복숭아 품종별 핵과 종자의 항염증 및 항산화 효과간의 상관관계

본 연구에 사용한 복숭아(P. persica L. Batsch)는 2014년 경상북도 농업기술원 청도복숭아연구소의 포장에서 수확 한 품종으로 외관이 양호하고 신선한 것으로 균일하게 선별 하였으며, 미황(Mihwang)은 6월 하순, 가납암백도(Kanoiwa Hakuto)와 천홍(Cheonhong)은 각각 7월 하순에 수확하여 사용하였다. 미황은 청도복숭아연구소에서 육성한 품종으 로 과피에 털이 있는 조생종 황육계통이고, 가납암백도는 털이 있는 유모종 백육계통이며, 천홍은 털이 없는 무모종 황육계통이다. 수확 후 과육을 제거한 핵을 건조하여 종자 와 분리한 후 각각 실험에 사용하였다. 각 품종별 과실 특성 은 Table 1에 나타내었다.

각 품종별 복숭아의 분리한 핵과 종자를 각각 건조한 후 분쇄하여 polyethylene bag으로 포장하여 -40℃ 냉동고에 보관하면서 시료로 사용하였다. 분석 시료는 분쇄된 각 시 료 5 g에 80% 에탄올을 1:10(w/v)의 비율로 1일간 75℃, 130 rpm에서 진탕추출한 후(HK-SI25C, Hankuk S&I Co., Hwaseong, Korea) 여과지(No.2, Whatman^TM International Ltd., Maidstone, UK)로 여과하여 얻은 용액을 감압농축기 (OSB-2000, Eyela Co., Tokyo, Japan)로 농축한 후 DMSO (Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 용매 로 하여 10 mg/mL 및 20 mg/mL의 농도로 설정하여 실험에 사용하였다.

총 phenol 함량은 Folin-Denis 방법을 변형하여 측정하였 다(12). 96-well plate에 시료액(20 mg/mL) 2 μL를 증류수 20 μL와 Folin-Ciocalteu's phenol reagent(Sigma-Aldrich Chemical Co.) 10 μL를 첨가하여 실온에서 6분간 반응시키 고, 7% Na₂CO₃ 용액 100 μL와 증류수 70 μL를 첨가하여 실온에서 90분간 반응시킨 후, 595 nm에서 흡광도를 측정 하였다. 표준물질로 gallic acid(Sigma-Aldrich Chemical Co.)를 사용하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 검량선 을 작성한 후 phenol 함량을 산출하였다.

총 flavonoid 함량 측정은 Zhishen 등의 방법을 변형하여 측정하였다(13). 96-well plate에 시료액(20 mg/mL) 2 μL를 증류수 100 μL와 5% NaNO2 용액 5 μL를 혼합하여 실온에 서 10분간 반응 시키고, 10% AlCl₃·6H₂O 용액 10 μL를 첨가하여 다시 실온에서 10분간 반응시킨 후, 1 M NaOH (Sigma-Aldrich Chemical Co.) 용액 40 μL와 증류수 45 μL를 첨가하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 catechin(Sigma-Aldrich Chemical Co.)을 사용하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 검량선을 작성한 후 총 flavonoid 함량을 산출하였다.

DPPH radical 소거 활성 측정은 Blois의 방법을 변형하여 측정하였다(14). 96-well plate에 시료액(20 mg/mL) 2 μL와 50% 에탄올에 녹인 40 mM DPPH(Sigma-Aldrich Chemical Co.) 용액 198 μL를 가하여 총액의 부피가 200 μL가 되도록 하였다. 이 반응액을 실온에서 빛을 차단하여 약 10분간 반응시킨 후 분광광도계로 517 nm에서 흡광도를 측정하였 다. 결과는 추출물의 첨가구와 무 첨가구의 흡광도를 통해 백분율로 나타내었다.

FRAP assay는 Benzie 등의 방법을 변형하여 측정하였다 (15) 실험을 위한 반응액은 300 mM acetate buffer(pH 3.6), 10 mM 2,4,6-tripyridyl-s-triazine(TPTZ)(Sigma-Aldrich Chemical Co.), 20 mM FeCl₃·6H₂O(Sigma-Aldrich Chemical Co.)을 10:1:1의 부피비로 섞어서 제조하였으며, 실험 직전 에 만들어 사용하였다. 96-well plate에 시료액(20 mg/mL) 6 μL와 FRAP 용액 194 μL를 혼합한 후 실온에서 빛을 차단한 상태로 10분간 반응시킨 후 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 무첨가구(DMSO)에 대한 첨가구의 fold 값으로 나타내었다.

CUPRAC assay는 구리 이온의 환원력을 이용하여 radical 을 환원시킬 수 있는 능력을 확인하는 방법으로 Apak 등의 방법을 변형하여 측정하였다(16). DW:10 mM CuCl₂:75 mM neocuproine(Sigma-Aldrich Chemical Co.)을 100:1:1의 부피비로 혼합하여 실험 직전에 사용하였다. 96-well plate 에 시료액(20 mg/mL) 6 μL와 CUPRAC 용액 194 μL를 혼합 한 후 37℃에서 빛을 차단한 상태로 20분간 반응시켜 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 FRAP assay와 마찬 가지로 무첨가구(DMSO)에 대한 첨가구의 fold 값으로 나 타내었다

본 실험에 사용된 RAW 264.7 세포주와 BV2 세포주는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. RAW 264.7 세포주는 10% FBS (Standard fetal bovine serum, HyClone, Logan, UT, USA), penicillin G(Sigma-Aldrich Chemical Co., 100 IU/mL)와 streptomycin(Sigma-Aldrich Chemical Co., 100 μg/mL)이 첨 가된 DMEM 배지를 사용하여 CO₂ incubator(5% CO₂, 95% air)에서 37℃의 조건으로 배양하였다. 각 실험에서 세포는 시료를 lipopolysaccharide(LPS, Sigma-Aldrich Chemical Co.) 첨가 1시간 전에 처리하여 배양한 후, 1 μg/mL 농도의 LPS를 처리하여 실험을 진행하였다. 또한 생쥐의 뇌신경소 교세포(mouse microglial cell line)인 BV2 세포도 위의 조건 과 동일한 조건에서 배양하였다.

RAW 264.7 세포에서 복숭아 핵 및 종자 추출물의 세포 독성을 확인하기 위해 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide(MTT) 시험법을 실시하였다. RAW 264.7 세포를 5×10⁵ cells/mL로 96-well plate에 접종하 고, 1시간 배양 후, 시료를 100 μg/mL의 농도로 처리하여 1시간 동안 배양하였다. 시료가 처리된 세포에 LPS를 1 μg/mL의 농도로 처리한 다음 37℃에서 22시간 배양시켰다. 배지에 희석된 MTT(Sigma-Aldrich Chemical Co.) 용액(0.5 mg/mL)을 세포에 처리하여 4시간 후 MTT를 환원시켜 생 성된 formazan이 배지에서 분리되지 않도록 배지를 제거하 였다. 생성된 MTT-formazan은 DMSO에 용해시켜 540 nm 에서 흡광도를 측정하였다.

RAW 264.7 세포에 농도별 시료를 처리 한 후 LPS를 1 μg/mL의 농도로 처리하여 24시간 배양하였다. 배양 후 배양액에 생성된 NO의 양은 griess reagent(1% sulfanilic acid:1% napthylamine=1:1)를 이용하여 490 nm에서 흡광도 를 측정하였다.

통계처리는 각 그룹 간의 차이를 보기위해 SAS프로그램 을 이용하여 분산분석(analysis of variance)을 실시하고 유 의수준 p<0.05에서 유의적인 차이를 보인 경우 Duncan의 다중범위 시험법(Duncan’ multiple arange test)을 적용하여 사후분석을 실시하였다.

품종별 복숭아 핵과 종자를 에탄올로 추출하고 총 phenol 함량과 총 flavonoid 함량을 측정한 결과는 Table 2와 같다. Polyphenol 화합물은 분자 하나에 phenol 그룹이 한 개 이상 있는 것으로 식물에서 널리 발견된다(17). Polyphenol의 많 은 수산기는 반응성이 높은 활성 산소 제거에 쓰이며, 여러 단백질 내에 존재하는 sulfhydryl(-SH) 그룹 및 다른 단백질 부분과 결합하는 성질이 있기 때문에 병원균에 대한 항균 작용, 신체대사에 작용 하는 효소 활성 변화 촉진, 유전자 발현 촉진 등의 작용을 한다. 또한 활성 산소 제거 및 노화 억제 등의 항산화 기능을 가지고 있어 각종 질환 치료 및 예방에 이용되고 있다(18). 미황, 가납암백도 및 천홍 핵의 총 phenol 함량은 각각 89.78±1.51, 207.16±2.40 및 218.50±7.21 mg GAE/g 으로 나타나 미황 핵의 phenol 함량 에 비해 가납암백도 핵은 2.3배, 천홍 핵은 2.4배 더 높은 함량을 보였다(p<0.05). 반면, 미황, 가납암백도 및 천홍 종자의 총 phenol 함량은 각각 20.39±0.08, 33.00±0.33 및 24.15±0.14 mg GAE/g 으로 나타나 가납암백도 종자의 총 phenol 함량이 가장 높은 것으로 나타났다.

Flavonoid는 flavone을 기본 구조로 갖는 식물의 황색 계 통의 색소의 총칭으로 phenol류도 그 안에 포함된다(19). Flavonoid는 유해산소 및 지질 산화를 방지하는 항산화능 뿐만 아니라 항균, 항암, 항염증, 항동맥경화 등의 효과가 있는 것으로 알려져 있다(20). 미황, 가납암백도및 천홍 핵 의 flavonoid 함량은 각각 28.11±0.11, 110.36±2.16 및 172.22±2.62 mg CE/g으로 나타나 미황 핵의 flavonoid 함량 에 비해 가납암백도 핵은 3.9배, 천홍 핵은 6.1배 더 높은 함량을 보였다(p<0.05). 반면 종자의 flavonoid 함량은 미황, 가납암백도 및 천홍에서 각각 10.59±0.49, 5.88±0.06 및 6.77±0.11 mg CE/g이었으며 미황 종자의 flavonoid 함량이 가장 높았는데, 이는 가납암백도와 천홍과 유의적인 차이 를 보였다.

복숭아 품종별 핵과 종자 추출물의 항산화 활성 결과는 Table 3과 같다. 비교적 안정한 radical인 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl(DPPH)은 항산화 활성을 갖는 물질과 만나면 환원되어 색이 탈색되는 점을 이용한 항산화 활성 측정 방법으로 DPPH의 환원 정도를 기준으로 측정물질의 환원 력과 항산화력을 확인하는 방법으로 알려져 있다(21). 복숭 아 품종별 핵과 종자의 DPPH 항산화 활성을 비교한 결과, 천홍 핵이 74.2±1.0%로 가장 높은 radical 소거능을 나타냈 으며, 가납암백도와 미황이 각각 73.3±3.6%, 32.8±1.4%의 소거능을 나타냈다. 또한, 종자에서는 천홍이 19.7±0.3%의 소거능을 나타냈으며 미황과 가납암백도가 각각 17.2± 0.9%, 13.9±0.9%로 나타내었다(Tabel 3). 이는 핵 추출물에 서 천홍과 가납암백도의 높은 phenol과 flavonoid 함량에 기인하는 것으로 판단되며, 총 phenol 및 flavonoid 함량의 증가에 따른 높은 항산화 활성 증가에 대한 연구 결과와 일치하였다(22).

FRAP에 의한 항산화 활성은 free radicals 없이 electron transfer에 기초한 방법으로 시료 추출물 처리 후 ferric tripyridyltriazine(Fe³⁺-TPTZ)을 ferrous tripyridyltriazine(Fe²⁺- TPTZ)으로 환원시키는 능력을 측정 하는 방법이다(23). 3 품종의 핵과 종자의 FRAP value를 확인한 결과, 무첨가구 에 비해 핵 추출물에서 각각 천홍, 가납암백도, 미황이 26.8 배, 23.8배, 12.4배의 순으로 높은 활성을 나타내었고, 천홍 이 유의적으로 가장 높은 활성을 나타내었다. 반면 종자의 FRAP 수치는 천홍과 가납압백도가 무첨가구에 비해 4.9배 의 활성을 나타내었고 미황 종자는 3.4배의 활성을 나타내 었다. Table 4

CUPRAC활성은 구리이온(Cu²⁺)의 전자를 받아들어 Cu⁺ 로 환원되는 것을 이용한 방법으로 추출 시료의 Cu²⁺의 환원되는 능력을 통해 항산화 능력을 확인하는 방법이다 (24). 품종별 복숭아 핵과 종자 추출물에서는 무첨가구 대비 가납암백도 핵이 10.3배의 활성을 나타났으며, 천홍과 미황 이 각각 8.8배와 8.1배의 활성이 관찰되었다. 종자 추출물에 서의 CUPRAC 활성은 무첨가구에 비해 천홍, 가납암백도, 미황 순으로 각각 4.9배, 4.5배 그리고 3.8배의 활성을 나타 내었다.

본 연구에서는 복숭아 3품종의 핵과 종자 추출물의 항염 증 활성을 조사하기 위해 LPS 자극에 의해 유도된 RAW 264.7 대식세포(macrophage)와 BV2 소교세포(microglia)의 염증 반응에서 nitric oxide(NO)의 억제 활성을 측정하였다. 면역세포중의 하나인 대식세포는 내재면역뿐만 아니라 적 응면역 등 다양한 숙주 반응에 관여하여 많은 항염 작용 연구에 이용되고 있다(25). BV2 소교세포(microglia)는 뇌 에 존재하는 대식세포로 monocyte에서 분화되어 중추신경 계에 있는 비신경세포로 병원균 감염이나 뇌 손상에 대해 반응해 염증성 cytokine, 단백질 분해 효소, 활성 산소 등을 생성하여 보호하는 면역세포이나, 만성 염증이 유발하면 뇌 조직의 손상 및 세포사가 유발되기 때문에 신경 퇴행성 질환의 주요 원인이 되는 것으로 알려져 있다(26,27).

품종별 복숭아 핵과 종자의 항염증 활성을 측정한 결과 는 Fig. 1, 2와 같다. RAW 264.7 세포에서 각각의 핵 추출물 을 100 μg/mL의 농도로 처리한 실험구에서의 NO 생성량은 미황이 대조구에 비해 29.60±3.09%로 관찰되었고, 가납암 백도는 26.49±8.02%, 천홍은 42.10±10.72%로 관찰되었으 며, 품종간의 항염 활성 비교에서 3품종 모두 유의적인 차이 를 나타내지 않았다(Fig 1A). 종자 추출물을 100 μg/mL의 농도로 처리한 실험구에서는 각각 미황이 76.08±1.40%, 가납암백도가 59.16±11.92% 그리고 천홍이 73.61±7.24% 로 3품종 모두 유의적인 차이를 나타내지 않았으며, 핵 추출 물에 비해 낮은 항염 활성이 관찰되었다(Fig 1B). 또한, BV2 세포에서 3품종의 핵 추출물의 NO 생성량은 대조구에 비해 각각 미황은 9.05±4.02%, 가남압백도는 21.68±14.33% 그 리고 천홍은 35.03±8.95%로 관찰되었다(Fig 2A). 특히 미황 과 가납암백도 핵 추출물의 경우 LPS를 처리하지 않은 무처 리구의 NO 생성량과 대비하여 적은양의 NO가 관찰되어 강력한 항염 활성을 나타내었으며, 천홍 핵 추출물에 비하 여 7.98-38.95% 높은 항염 활성을 나타내었다. 또한, 종자 추출물을 처리한 실험구에서는 미황이 52.63±3.89%, 가납 암백도는 43.56±13.97%, 천홍은 56.45±2.73%의 NO 생성 량을 나타내었으며, 품종간의 항염 활성 비교에서 3품종 모두 유의적인 차이를 나타내지 않았다(Fig 2B). 본 연구의 결과로 복숭아 3품종의 핵 추출물은 RAW 264.7 세포 및 BV2 세포에서 강력한 항염 활성을 나타내는 것으로 관찰 되었으며, 종자 추출물에서도 대조구에 비해 비교적 높은 항염 활성을 나타내었다. 이와 같은 연구결과는 복숭아 3품 종의 핵과 종자가 전반적으로 염증 반응의 억제 뿐 만 아니 라 뇌질환 관련 염증 치료 소재 개발의 기초자료로 충분한 가치가 있다고 판단된다.

Fig. 1. Effect of (A) stone and (B) seed of peaches on production of nitr ic oxide and cell viability in RAW 264.7 cells. MH, Mihwang; KH, Kanoiwa Hakuto; CH, Cheonhong. Values are means±SD of triplicate determinations. Different superscripts within a column indicate significant differences (p<0.05). Final concentration, 100 μg/mL.

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Fig. 2. Effect of (A) stone and (B) seed of peaches on production of nitric oxide and cell viability in BV2 cells. MH, Mihwang; KH, Kanoiwa Hakuto; CH, Cheonhong. Values are means±SD of triplicate determinations. Different superscripts within a column (a-b) indicate significant differences (p<0.05). Final concentration, 100 μg/mL.

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복숭아 3품종 핵과 종자의 총 phenol 및 총 flavonoid 함량 의 상관성이 0.941로 유의적인 높은 상관관계를 나타냈다 (p<0.01). 항산화 활성간의 상관성은 FRAP 활성과 DPPH 활성 간의 상관성(0.970, p<0.01), CUPRAC 활성과 DPPH 라디칼 소거능 간의 상관성(0.900, p<0.01) 그리고, CUPRAC 활성과 FRAP 활성의 상관성(0.853, p<0.01)순으 로 모두 유의적으로 정(+)의 관계가 확인되었다. 이에 반해 총 phenol 및 총 flavonoid 함량은 항산화 활성들 간의 상관 관계에서 유의적인 상관성을 나타내지 않았다. 이는 핵과 종자의 항산화 활성이 flavonoid성 phenol 화합물이 아닌 non-flavonoid성 phenol 화합물의 작용에 의한 것으로 예상 되었다. 또한 항염 활성과 항산화 활성들 간의 상관성은 낮게 확인되었으며 항염 활성과 총 phenol 및 flavonoid 함량 간은 낮은 상관관계를 나타내며 이는 flavonoid성 phenol 화합물이 항염 반응에는 낮게 관여한다는 것을 확인 할 수 있다. 따라서 본 연구에서 복숭아 3품종 핵과 종자의 non-flavonoid성 phenol 화합물이 다양한 항산화 활성뿐 만 아니라 항염 세포 활성에 작용 할 것이라 사료된다.