서 론
생체 내에서 발생하는 활성산소(reactive oxygen species) 는 생체막의 구성 성분인 불포화지방산을 공격하여 과산화 물을 축적시키며, 이로 인해 생체 기능의 저하나 노화 및 각종 성 인병을 유발시킨다. 이러한 활성산소에 대응하는 항산화 활성은 페놀 함량과 상관관계에 있고, 또한 두개 이상의 수산기(-OH)를 가지는 페놀성 물질은 항산화 작용 과 항균 작용도 갖는다고 보고되었다(1,2). 최근 항산화 활 성 연구에서 살구를 비롯하여 포도, 복숭아 등의 종자가 잎이나 과실에 비해 높은 항산화능을 갖는다고 보고되었으 며(3,4), 이에 따라 과육을 섭취하고 버려지는 종자 등을 활용할 수 있는 방안을 모색해야 할 필요성이 점차 대두되 고 있다.
복숭아(Prunus persica L. Batsch)는 장미과(Rosaceae), 자 두속(Prunus), 복숭아과속(Amygdalus)에 속하는 온대 낙엽 성 과수로서, 주성분은 수분과 당분이며 유기산, 에스테르, 펙틴 등도 풍부하고 과육은 aspartic acid, serine과 같은 아미 노산을 많이 함유하고 있다(5). 복숭아 관련 항산화 및 항염 증 연구에서는 야생 복숭아 가지의 에틸아세테이트 추출물 이 천연 항산화제인 tocopherol 및 합성 항산화제인 BHA보 다 탁월한 항산화 효과를 나타내고, hyaluronidase 저해에 의한 항염증 효과 시험에서는 항염증 표준품인 ketoprofen 보다는 활성이 낮으나, ibuprofen과 indomethacin보다는 높 은 항염증 효과가 나타난다는 연구가 보고되었다(6). 저장 성 시험에서는 46℃의 열풍 처리로 전반적인 품질은 우수해 졌으며, 폴리페놀 및 플라보노이드 함량과 이에 따른 항산 화 활성은 대조군과 큰 차이를 보이지 않았고(7), 복숭아 과피와 과육의 에틸아세테이트 추출물은 ascorbic acid에 견줄만한 높은 항산화 활성과 항균 활성을 가진다고 보고되 었다(8). 또한, 예로부터 민간에서 한약재로 많이 사용되었 던 도인에 관한 연구로는 죽상동맥경화 예방, 항혈전기능 등 심혈관계 질환에서 우수한 생리적 효과가 보고되었으며 tyrosinase 저해활성이 강한 안식향산 등에 의한 효소적 갈 변현상 억제, in vivo와in vitro에서 화학적, 생물학적인 인자 에 의한 DNA의 손상을 감지하는 comet assay를 이용한 평가에서 복숭아 종자 추출물은 방사선에 의한 림프구 DNA손상에 대한 방어효과를 가진다고 보고하였다(9-11).
위의 연구결과에서 보는 바와 같이 대부분 과실의 과육 과 종자에 관련된 연구는 많았지만, 복숭아 핵에 관련된 연구는 거의 없는 실정이다. 또한 복숭아의 품종별 종자 및 핵의 기능성 성분의 탐색에 대한 연구결과가 미비한 상태이므로 본 연구에서는 국내에서 재배되고 있는 복숭아 의 품종별 핵과 종자를 이용하여 항산화 및 항염증 활성에 관한 연구를 실시하고, 이에 따른 상관관계를 파악하여 기 능성 식품 및 생리활성 소재를 개발하는 기초자료로 활용하 고자 한다.
재료 및 방법
본 연구에 사용한 복숭아(P. persica L. Batsch)는 2014년 경상북도 농업기술원 청도복숭아연구소의 포장에서 수확 한 품종으로 외관이 양호하고 신선한 것으로 균일하게 선별 하였으며, 미황(Mihwang)은 6월 하순, 가납암백도(Kanoiwa Hakuto)와 천홍(Cheonhong)은 각각 7월 하순에 수확하여 사용하였다. 미황은 청도복숭아연구소에서 육성한 품종으 로 과피에 털이 있는 조생종 황육계통이고, 가납암백도는 털이 있는 유모종 백육계통이며, 천홍은 털이 없는 무모종 황육계통이다. 수확 후 과육을 제거한 핵을 건조하여 종자 와 분리한 후 각각 실험에 사용하였다. 각 품종별 과실 특성 은 Table 1에 나타내었다.
각 품종별 복숭아의 분리한 핵과 종자를 각각 건조한 후 분쇄하여 polyethylene bag으로 포장하여 -40℃ 냉동고에 보관하면서 시료로 사용하였다. 분석 시료는 분쇄된 각 시 료 5 g에 80% 에탄올을 1:10(w/v)의 비율로 1일간 75℃, 130 rpm에서 진탕추출한 후(HK-SI25C, Hankuk S&I Co., Hwaseong, Korea) 여과지(No.2, WhatmanTM International Ltd., Maidstone, UK)로 여과하여 얻은 용액을 감압농축기 (OSB-2000, Eyela Co., Tokyo, Japan)로 농축한 후 DMSO (Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 용매 로 하여 10 mg/mL 및 20 mg/mL의 농도로 설정하여 실험에 사용하였다.
총 phenol 함량은 Folin-Denis 방법을 변형하여 측정하였 다(12). 96-well plate에 시료액(20 mg/mL) 2 μL를 증류수 20 μL와 Folin-Ciocalteu's phenol reagent(Sigma-Aldrich Chemical Co.) 10 μL를 첨가하여 실온에서 6분간 반응시키 고, 7% Na2CO3 용액 100 μL와 증류수 70 μL를 첨가하여 실온에서 90분간 반응시킨 후, 595 nm에서 흡광도를 측정 하였다. 표준물질로 gallic acid(Sigma-Aldrich Chemical Co.)를 사용하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 검량선 을 작성한 후 phenol 함량을 산출하였다.
총 flavonoid 함량 측정은 Zhishen 등의 방법을 변형하여 측정하였다(13). 96-well plate에 시료액(20 mg/mL) 2 μL를 증류수 100 μL와 5% NaNO2 용액 5 μL를 혼합하여 실온에 서 10분간 반응 시키고, 10% AlCl3·6H2O 용액 10 μL를 첨가하여 다시 실온에서 10분간 반응시킨 후, 1 M NaOH (Sigma-Aldrich Chemical Co.) 용액 40 μL와 증류수 45 μL를 첨가하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 catechin(Sigma-Aldrich Chemical Co.)을 사용하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 검량선을 작성한 후 총 flavonoid 함량을 산출하였다.
DPPH radical 소거 활성 측정은 Blois의 방법을 변형하여 측정하였다(14). 96-well plate에 시료액(20 mg/mL) 2 μL와 50% 에탄올에 녹인 40 mM DPPH(Sigma-Aldrich Chemical Co.) 용액 198 μL를 가하여 총액의 부피가 200 μL가 되도록 하였다. 이 반응액을 실온에서 빛을 차단하여 약 10분간 반응시킨 후 분광광도계로 517 nm에서 흡광도를 측정하였 다. 결과는 추출물의 첨가구와 무 첨가구의 흡광도를 통해 백분율로 나타내었다.
FRAP assay는 Benzie 등의 방법을 변형하여 측정하였다 (15) 실험을 위한 반응액은 300 mM acetate buffer(pH 3.6), 10 mM 2,4,6-tripyridyl-s-triazine(TPTZ)(Sigma-Aldrich Chemical Co.), 20 mM FeCl3·6H2O(Sigma-Aldrich Chemical Co.)을 10:1:1의 부피비로 섞어서 제조하였으며, 실험 직전 에 만들어 사용하였다. 96-well plate에 시료액(20 mg/mL) 6 μL와 FRAP 용액 194 μL를 혼합한 후 실온에서 빛을 차단한 상태로 10분간 반응시킨 후 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 무첨가구(DMSO)에 대한 첨가구의 fold 값으로 나타내었다.
CUPRAC assay는 구리 이온의 환원력을 이용하여 radical 을 환원시킬 수 있는 능력을 확인하는 방법으로 Apak 등의 방법을 변형하여 측정하였다(16). DW:10 mM CuCl2:75 mM neocuproine(Sigma-Aldrich Chemical Co.)을 100:1:1의 부피비로 혼합하여 실험 직전에 사용하였다. 96-well plate 에 시료액(20 mg/mL) 6 μL와 CUPRAC 용액 194 μL를 혼합 한 후 37℃에서 빛을 차단한 상태로 20분간 반응시켜 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 FRAP assay와 마찬 가지로 무첨가구(DMSO)에 대한 첨가구의 fold 값으로 나 타내었다
본 실험에 사용된 RAW 264.7 세포주와 BV2 세포주는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. RAW 264.7 세포주는 10% FBS (Standard fetal bovine serum, HyClone, Logan, UT, USA), penicillin G(Sigma-Aldrich Chemical Co., 100 IU/mL)와 streptomycin(Sigma-Aldrich Chemical Co., 100 μg/mL)이 첨 가된 DMEM 배지를 사용하여 CO2 incubator(5% CO2, 95% air)에서 37℃의 조건으로 배양하였다. 각 실험에서 세포는 시료를 lipopolysaccharide(LPS, Sigma-Aldrich Chemical Co.) 첨가 1시간 전에 처리하여 배양한 후, 1 μg/mL 농도의 LPS를 처리하여 실험을 진행하였다. 또한 생쥐의 뇌신경소 교세포(mouse microglial cell line)인 BV2 세포도 위의 조건 과 동일한 조건에서 배양하였다.
RAW 264.7 세포에서 복숭아 핵 및 종자 추출물의 세포 독성을 확인하기 위해 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide(MTT) 시험법을 실시하였다. RAW 264.7 세포를 5×105 cells/mL로 96-well plate에 접종하 고, 1시간 배양 후, 시료를 100 μg/mL의 농도로 처리하여 1시간 동안 배양하였다. 시료가 처리된 세포에 LPS를 1 μg/mL의 농도로 처리한 다음 37℃에서 22시간 배양시켰다. 배지에 희석된 MTT(Sigma-Aldrich Chemical Co.) 용액(0.5 mg/mL)을 세포에 처리하여 4시간 후 MTT를 환원시켜 생 성된 formazan이 배지에서 분리되지 않도록 배지를 제거하 였다. 생성된 MTT-formazan은 DMSO에 용해시켜 540 nm 에서 흡광도를 측정하였다.
결과 및 고찰
품종별 복숭아 핵과 종자를 에탄올로 추출하고 총 phenol 함량과 총 flavonoid 함량을 측정한 결과는 Table 2와 같다. Polyphenol 화합물은 분자 하나에 phenol 그룹이 한 개 이상 있는 것으로 식물에서 널리 발견된다(17). Polyphenol의 많 은 수산기는 반응성이 높은 활성 산소 제거에 쓰이며, 여러 단백질 내에 존재하는 sulfhydryl(-SH) 그룹 및 다른 단백질 부분과 결합하는 성질이 있기 때문에 병원균에 대한 항균 작용, 신체대사에 작용 하는 효소 활성 변화 촉진, 유전자 발현 촉진 등의 작용을 한다. 또한 활성 산소 제거 및 노화 억제 등의 항산화 기능을 가지고 있어 각종 질환 치료 및 예방에 이용되고 있다(18). 미황, 가납암백도 및 천홍 핵의 총 phenol 함량은 각각 89.78±1.51, 207.16±2.40 및 218.50±7.21 mg GAE/g 으로 나타나 미황 핵의 phenol 함량 에 비해 가납암백도 핵은 2.3배, 천홍 핵은 2.4배 더 높은 함량을 보였다(p<0.05). 반면, 미황, 가납암백도 및 천홍 종자의 총 phenol 함량은 각각 20.39±0.08, 33.00±0.33 및 24.15±0.14 mg GAE/g 으로 나타나 가납암백도 종자의 총 phenol 함량이 가장 높은 것으로 나타났다.
Flavonoid는 flavone을 기본 구조로 갖는 식물의 황색 계 통의 색소의 총칭으로 phenol류도 그 안에 포함된다(19). Flavonoid는 유해산소 및 지질 산화를 방지하는 항산화능 뿐만 아니라 항균, 항암, 항염증, 항동맥경화 등의 효과가 있는 것으로 알려져 있다(20). 미황, 가납암백도및 천홍 핵 의 flavonoid 함량은 각각 28.11±0.11, 110.36±2.16 및 172.22±2.62 mg CE/g으로 나타나 미황 핵의 flavonoid 함량 에 비해 가납암백도 핵은 3.9배, 천홍 핵은 6.1배 더 높은 함량을 보였다(p<0.05). 반면 종자의 flavonoid 함량은 미황, 가납암백도 및 천홍에서 각각 10.59±0.49, 5.88±0.06 및 6.77±0.11 mg CE/g이었으며 미황 종자의 flavonoid 함량이 가장 높았는데, 이는 가납암백도와 천홍과 유의적인 차이 를 보였다.
복숭아 품종별 핵과 종자 추출물의 항산화 활성 결과는 Table 3과 같다. 비교적 안정한 radical인 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl(DPPH)은 항산화 활성을 갖는 물질과 만나면 환원되어 색이 탈색되는 점을 이용한 항산화 활성 측정 방법으로 DPPH의 환원 정도를 기준으로 측정물질의 환원 력과 항산화력을 확인하는 방법으로 알려져 있다(21). 복숭 아 품종별 핵과 종자의 DPPH 항산화 활성을 비교한 결과, 천홍 핵이 74.2±1.0%로 가장 높은 radical 소거능을 나타냈 으며, 가납암백도와 미황이 각각 73.3±3.6%, 32.8±1.4%의 소거능을 나타냈다. 또한, 종자에서는 천홍이 19.7±0.3%의 소거능을 나타냈으며 미황과 가납암백도가 각각 17.2± 0.9%, 13.9±0.9%로 나타내었다(Tabel 3). 이는 핵 추출물에 서 천홍과 가납암백도의 높은 phenol과 flavonoid 함량에 기인하는 것으로 판단되며, 총 phenol 및 flavonoid 함량의 증가에 따른 높은 항산화 활성 증가에 대한 연구 결과와 일치하였다(22).
FRAP에 의한 항산화 활성은 free radicals 없이 electron transfer에 기초한 방법으로 시료 추출물 처리 후 ferric tripyridyltriazine(Fe3+-TPTZ)을 ferrous tripyridyltriazine(Fe2+- TPTZ)으로 환원시키는 능력을 측정 하는 방법이다(23). 3 품종의 핵과 종자의 FRAP value를 확인한 결과, 무첨가구 에 비해 핵 추출물에서 각각 천홍, 가납암백도, 미황이 26.8 배, 23.8배, 12.4배의 순으로 높은 활성을 나타내었고, 천홍 이 유의적으로 가장 높은 활성을 나타내었다. 반면 종자의 FRAP 수치는 천홍과 가납압백도가 무첨가구에 비해 4.9배 의 활성을 나타내었고 미황 종자는 3.4배의 활성을 나타내 었다. Table 4
CUPRAC활성은 구리이온(Cu2+)의 전자를 받아들어 Cu+ 로 환원되는 것을 이용한 방법으로 추출 시료의 Cu2+의 환원되는 능력을 통해 항산화 능력을 확인하는 방법이다 (24). 품종별 복숭아 핵과 종자 추출물에서는 무첨가구 대비 가납암백도 핵이 10.3배의 활성을 나타났으며, 천홍과 미황 이 각각 8.8배와 8.1배의 활성이 관찰되었다. 종자 추출물에 서의 CUPRAC 활성은 무첨가구에 비해 천홍, 가납암백도, 미황 순으로 각각 4.9배, 4.5배 그리고 3.8배의 활성을 나타 내었다.
본 연구에서는 복숭아 3품종의 핵과 종자 추출물의 항염 증 활성을 조사하기 위해 LPS 자극에 의해 유도된 RAW 264.7 대식세포(macrophage)와 BV2 소교세포(microglia)의 염증 반응에서 nitric oxide(NO)의 억제 활성을 측정하였다. 면역세포중의 하나인 대식세포는 내재면역뿐만 아니라 적 응면역 등 다양한 숙주 반응에 관여하여 많은 항염 작용 연구에 이용되고 있다(25). BV2 소교세포(microglia)는 뇌 에 존재하는 대식세포로 monocyte에서 분화되어 중추신경 계에 있는 비신경세포로 병원균 감염이나 뇌 손상에 대해 반응해 염증성 cytokine, 단백질 분해 효소, 활성 산소 등을 생성하여 보호하는 면역세포이나, 만성 염증이 유발하면 뇌 조직의 손상 및 세포사가 유발되기 때문에 신경 퇴행성 질환의 주요 원인이 되는 것으로 알려져 있다(26,27).
품종별 복숭아 핵과 종자의 항염증 활성을 측정한 결과 는 Fig. 1, 2와 같다. RAW 264.7 세포에서 각각의 핵 추출물 을 100 μg/mL의 농도로 처리한 실험구에서의 NO 생성량은 미황이 대조구에 비해 29.60±3.09%로 관찰되었고, 가납암 백도는 26.49±8.02%, 천홍은 42.10±10.72%로 관찰되었으 며, 품종간의 항염 활성 비교에서 3품종 모두 유의적인 차이 를 나타내지 않았다(Fig 1A). 종자 추출물을 100 μg/mL의 농도로 처리한 실험구에서는 각각 미황이 76.08±1.40%, 가납암백도가 59.16±11.92% 그리고 천홍이 73.61±7.24% 로 3품종 모두 유의적인 차이를 나타내지 않았으며, 핵 추출 물에 비해 낮은 항염 활성이 관찰되었다(Fig 1B). 또한, BV2 세포에서 3품종의 핵 추출물의 NO 생성량은 대조구에 비해 각각 미황은 9.05±4.02%, 가남압백도는 21.68±14.33% 그 리고 천홍은 35.03±8.95%로 관찰되었다(Fig 2A). 특히 미황 과 가납암백도 핵 추출물의 경우 LPS를 처리하지 않은 무처 리구의 NO 생성량과 대비하여 적은양의 NO가 관찰되어 강력한 항염 활성을 나타내었으며, 천홍 핵 추출물에 비하 여 7.98-38.95% 높은 항염 활성을 나타내었다. 또한, 종자 추출물을 처리한 실험구에서는 미황이 52.63±3.89%, 가납 암백도는 43.56±13.97%, 천홍은 56.45±2.73%의 NO 생성 량을 나타내었으며, 품종간의 항염 활성 비교에서 3품종 모두 유의적인 차이를 나타내지 않았다(Fig 2B). 본 연구의 결과로 복숭아 3품종의 핵 추출물은 RAW 264.7 세포 및 BV2 세포에서 강력한 항염 활성을 나타내는 것으로 관찰 되었으며, 종자 추출물에서도 대조구에 비해 비교적 높은 항염 활성을 나타내었다. 이와 같은 연구결과는 복숭아 3품 종의 핵과 종자가 전반적으로 염증 반응의 억제 뿐 만 아니 라 뇌질환 관련 염증 치료 소재 개발의 기초자료로 충분한 가치가 있다고 판단된다.
복숭아 3품종 핵과 종자의 총 phenol 및 총 flavonoid 함량 의 상관성이 0.941로 유의적인 높은 상관관계를 나타냈다 (p<0.01). 항산화 활성간의 상관성은 FRAP 활성과 DPPH 활성 간의 상관성(0.970, p<0.01), CUPRAC 활성과 DPPH 라디칼 소거능 간의 상관성(0.900, p<0.01) 그리고, CUPRAC 활성과 FRAP 활성의 상관성(0.853, p<0.01)순으 로 모두 유의적으로 정(+)의 관계가 확인되었다. 이에 반해 총 phenol 및 총 flavonoid 함량은 항산화 활성들 간의 상관 관계에서 유의적인 상관성을 나타내지 않았다. 이는 핵과 종자의 항산화 활성이 flavonoid성 phenol 화합물이 아닌 non-flavonoid성 phenol 화합물의 작용에 의한 것으로 예상 되었다. 또한 항염 활성과 항산화 활성들 간의 상관성은 낮게 확인되었으며 항염 활성과 총 phenol 및 flavonoid 함량 간은 낮은 상관관계를 나타내며 이는 flavonoid성 phenol 화합물이 항염 반응에는 낮게 관여한다는 것을 확인 할 수 있다. 따라서 본 연구에서 복숭아 3품종 핵과 종자의 non-flavonoid성 phenol 화합물이 다양한 항산화 활성뿐 만 아니라 항염 세포 활성에 작용 할 것이라 사료된다.
요 약
본 연구에서는 현재 재배되고 있는 복숭아 품종 중 미황, 가납암백도 및 천홍의 핵과 종자를 이용하여 항산화 및 항염증 활성에 관한 연구를 하였다. 총 phenol 및 flavonoid 함량은 3품종 모두 종자에 비해 핵에서 월등히 높았으며, 품종간에는 천홍의 핵에서 가장 높은 함량을 나타내었다. DPPH radical 소거능과 FRAP 및 CUPRAC에 의한 항산화 활성은 3품종 모두 종자에 비해 핵에서 활성이 높았고, DPPH radical 소거활성은 가납암백도와 천홍, FRAP 활성 은 천홍, CUPRAC 활성은 가납암백도에서 유의성 있게 높았다. NO 생성 억제 효과는 RAW 264.7 세포의 경우 핵 추출물에서 가납암백도 74%, 미황 70% , 천홍 58%이며. BV2 세포의 경우 미황 90%, 가납암백도 78%, 천홍 65%로 각각 염증 반응을 감소시켰다. 복숭아 3품종 핵과 종자의 총 phenol 함량과 총 flavonoid 함량은 높은 상관 관계를 나타내었고, 항산화 활성간의 상관성은 모두 유의적인 관 계가 확인되었으나, 항염 활성과 항산화 활성, 항염 활성과 총 phenol 및 flavonoid 함량간은 낮은 상관관계를 나타내 었다.
