판 태극삼의 총진세노사이드 함량은 평균 7.55 mg/g으로 기존의 백삼 진세노사이드의 함량과 유사하여 백삼 진세노사이드가 열처리에 따라 다양한 종류로 변환되는 것으로 알려져 있다(Hwang 등, 2005; Lee 등, 2013b).
본 연구에서는 태극삼의 제조과정 중 인삼의 표피층만 갈색으로 변화시키면서 홍삼의 우수한 기능성 성분인 ginsenoside Rg3, Rh1 등이 많이 발현되도록 하고자 하였다. 따라서 원료 수삼을 증숙 전에 초산 용액에 침지하여 표피층을 갈색화할 수 있을 정도의 적은 열처리로 태극삼을 제조하였으며, 반응표면분석을 이용하여 초산용액 침지에 의한 태극삼 진세노사이드의 변화과정을 모니터링하였다.
2. 재료 및 방법
본 실험에 사용된 수삼은 충남 금산에서 가을에 수확한 4년근 수삼을 깨끗이 세척하여 0°C 냉동고에 보관하면서 사용하였다. 본 실험에 사용한 시약은 acetic acid(Samchun Chemical, Seoul, Korea), methanol(JT Baker, Philipsburg, PA, USA), ginsenosides(Wako, Osaka, Japan), acetonitrile(JT Baker, Philipsburg, PA, USA), ethanol(Samchun Chemical, Seoul, Korea) 등이다.
수삼의 침지는 원료 수삼을 37°C의 5, 10, 15, 20, 25% 초산 용액에 0.5, 1.5, 2.5, 3.5, 4.5시간 침지한 후 홍삼제조기(Red ginseng maker, HD-WH210, Habdongjeongmil gigong, Anyang, Korea)에서 95°C로 1시간 증숙하였다. 증숙된 인삼은 50°C에서 30시간 건조한 후 상온에서 수분이 14% 이하가 될 때까지 건조하였다.
본 실험에서는 인삼의 초산용액 침지, 증자 및 건조 과정을 통해 새로운 태극삼을 제조하면서, ginsenosides 성분 및 함량을 모니터링하고자 실험계획에 의한 반응표면분석법을 이용하였다. 실험계획은 중심합성 실험계획법(Myers, 1971; Park, 1991)에 따라 실험을 설계하였으며, 반응표면 회귀분석은 protopanaxadiol ginsenoside Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Rg3과 protopanaxatriol ginsenoside Re, Rf, Rg1, Rg2, Rh1, 그리고 총진세노사이드 함량을 SAS program(ver. 9.4, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 사용하여 반응표면분석을 하였다(SAS, 1988). 중심합성 실험계획법으로 설계된 태극삼 제조의 요인변수는 침지용 초산용액 농도(X1)와 침지 시간(X2)으로 −2, −1, 0, 1, 2로 다섯 단계로 부호화하여 실험값을 Table 1, 2에 나타내었다. 또한, 이들 요인변수에 영향을 받는 반응변수들은 ginsenoside Rb1(Y1), Rb2(Y2), Rb3(Y3), Rc(Y4), Rd(Y5), Rg3(Y6), Re(Y7), Rf(Y8), Rg1(Y9), Rg2(Y10), Rh1(Y11) 및 total ginsenoside(Y12)로 하고, 3회 반복 측정하여 그 평균값을 회귀분석에 사용하였다.
제조된 태극삼의 진세노사이드를 추출 및 정제하였다 (Lee, 2020). 태극삼 100 g을 칭량 후 시료의 20배에 해당하는 80% 에탄올 2 L를 가하여 2시간 동안 환류 냉각하였다. 이는 10,000 rpm, 4°C에서 20분의 조건으로 원심분리(Micro 12, Hanil Sci. Inc., Incheon, Korea)하여 상등액을 분리하였다. 상등액은 에탄올을 제거한 후 증류수를 첨가하여 추출액이 200 mL가 되도록 하였다. 시료는 0.2%의 농도가 되도록 메탄올을 첨가한 후, 0.2 mL를 채취해 0.1% internal standard(IS, Digoxin, Sigma, MO, USA) 0.1 mL와 혼합하여 0.45 μm 시린지 필터로 여과하여 사용하였다. 진세노사이드 분석은 HPLC-ELSD를 이용하여 실시하였다. ELSD detector(PL-ELS 2100, Polymer Laboratories, Austin, TX, USA)가 장착된 Dionex HPLC(Ultimate 3000, Thermo Scientific, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하였다. ELSD의 튜브 온도는 95°C이고, 유입된 nebulizing gas는 N2로 2.0 L/min의 유속으로 하였다. Column은 Gemini 5 mm C18 column(250×4.6 mm, Phenomenex, Torrance, CA, USA)을 사용하였고, 이동상은 LC급 water를 A 용매로, LC급 acetonitrile을 B 용매로 사용하였다. Column 온도는 35°C로, flow rate는 1 μL/min으로 유지하였고, 시료는 10 mL씩 주입하였다. Gradient 조건은 0-20분 동안 B 용매를 30%에서 40%로, 20-45분 동안 40%에서 90%로 증가시켰다.
3. 결과 및 고찰
태극삼 제조공정 중 진세노사이드의 배당 부분인 glycone의 유리를 유도하기 위해 증숙 전에 초산에 침지하여 적은 열처리로 ginsenoside Rg3, Rh1 등을 발현하고자 하였다.
태극삼의 프로토파낙사디올계 진세노사이드로서 ginsenoside Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Rg3 등이 분석되었다. 설명될 분자식 중 당의 표기 방식은 Glc(glucose), Ara(pyranosyl arabinose), Xyl(xylose), Rha(rhamnose) 등으로 표기한다. 확인된 ginsenoside Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd 및 Rg3은 Fig. 1의 프로토파낙사디올계 진세노사이드 화학구조와 같이 aglycone의 3번 위치에 Glc-Glc가 붙어 있으나, 20번 위치에는 Rb1에 Glc-Glc, Rb2에 Glc-Ara, Rb3에 Xyl, Rc에 Glc-Ara, Rd에 Glc, 그리고 Rg3에 당이 없는 형태로 수산화(OH)기만 존재하는 성분이다(Nam, 1996).
태극삼의 초산용액 침지에 따른 ginsenoside Rb1, Rb2, Rb3, Rc의 변화를 분석한 결과, Rb1, Rb2, Rb3, Rc의 함량은 각각 1.39-3.70, 0.64-2.24, 0.08-0.26, 0.70-1.80 mg/g의 범위로 나타났다(Table 1). 이를 회귀분석한 결과, Rb1, Rb2, Rb3, Rc에 대한 모델식의 R2은 각각 0.8442, 0.8422, 0.7762, 0.7696으로 Rb1(p<0.1), Rb2(p<0.1)가 유의성이 인정되었다(Table 3).
Rb1 함량은 침지용 초산 농도의 영향력은 낮았으나 침지 시간의 영향은 유의적으로 나타나서 Rb1 함량 변화에 큰 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다(Table 3). Rb1은 열에 약하여 고온에서 장시간 열처리 시 분해되어 감소하는 것으로 알려져 있으며(Li 등, 2009), 태극삼의 Rb1 또한 침지 시간이 증가할수록 점점 더 줄어들어 다른 진세노사이드 성분으로 변환되면서 감소하였다(Fig. 2). Rb2, Rb3, Rc 함량은 Rb1 함량과 유사한 경향을 나타내었으며, 침지 시간의 영향을 주로 받고 있었다(Table 3, Fig. 2).
Ginsenoside Rb1, Rb2, Rb3, Rc 함량에 대한 능선분석 결과, 반응표면의 형태는 모두 최소점의 형태로 나타났으며(Table 4), Rb1 함량은 최대의 함량을 나타내는 조건인 초산 농도 13.48%에서 0.54시간 침지할 경우 3.69 mg/g으로 높게 나타났으며, Rb2, Rb3, Rc 함량은 각각의 최대 조건에서 2.22, 0.27, 1.84 mg/g으로 나타났다(Table 4). 시중에서 판매되고 있는 태극삼의 Rg1 함량은 초산용액을 침지한 태극삼 Rb1에 대한 최대 함량보다 25%나 낮은 2.80 mg/g이었다(Hwang 등, 2005).
그리고 인삼 가공 중 열이나 산의 영향에 따라 당의 유리로 생성되는 Rd, Rg3 함량은 각각 0.13-0.35, 0.02-0.42 mg/g의 범위로 약간의 차이를 나타내었다(Table 1). 이를 회귀분석하였으나 Rd, Rg3에 대한 모델식의 R2은 유의적이지 않았다(Table 3).
Ginsenoside Rd 함량에 대한 반응표면은 침지 시간이 경과할수록 점점 더 줄어들다가 침지 2시간 이상 경과하는 시점부터 증가하여 침지 4.5시간까지 급격히 증가하는 경향을 나타내었다(Table 4, Fig. 2). 이러한 현상은 프로토파낙사디올계 진세노사이드의 20번 위치에 있는 Rb1의 Glc-Glc, Rb2의 Glc-Ara, Rb3의 Glc-Xyl 그리고 Rc의 Glc-Ara에서 Glc 1개만 남기고 각각 Glc, Ara, Xyl이 떨어져 나가면서 새롭게 생성된 성분으로 여겨진다(Nam, 1996; Nam 등, 2015). 따라서 태극삼 프로토파낙사디올계 진세노사이드의 20번 위치에 있는 2번째 당은 초산 농도가 높고 낮음에 관계없이 초산이 충분히 수삼에 침투할 때 잘 유리되는 것으로 여겨진다(Lee, 1997; Nam, 1996). 백삼과 홍삼에 공통으로 들어 있는 Rb1, Rb2, Rc, Rd 등은 가공 중 열처리가 많이 이루어진 홍삼에 많으나, 백삼, 태극삼 및 홍삼 추출물을 가수분해한 경우에는 상대적으로 열처리가 적은 백삼과 태극삼에서 더 많이 가수분해되어 증가한다(Lee 등, 2013a).
홍삼, 흑삼 등에서 암세포의 전이 억제에 관여한다고 알려져 있는 ginsenoside Rg3(Mochizulki 등, 1995)은 침지용 초산 농도와 침지 시간의 영향이 모두 낮게 나타났으며, 유의성이 인정되지 않았다(Table 3). 반응표면 형태는 안장점의 형태로 나타났으며(Table 4), Rg3 함량에 대한 반응표면은 ginsenoside Rd 함량과는 달리 초산 농도가 증가하고 침지 시간이 경과할수록 급격히 증가하는 경향을 나타내었다(Fig. 2). 이것은 프로토파낙사디올계 진세노사이드의 20번 위치에 Rb1의 Glc-Glc, Rb2의 Glc-Ara, Rb3의 Glc-Xyl 그리고 Rc의 Glc-Ara가 떨어져 나가고 20번 위치에 OH기가 생기면서 Rg3가 생성되는 것으로 여겨진다(Nam, 1996). Rg3는 탈수반응으로 인하여 Rg5, Rk1으로 바뀌고 alycone의 3번 위치의 glucose가 유리되면서 Rh2로 전환하게 된다(Nam 등, 2015). 따라서 초산의 농도가 높은 조건에서 장시간 침지할 경우에는 aglycone의 20번 위치에서 당이 모두 유리되어 Rg3가 많이 생성되는 것을 확인할 수 있었다. 홍삼과 흑삼의 면역기능 등의 기능성에 크게 관여하는 Rg3의 함량을 증가시키기 위해서는, 초산 농도가 높은 용액에 침지하여 장시간 동안 초산 용액을 침투시키는 것이 더 효율적인 것으로 여겨진다. Nam 등(2012)은 흑삼의 증포횟수가 많아짐에 따라 Rg3 함량은 꾸준히 증가한다고 하였으나, Lee(2020)는 증자액에 초산 첨가 시 9번 찌고 말리는 흑삼 제조과정에서 증자 시간이 증가할수록 Rg3 함량이 비례적으로 증가한다고 하였다. 인삼의 가공을 통한 Rg3의 발현은 증포횟수를 늘리고 초산 용액에서 증숙함에 따라 증가하지만, 초산의 처리 조건에 따라 Rg3 발현의 정도가 크게 달라지는 것을 확인할 수 있었다.
태극삼의 ginsenoside Re, Rf, Rg1, Rg2, Rh1 등은 프로토파낙사트리올계 진세노사이드 성분으로 정량되었다. Re, Rf, Rg1, Rg2, Rh1 등은 aglycone의 6번 위치와 20번 위치에 당의 종류에 따라 분류된다(Nam, 1996). 프로토파낙사트리올계 진세노사이드 화학구조(Fig. 1)에서 Re는 6번에 Glc-Rha와 20번에 Glc, Rf는 6번에 Glc-Glc와 20번에 OH, Rg1은 6번에 Glc와 20번에 Glc, Rg2는 6번에 Glc-Rha와 20번에 OH, 그리고 Rh1은 6번에 Glc와 20번에 OH가 붙어 있다.
태극삼의 초산용액 침지에 따른 Re, Rf, Rg1, Rg2, Rh1의 변화를 분석해 본 결과, Re, Rf, Rg1, Rg2 및 Rh1 함량은 각각 1.30-3.04, 0.52-1.09, 1.32-2.56, 0.10-0.38, 0.02-0.21 mg/g으로 그 차이가 크게 나타났다(Table 2). 이를 회귀분석한 결과 Re, Rf, Rg1, Rg2, Rh1에 대한 모델식의 R2은 각각 0.9183(p<0.05), 0.9237(p<0.05), 0.9007 (p<0.05), 0.7683, 0.4439로 나타났으며, Re, Rf, Rg1만 유의성이 인정되었다(Table 3).
먼저, Re 함량에 대한 침지용 초산 농도의 영향은 F값이 6.15(p<0.1)로 높게 나타났으며, 침지 시간은 F값이 14.04 (p<0.05)로 Re의 함량 변화에 아주 크게 영향을 미치고 있었다(Table 3). 그리고 반응표면 형태는 최소점의 형태로 나타났으며(Table 3), 초산 농도가 높고 침지 시간이 길어질수록 Re 함량이 점점 더 줄어들어 다른 진세노사이드로 전환되는 것으로 나타났다(Fig. 3). Re 함량에 대한 최대값은 3.45 mg/g으로 시중에서 판매되고 있는 태극삼의 Re 함량의 평균 2.13 mg/g(Hwang 등, 2005)보다 높은 수치를 나타내어 초산용액 침지 효과가 있는 것으로 확인되었다. 그리고 Rf 함량에 대한 침지용 초산 농도의 영향은 F값이 4.93(p<0.1)으로 10% 이내의 유의수준에서 유의성이 인정되었으나, 침지 시간의 영향은 F값이 14.18(p<0.05)로 아주 높게 나타나 Rf의 함량 변화에 크게 영향을 미치고 있었다(Table 3). Rg1 함량에 대한 침지용 초산 농도의 영향은 F값이 3.01로 낮게 나타났으나, 침지 시간은 F값이 10.65(p<0.1)로 Rg1 함량 변화에 크게 영향을 미치고 있었다(Table 3). 따라서 Rf와 Rg1 함량 변화는 침지 시간의 영향을 크게 받고 있었고 침지 시간이 경과할수록 급격히 줄어들었다(Table 2, 3).
Ginsenoside Rg2 함량에 대한 침지용 초산 농도와 침지 시간의 영향은 유의적이지 않은 것으로 나타났다(Table 3). 반응표면 형태는 최소점의 형태로 나타났으며(Table 4), 3차원 반응표면은 낮은 초산 농도에서 침지 시간이 경과할수록 급격히 증가하였으나, 높은 초산 농도에서는 정반대로 침지 시간이 경과할수록 급격히 감소하는 경향을 나타내었다(Fig. 3). 이 경우, 낮은 초산 농도에서 Re의 20번 위치 Glc가 떨어져 나가면서 Rg2로 전환되어 생성속도가 빠르게 증가하지만, 높은 초산 농도에서는 Re의 20번 위치 Glc가 떨어져 나가면서 전환되는 속도보다 Rg2 aglycone의 6번 위치의 Rha가 떨어져 나가면서 Rh1으로 전환되는 속도가 더 빨라서 급격히 감소하는 것으로 여겨진다(Nam, 1996). 산에 의한 가수분해 반응은 수소이온 촉매로 일어나며, 가수분해 속도는 산의 수소이온의 농도와 반응 온도의 증가에 따라 증가한다(Lee, 1997).
그리고 프로토파낙사트리올계 진세노사이드의 최종 생성물인 Rh1 함량은 침지용 초산 농도와 침지 시간의 F값이 유의적이지 않았다(Table 3). 3차원 반응표면 형태는 안장점의 형태로 나타났으며(Table 4), Rh1의 반응표면은 초산 농도가 증가하고 침지 시간이 경과할수록 급격히 증가하는 경향을 나타내었다(Fig. 3). Rh1은 Re, Rf, Rg1, Rg2 등의 6번 위치와 20번 위치의 당이 떨어져 나가면서 생길 수 있는 진세노사이드로서, 높은 초산 농도에서 침지 시간이 장시간 경과할 경우 급격히 생성되는 것을 확인할 수 있었다. Re, Rf, Rg1 및 Rg2는 열처리에 따라 궁극적으로 Rh1으로 전환되면서 많이 감소하는 것으로 볼 수 있다(Nam, 1996). 이처럼 초산 농도, 침지 시간 등 조건변수의 변화에 따른 결과변수의 동적변화를 반응표면분석법을 통하여 모니터링함(Lee, 2018)으로써 산과 열처리에 따른 진세노사이드의 변화과정을 확인할 수 있었다.
태극삼의 초산용액 침지에 따른 총진세노사이드의 함량 변화를 분석해 본 결과, 총진세노사이드 함량은 7.07-15.51 mg/g의 범위로 큰 차이기 났다(Table 2). 이를 회귀분석한 결과 모델식의 R2은 0.9236(p<0.05)로 유의성이 인정되었다(Table 3).
태극삼의 총진세노사이드 함량에 대한 침지용 초산 농도의 영향은 F값이 5.24(p<0.1)였으나, 침지 시간의 F값이 14.19(p<0.05)로 아주 높게 나타나, 총진세노사이드 함량 변화에는 침지 시간이 더 크게 관여하였다(Table 3). 총진세노사이드 함량에 대한 능선분석 결과, 반응표면 형태는 최소점의 형태로 나타났으며(Table 4), 반응표면은 침지 시간이 짧은 조건에서 총진세노사이드 함량이 가장 높았으나, 침지 시간이 경과하면서 최저점인 2.45시간까지 감소하다가 다시 증가하는 경향을 나타내었다. 그러나 초산 농도에 따른 총진세노사이드 함량의 변화는 크지 않았다(Fig. 3). 이것은 인삼에 들어 있는 진세노사이드는 어떤 형태로든 가열처리가 되면 다른 진세노사이드로 변환되면서, 백삼에 많이 존재하는 진세노사이드 함량은 상대적으로 줄어드는 것을 보여준다. 그러나 홍삼이나 흑삼과는 달리 최소의 가공형태인 태극삼의 총진세노사이드 함량은 크게 변화되지 않고, 다른 진세노사이드로 변환되면서 다양한 진세노사이드가 생성되는 것으로 여겨진다.
태극삼은 법적으로 백삼으로 분류되고 있지만, 대만, 홍콩 등에서 기호성 차로 즐겨 마시고 있는 건강식품으로 한정되지 않도록, 국내에서도 건강 및 기호성 차로 개발되어 상품화되어야 할 것으로 여겨진다. 본 연구에서는 태극삼의 제조과정 중 초산 용액에 원료삼을 침지함으로써 백삼에서는 거의 발견되지 않는 Rg3, Rg2, Rh1 등의 성분이 많이 발현되는 것을 확인할 수 있었으며, 반응표면분석법을 통해 태극삼 제조과정 중 초산용액 침지가 백삼에 많이 들어있는 진세노사이드가 줄어들고, 상대적으로 홍삼에 들어있는 다양한 진세노사이드가 발현되는 과정을 확인할 수 있었다.
