가공 방법별 고들빼기 첨가 발효한 쌀막걸리의 품질 특성

본 실험에 사용된 쌀은 순천만 습지에서 생산된 유기농 흑두루미쌀과 순천 농협 하나로마트에서 구입한 순천 농협 나누우리 쌀을 혼합하여 사용하였으며, 막걸리 제조 용수는 일반 먹는 물을 사용하였다. 고들빼기 시료는 순천시 별량면 개랭이마을에서 재배한 토종 고들빼기[Crepidiastrum sonchifolium(Maxim.) Pak & Kawano]를 고들빼기영농조합법인에서 구입하여 줄기와 잎, 뿌리를 분리하고 자연풍에 하루 건조하여 물기를 완전히 제거하였다. 고들빼기를 5-6 cm 길이로 절단한 후 생체 그대로 믹서기(Hanil Co., Deajeon, Korea)에서 분쇄하였으며, 열수 추출물(121°C, 2시간)은 고들빼기영농조합법인에서 구입하였고, 열풍건조(60°C, 24시간) 후 믹서기(Hanil Co.)에서 분말화한 것, 설탕과 1:1 비율로 혼합하여 실온에서 60일 이상 항아리에서 발효 숙성시켜 고들빼기 당침액을 제조하여 사용였다. Table 1과 같이 발효제로는 시중에서 판매되고 있는 고두밥에 백국균(Aspergillus kawachii)을 배양시켜 제조한 입국 제품(Ricenuruk, Suwon, Korea)을 구입하여 사용하였고, 효모는 건조효모로 LALBIN Wine Yeast(EC1118, LALLEMAND Inc., Montreal, Canada)를 사용하였다.

순천만 간척지에서 재배된 유기농 흑두루미쌀과 순천 농협쌀을 1:1로 혼합하여 여러 차례 물로 수세한 후 3시간 이상 수침 후 물기를 빼고, 고압증기 솥에 넣어 121°C, 20분간 쪄서 고두밥을 지은 후 25°C 이하로 식혔다. 20 L들이 PET병에 Table 1와 같이 재료를 혼합하여 섞은 후 25±2°C 실온에서 6일간 Fig. 1과 같이 발효하였으며, 초기 1-2일간은 재료들이 고루게 발효될 수 있도록 혼합하였다. 발효 3일 이후에는 혐기적 발효가 이루어지도록 덮개로 밀봉하고, 에어락을 장착하였다. 발효 4일째에 고들빼기 가공 방법별로 소재를 첨가하여 혼합한 후 2일 동안 더 발효하였다.

제조된 고들빼기 쌀막걸리의 이화학적 특성을 조사하기 위한 시료 채취는 다음과 같이 실시하였다. 제조된 막걸리를 40 mesh 거름망을 통과시키고 건더기는 제거하고 얻어진 여액으로 알코올 함량을 측정하였으며, 여액의 상층액을 취하여 막걸리 발효액을 알코올 농도 8±0.5%가 되게 가수하여 조정한 후 pH, 당도, 적정산도, 유기산 등을 측정하였다.

막걸리 발효액의 발효 초기 알코올 함량은 거름 여액 시료 100 mL를 취하여 증류한 다음 주정계를 이용하여 측정하였으며, Gay Luccac Table을 이용하여 20°C로 보정하여 측정 결과를 얻었고(KNTSLAR 2023), 가용성 고형분(°Brix)은 여과한 시료를 원심분리기(Supra R17, Hanil, Kimpo, Korea)로 분리한 후 상층액 0.7 mL를 digital refractometer(PAL-31, ATAGO Co., Tokyo, Japan)를 사용하여 측정하였다.

Fig. 1. Procedure for the preparation of fermented rice makgeolli with addition of Crepidiastrum sonchifolium (Maxim.) Pak & Kawano by various processing methods.

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pH는 pH meter(PB-30, Satorius, Co., Geottingen, Germany)를 사용하였으며, 적정산도는 산-염기 적정법(KNTSLAR 2023)으로 막걸리 원심분리한 맑은 상층액을 20 mL를 취하여 1% phenolphtalein 지시약을 2-3방울 떨어뜨린 다음 0.1 N-NaOH로 중화 적정하여 pH 8.2까지 적정한 mL수로 lactic acid(%)로 환산하여 다음과 같은 식에 의해 계산하였다.

알코올 함량 8%로 조정한 후 4°C에서 30일간 저장 후 에탄올 함량과 메탄올 함량 측정은 GC/MSD(Model: Agillent 8697 headspace sampler, 8890 GC system, 5977B GC/MSD), column(HP-INNOWAX 60 m×0.25 mm I.D., d.f.=0.5)로 측정하였다. GC 분석 조건은 injection temp. 250°C, carrier gas He, constant column flow rate 1 mL/min, column temp. 40°C에서 5 min 동안, 1 min당 30°C/min씩 240°C까지 올려서 240°C에서 5 min간 총 분석 시간 15.5 min이었으며, injection volume은 1.0 μL MSD 조건은 ion source temp. 230°C, interface temp. 240°C, ionization method는 FID, measurement mode는 SIM로 분석하였다. 에탄올 100% 순도 표준물질(Accustandard, Inc., New Haven, Connecticut, USA)와 메탄올 표준물질(Accustandard, Inc.)을 GC/MS급으로 사용하였다.

총페놀 함량은 Folin-Denis의 방법(Mereno, 2000)에 따라 측정하였다, 시료 200 μL에 Folin-Denis reagent 200 μL를 가하여 6분간 방치 후 7% Na₂CO₃ 용액 200 μL를 가하였다, 1시간 30분 반응시킨 후 Microplate reader(MRX A2000, KLAB, Co., Deajeon, Korea)를 이용해 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질은 gallic acid(Sigma, Co., St. Louis, Missouri, USA)를 사용하였으며, 표준물질의 검량선과 비교하여 함량을 구하였다.

색도는 Color reader(CR-20, Konica Minolta, Co., Ltd., Tokyo, Japan)로 명도(L), 적색도(a), 황색도(b) 값을 측정하여 Hunter’s color value로 나타내었으며, 이때 대조구로 백판 (L=97.7, a=0.1, b=3.8)을 사용하였다.

유기산은 막걸리 발효액 상등액을 0.45 μm membrane filter로 여과한 후 ㈜휴텍스 Sep-pak C₁₈ cartridge에 통과시키고, high performance liquid chromatograph(Agilent 1260, Agilent Co., Santa Clara, CA, USA)로 Table 2와 같이 분석하였다. 이때 분석용 column은 Supelcogel C-610H(300 mm×7.8 mm, 9 μm)와 Osaka C₁₈(150 mm×2.1 mm, 2.7 μm)을 연결하여 분석하였으며, detector는 UV detector를 이용하여 210 nm에서 검출하였다. 이동상은 0.1% H₃PO₄ 용액(pH 2.5)을 사용하였으며 flow rate는 0.5 mL/min이었다. 시료의 1회 주입량은 20 μL이었으며, 유기산 표준품은 glucuronic acid, tartaric acid, malic acid, lactic acid, citric acid, acetic acid, fumaric acid(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 사용하였다.

본 연구에 사용된 4종의 고들빼기 쌀막걸리를 분리원으로 미생물 순수분리를 위해 각 시료 1 mL를 9 mL의 0.85% NaCl에 현탁 후 단계별로 희석하였다. MRS(Difco Co, Detroit, MI, USA), YM(Difco) 및 GYE(Difco) 배지에 시료 현탁액을 10⁵ 및 10⁶배로 희석 후 spreading 하여 평판배지에 100 μL를 도말하여 37°C에서 48시간 배양하였고, 배지 상에 형성된 집락의 형태학적 특징에 따라 순수분리하였다. 이들 중 Lactobacilli MRS(Difco)에서 집락을 형성하였으며, 분리주는 10% skim milk(Difco)를 혼합 후 −80°C 초저온냉동고(ilShinbiobase Co., Yangju, Korea)에 보관하여 본 연구에 사용하였다. 최종 선별 균주의 분자학적 동정 및 계통수 작성을 위해 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하였다. 미생물 동정은 ㈜마크로젠(Deajeon, Korea)에 분석 의뢰하였으며, 서열 증폭을 위해 universal primer인 27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)와 1492R (5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’) primer를 사용하였으며, National Center for Biotechnology Information(NCBI)에서 서열의 유사도가 높은 표준 균주들의 16S rRNA 유전자 서열을 얻었다.

DPPH(2,2′-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)는 짙은 자주색을 나타내며 그 자체가 질소 중심의 라디칼로서 라디칼 전자의 비 편재화되어 안정화된 상태로 존재한다. 쌀막걸리 발효액을 원심분리한 상등액을 0.2 mM DPPH 용액 200 μL와 5배 희석한 막걸리 발효 상층액 50 μL를 가한 후 30분간 실온 암실에서 방치 후 Microplate reader(MRX A2000, KLAB, Co.)를 이용해 517 nm에서 흡광도를 측정하였다(Kim 등, 2012). 비교 대상 표준물질은 ascorbic acid(Sigma Chemical Co.)를 농도별로 제조하여 음성 대조구는 증류수를 사용하였고, 활성은 실험구와 비교 표준물질 및 음성 대조구의 흡광도를 구하여 아래와 같이 백분율(%)로 나타내었다.

ABTS[2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] 라디컬 소거 활성은 7 mM ABTS 용액과 280 mM K₂S₂O 용액을 동량으로 섞어 암실에서 2-3시간 방치시켜 라디칼을 생성시킨 후 이를 무수 에탄올과 약 1:88 비율로 섞어 734 nm에서 대조구의 흡광도 값이 0.80±0.02가 되도록 에탄올로 조절하여 사용하였다. 5배 희석한 막걸리 발효 상층액 20 μL와 ABTS 용액 180 μL를 혼합하여 실온에서 6분간 방치 후 Microplate reader(MRX A2000, KLAB, Co.)를 이용해 734 nm에서 흡광도를 측정하였다(Kim 등, 2012). 비교 대상 표준물질은 ascorbic acid(Sigma, Co.)를 농도별로 제조하여 음성 대조구는 증류수를 사용하였고, 활성은 실험구와 비교 표준물질 및 음성 대조구의 흡광도를 구하여 아래와 같이 백분율(%)로 나타내었다.

실험 결과는 3회 이상 반복하여 결과를 도출하였으며, 결과값은 평균값±표준편차로 나타냈으며, 통계분석은 Microsoft (MS office 2021 Excel, Redmend, WA, USA)와 SPSS for Window(ver. 12.0, SPSS. Co., Inc., Armonk, NY, USA)를 사용하였다. 일원배치 분산분석(ANOVA)으로 평균과 표준편차를 분석하였다. 사후 검정으로는 Duncan’s multiple range test (p<0.05)를 실시하였다.

발효 4일째에 고들빼기 소재를 가공 방법별로 첨가하여 혼합한 후 2일 동안 발효시킨 쌀막걸리의 알코올 함량 및 가용성 고형분은 Table 3에 나타냈다. 막걸리 CS, CSE, CSP 및 CSS의 알코올 함량은 각각 14.50%, 14.50%, 13.50% 및 16.30%로 CSS가 가장 높게 알코올 발효가 진행된 것으로 나타났으며, 제품화 및 상품으로 출시하기 위해서는 가수하여 동일한 알코올 함량 8%으로 조정하였다. 비살균 막걸리는 저장 유통과정 중에 후발효에 의한 변화가 예측되므로(Park 등, 2011), 비교적 안정한 콜드체인시스템의 유통 조건인 4°C에서 30일간 냉장 보관 후 다시 알코올 함량을 측정한 결과는 각각 8.24%, 8.38%, 8.07% 및 8.48%로 CSS에서 0.48%의 가장 높은 알코올 함량 변화를 보였으며, 이는 당침액의 설탕인 이당류가 알코올 발효에 관여하여 다른 시험구에 비해 알코올 함량의 변화가 더 높은 것으로 판단되었으며, 다른 시험구의 막걸리에서는 0.5% 이하로 거의 변화가 없는 것으로 판단되었다.

가용성 고형분은 CS, CSE, CSP 및 CSS에서 각각 14.50 °Brix, 14.50 °Brix, 14.10 °Brix 및 15.70 °Brix로 CSS가 가장 높게 나타났으며, 4°C에서 30일간 저장한 후에는 각각 9.83 °Brix, 9.50 °Brix, 8.50 °Brix 및 11.03 °Brix로 초기 가용성 고형분에서 알코올 함량을 8.00%로 조정하면서 오는 차이로 CSS에서 가장 높은 가용성 고형분을 나타냈으며, 고들빼기 당침액에 함유된 당과 유기산 함량이 높은 수준의 가용성 고형분을 나타내는 것으로 판단되었다.

발효 4일째에 가공 방법별로 고들빼기 생체, 열수 추출물, 열풍건조 분말 및 당침액으로 각각 첨가 혼합하여 2일간 더 발효시킨 쌀막걸리의 알코올 함량 8%가 되게 가수한 후 pH, 적정산도, 메탄올 함량 및 폴리페놀 함량을 측정한 결과는 Table 4에 나타냈다.

pH는 초기 4.10-4.20에서 알코올 함량 8.0%로 조정한 후 CS, CSE, CSP 및 CSS에서 각각 3.85%, 3.81%, 3.77% 및 3.84%로 더 낮아졌으며, 적정산도는 젖산으로 환산하여 계산했을 때 CS, CSE 및 CSP 세 가지 시험구에서는 0.54%로 거의 비슷한 수준이었고, CSS만 0.58%로 높았다.

순수 쌀막걸리보다 고들빼기 식물체를 첨가함으로써 이상 발효가 진행되는지 확인을 위해 메탄올 함량을 GC/MS를 이용하여 확인하였는데, 네 가지 시험구 모두 분석되지 않아서 식물체인 고들빼기를 첨가해도 주세법 탁주의 기준 및 규격에 적합하게 제조할 수 있음을 확인하였다.

총폴리페놀 함량도 Table 4의 CS, CSE, CSP 및 CSS에서 각각 331.35 μg/mL, 354.50 μg/mL, 377.02 μg/mL 및 367.76 μg/mL로 고들빼기 분말을 직접 첨가한 막걸리인 CSP 시험구에서 유의적으로 가장 높게 나타났으며, 그 다음으로 고들빼기 당침액을 첨가한 CSS에서 높게 나타났으며, 고들빼기 생체 첨가 CS와 추출물 CSE가 가장 낮은 함량을 나타냈다.

가공 방법별 고들빼기 첨가 쌀막걸리의 색도에서 명도 L값, 적색도 a값 및 황색도 b값은 Table 5에 나타냈다. 고들빼기 가공 방법별 첨가한 막걸리의 명도 L값은 CS, CSE, CSP 및 CSS에서 54.10, 57.00, 48.50 및 58.90으로 고들빼기 당침액을 첨가했을 때 유의적으로 가장 높은 값으로 밝은색을 나타냈고, 고들빼기 분말을 첨가했을때는 가장 낮은 값으로 어두었다. 적색도 a값 또는 녹색도 −a값은 고들빼기 식물체와 분말은 녹색을 띄는데, CS는 0.50값을 CSE는 −0.30, CSP는 0.20, CSS의 a값은 −0.60으로 녹색도를 띄었다. 황색도 b값은 CS, CSE, CSP 및 CSS는 10.90, 7.20, 10.00 및 6.50을 각각 나타냈으며, CS와 CSP는 높은 황색도를 나타냈다. CSE와 CSP는 보다 더 높은 적색도를 나타냈으며, 밝기는 더 어두운색을 나타내 막걸리 빛깔의 기호도 측면에서 부정적인 영향을 미칠 것으로 사료되었다.

가공 방법별 고들빼기를 첨가해 발효 중에 생성된 쌀막걸리의 유기산 함량을 HPLC로 정량 분석한 결과는 Table 6과 같다. Glucuronic acid, tartaric acid, malic acid, lactic acid, citric acid, acetic acid, succinic acid, 및 fumaric acid를 표준물질로 분석한 후, 가공 방법별 고들빼기를 첨가해 발효한 쌀막걸리의 유기산을 분석한 결과, glucuronic acid는 CS와 CSS에서 10.30 μg/mL와 7.00 μg/mL였으며, CSE와 CSP에는 분석되지 않았다. Lee 등(2009)에 따르면 tartaric acid는 청량한 맛을 부여한다고 하였는데 CS에서 24.90 μg/mL였으며, CSS는 164.6 μg/mL로 가장 높게 분석되었다.

막걸리 제조 중 발효제로 입국을 이용하면, citric acid가 내산성 당화효소를 생산하기 때문에 술덧의 pH를 산성으로 유지되며, 누룩으로 양조할 때보다 발효를 안전하게 하고 양조 시간을 단축시키며, 알코올 수율도 높여주게 된다. 그리고 막걸리의 독특한 향이 없고 아미노산의 함량이 낮으며, 입국에서 오는 유기산의 신맛이 강하여 누룩으로 제조했을 때와 같은 다양하고 조화로운 향미가 없는 것으로 알려져 있다(So 등, 1999; Park 등, 2011).

본 연구에서는 입국 형태의 발효제를 이용하여 단순한 맛에 단맛과 쓴맛의 고들빼기 특유의 맛과 향으로 조화를 이루는 깔끔한 특징의 쌀막걸리 건배주를 개발하고자 하였다.

발효 중 생성되는 유기산으로 citric acid가 가장 많이 생성되었다. 이 citric acid는 막걸리가 부패하지 않고 안정된 발효가 이루어지도록 도와주는 것으로 보고하고 있다(Lee 등, 2009). 그 다음으로 많이 생성되는 유기산은 lactic acid, acetic acid, succinic acid, furmaric acid, malic acid, tartaric acid 및 glucuronic acid 순으로 생성되는 것을 알 수 있었다.

피로물질 제거에 큰 역할을 하는 것으로 알려진 유기산으로는 lactic acid, citric acid, succinic acid, tartaric acid 등이 보고되어 있으며(Song 등, 1997), 막걸리의 유기산 중 lactic acid와 citric acid는 주류 발효에 적합한 pH를 제공할 뿐만 아니라 주류에 청량감과 부드러운 신맛을 부여하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다고 보고하고 있다(Lee 등, 2009). 또한, 이의 유기산 함량 분석 결과는 Lee 등(2011)의 시중 유통 막걸리의 유기산 조성과 생리활성 연구에서 보고한 결과와 유사한 결과였다.

고들빼기 가공 방법별로 첨가했을 때, CS, CSE 및 CSP에서는 8종의 유기산 함량은 4,304.90-4,617.30 μg/mL로 큰 차이를 나타내지 않았으나, 고들빼기 당침액을 첨가한 CSS에서 6,159.90 μg/mL로, 월등히 높은 유기산 함량이 생성되는 것으로 나타났다. 이러한 결과로 가용성 고형분 함량이 높게 분석되었고, 이러한 분석 결과는 당산 비에 영향을 주어서 기호도가 우수할 것으로 예측되었다. 또한 Lee 등(2009)에 의하면 유기산은 맛을 내는 주성분이자 탁주 고유의 신선함을 부여하는 성분이지만 과잉의 유기산이 존재하면 막걸리의 맛은 떨어지게 되며, 보통 상품으로서의 막걸리는 pH 4.20 내외이며, 유기산은 0.8% 정도 함유하고 있다고 보고하였다. 본 연구에서는 고들빼기 가공 방법별 첨가한 쌀막걸리에 유기산은 0.43-0.62%로 신선함을 부여하는 유기산 함량을 지니는 것으로 사료되었다.

발효 4일째에 가공 방법별로 고들빼기 생체, 열수 추출물, 열풍건조 분말 및 당침액으로 각 첨가 혼합하여 2일간 더 발효시킨 쌀막걸리를 알코올 함량 8%가 되게 가수 한 후 4°C에서 30일 저장 후 막걸리 현탁액에 있는 미생물을 분리 동정한 결과, MRS 배지에 고들빼기 당침액을 첨가한 CSS에서만 균이 분리되었으며, 그 결과는 Table 7과 같다. 최종 선별 균주의 분자학적 동정 및 계통수 작성을 위해 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하였으며, 서열 증폭을 위해 universal primer인 27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)와 1492R(5’-TACGGYT ACCTTGTTACGACTT-3’) primer를 사용하였으며, National Center for Biotechnology Information(NCBI)에서 서열의 유사도가 높은 표준 균주들의 16S rRNA 유전자 서열을 얻은 결과, Lacticaseibacillus paracasei와 Lentilactobacillus hilgardii가 분리 동정되었다. L. paracasei는 식품원료 미생물로 확인되었으며, L. hilgardii는 주류(알코올발효 포함) 제조에 한하여 사용 가능한 것으로 확인되었다(FSK, 2024).

DPPH radical은 비교적 안정한 free radical로 항산화 물질에 의해 환원되어 탈색되므로 항산화능을 측정할 때 많이 이용되며, 비교적 빠르고 간단하여 널리 사용되고 있는 방법이다(Kim 등, 2012). 고들빼기를 가공 방법별로 첨가해 발효한 쌀막걸리의 DPPH radical 소거능을 측정한 결과는 Fig. 2에 나타냈다. 대조 표준물질로써 ascorbic acid의 농도 10, 25, 50, 100 및 200 ppm에서는 각각 10.58%, 18.90%, 35.10%, 63.89% 및 92.69%의 radical 소거능을 나타냈으며, 가공 방법별 고들빼기를 첨가한 쌀막걸리 중 CSP에서 56.43%로 가장 높은 radical 소거능을 나타냈으며, 그 다음으로 고들빼기 당침액을 첨가한 CSS에서 52.61%의 고들빼기 추출물인 CSE에서는 45.30%, 고들빼기 생체를 넣은 것은 44.14%의 radical 소거능을 나타냈다. 이는 총페놀 화합물 함량의 경향과 유사하며, 고들빼기에 함유된 총페놀 화합물에 기인한 것으로 사료되며, 총페놀 화합물의 자유 라디컬이 수소 원자를 공급함으로 DPPH 시약의 radical 소거능에 기여한 것으로 판단된다.

Fig. 2. DPPH radical scavenging of fermented rice makgeolli with addtion of Crepidiastrum sonchifolium (Maxim.) Pak & Kawano by various processing methods. CS, Crepidiastrum sonchifolium; CSE, extract of CS; CSP, dry powder of CS; CSS, syrup of CS. Ascorbic acid concentrations as the control are 10-200 ppm. All values are mean±SD (n=3) and different superscript letters (^a-c) on the bar indicate significant differences (p<0.05) by Duncan’s multiple range test.

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ABTS[2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazilin-6-sulfonic acid) diammonnium salt]와 potassium persulfate의 반응에 의해 생성된 ABTS free radical이 발효한 막걸리의 항산화 물질에 의해 제거되어 radical 특유의 청록색이 연한 녹색으로 탈색되는 것을 이용하여 항산화력을 측정하는 방법이다(Kim 등, 2012). 고들빼기를 가공 방법별로 첨가하여 발효한 쌀막걸리의 ABTS radical 소거능은 Fig. 3에 나타내었다. 대조 표준물질로써 ascorbic acid는 10, 25, 50, 100 및 200 ppm의 농도에서 소거능을 측정했을 때 각각 4.35%, 7.53%, 18.71%, 45.60% 및 95.11%의 ABTS radical 소거능을 나타냈으며, 고들빼기 가공 방법별로 첨가해 발효한 쌀막걸리의 ABTS 라디컬 소거능은 CSS 및 CSP가 각각 64.61% 및 64.35%로 CS 및 CSE가 각각 63.77% 및 63.45%로 비슷한 수준이었으며, 각기 통계적으로는 유의한 차이를 나타냈다. ABTS 라디컬 소거능은 총페놀 함량의 수준과 비슷한 경향은 나타나지 않았으나, 쌀막걸리 4종 모두 대조 표준물질인 ascorbic acid 150 μg/mL 수준의 항산화력을 나타내었다.

Fig. 3. ABTS radical scavenging of fermented rice makgeolli with addtion of Crepidiastrum sonchifolium (Maxim.) Pak & Kawano by various processing methods. CS, Crepidiastrum sonchifolium; CSE, extract of CS; CSP, dry powder of CS; CSS, syrup of CS. Ascorbic acid concentrations as the control are 10-200 ppm. All values are mean±SD (n=3) and different superscript letters (^a-c) on the bar indicate significant differences (p<0.05) by Duncan’s multiple range test.

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