IMS-QD assay를 활용한 상추에서 간염 A형 바이러스의 신속순수분리 및 형광 검출법 연구

본 실험에 사용한 hepatitis A virus(HAV) strain HM-175/18f(VR-1402)는 미국 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 분양 받아 fetal rhesus kidney(FRhK-4) 세포에 접종 및 배양한 10⁴ TCID₅₀/mL농도의 바이러스를 사용하였으며, Norovirus (NoV) 및 hepatitis E virus(HEV)는 광주 보건환경연구원에 서 환자의 분변에서 분리된 바이러스를 사용하였다.

10 g의 상추에 각각 10배씩 희석한 바이러스를 200 μL 접종한 뒤 1시간 동안 클린벤치에서 흡착시키고, 50 mL의 Tris 용액(100 mM Tris-HCl, 50 mM glycine, 1% beef extract, pH 9.5)을 첨가하여, stomacher bag에 넣은 후 stomacher로 15분간 한 후 10분간 교반하였다. 교반 후 확보한 상층액에 서 바이러스를 농축하기 위해 PEG 농축법과 IMS 방법을 사용하여 각각 농축시켰다. PEG 농축법은 탈리액의 2배인 100 mL의 16% PEG 8000(Sigma, St. Louis, MO, USA)를 첨가한 후 4℃에서 12시간 정치하였다. 이 후, 4℃에서 12,000×g에서 30분간 원심분리 후 상등액은 버리고 남은 pellet을 200 μL의 PBS로 재부유하여 바이러스를 농축하였다.

이전 논문에서 수행했던 방법인 IMS를 식품에 적용하여 실시하였다(16). 간단히 서술하면, IMS은 자성체인 자성비 드-결합 G 단백질(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 50 μL에 200 μL의 0.02% Tween 20이 포함된 PBS에 HAV 항체 (mouse anti-HAV monoclonal antibody, Genetex, San Antonio, TX, USA) 5 μg을 용해하여 상층액을 제거한 자성 비드와 10분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 상층액을 제거 하고 200 μL의 0.02% Tween 20이 포함된 PBS로 3회 세척하 여 바이러스 탐침자를 제조하였다. 이 탐침자를 탈리액 50 mL에 혼합하여 넣고 실온에서 10분 동안 반응하였다. 반응 이 끝난 후 자석을 붙여 자성비드-결합 G 단백질에 붙어있 는 바이러스 항체와 결합하는 바이러스를 분리하며, 결합 하지 못한 바이러스가 포함된 상층액은 RT-PCR 분석을 위해 새로운 튜브에 옮겨 PEG 농축을 실시하였다. 항원(바 이러스)이 결합된 바이러스 자성 탐침자는 200 μL의 0.02% Tween20이 포함된 PBS로 3회 씻어내어 불순물을 제거한 후, 100 μL PBS로 부유시켜 새로운 1.5 mL 튜브에 옮겨 상층액을 제거하였다. 새로운 튜브에 있는 G 단백질에 붙어 있는 항원-항체 결합체를 20 μL의 50 mM glycin 용액(pH 2.8)으로 용리하여 분리하고, 최종적으로 pH 7.5가 되도록 93 μL의 100 mM Tris 용액(pH 7.5)을 첨가하였다. 그리고 HAV의 순수 분리 확인을 위해 RT-PCR을 실시하였다.

바이러스의 RNA는 P&C rapid RNA extraction kit (Biosolution, Inc., Suwon, Korea)를 이용하여 30 μL를 추출 하였고, cDNA kit(Beams bio., Seongnam, Korea)를 사용하 여 37℃에서 60분, 72℃에서 10분간 반응시켜 cDNA를 합성 하였다. 합성된 cDNA를 이용하여 HAV(VP1)와 NoV (VP1), 그리고 HEV(RdRp)의 유전자 증폭을 위해 Pre-mix PCR(Bioneer Inc., Seoul, Korea) 튜브에 합성한 cDNA를 1 μL, 10 pmol의 forward와 reverse primer를 각각 1 μL씩 넣고 증류수로 최종 용량이 20 μL로 맞췄다. 실험에 사용한 primer는 HAV_VP1-g (5’-TGG TTT GCC ATC AAC ACT GAG G-3’), HAV_VP1_R (5’-ACC CAA GGA GTA TCA ACG GCA AG-3’)를 제작하였으며, NoV_GII-F1M (5’-GGG AGG GCG ATC GCA ATC T-3’), NoV_GII-R1M (5’-CCR CCI GCA TRI CCR TTR TAC AT-3’), 그리고 HEV_IN-g(5’-GTA TTT CGG CCT GGA GTA AGA C-3’), HEV_IN_R(5’-TCA CCG GAG TGY TTC TTC CAG AA-3’)를 이용하여 PCR을 실시하였다(17,18). HAV의 PCR 반응 조건은 95℃ 5분간 변성한 후 95℃ 30초, 57℃ 30초, 72℃ 30초로 35회 반응을 실시하였다. NoV와 HEV의 PCR 조건은 annealing 온도만 각각 56℃, 61℃로 변경하고 동일하게 수행하였다(19,20). 유전자 증폭여부를 확인하기 위해 1.5% agarose gel로 전기영동을 실시한 후 증폭된 밴드 를 image analyzer(Chemidox XRS; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)로 확인하였다.

IMS를 통해 분리된 HAV를 형광검출하기 위해서 HAV 항체(goat anti-HAV polyclonal antibody, Abcam, Cambridge, UK) 10 μg을 용해시킨 PBS 용액(400 μL)을 항원(바이러스) 이 결합된 바이러스 자성 탐침자가 들어있는 1.5 mL 튜브에 넣고 10분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 튜브에 자석을 붙여 상층액을 제거하고 200 μL의 0.02% Tween 20이 포함 된 PBS로 2회 세척하여 불순물을 제거한 후, Quantum dot이 결합된 2차 항체(625 donkey F(ab’)2 anti-goat IgG conjugate (H+L); Invitrogen) 4 ㎍을 용해시킨 PBS 용액(400 μL)을 넣고 10분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 튜브에 자석을 붙여 상층액을 제거하고 200 μL의 0.02% Tween 20이 포함 된 PBS로 3회 세척하여 불순물을 제거하였다. 최종적으로 얻어진 자성비드를 600 μL의 PBS로 부유시킨 후 96 well black plate(SPL Life Sciences, Seoul, Korea)에 200 μL씩 분주하여, Spectra Max GEMINI-XS spectrofluorometer (Molecular Devices Corp, Sunnyvale, CA, USA)를 통해 형광 을 측정하였다.

HAV와 NoV, 그리고 HEV가 혼합된 바이러스를 상추에 접종하여 이 중 HAV만을 순수하게 농축하기 위해 항원에 특이적인 항체와 자성 비드를 사용하여 신속하게 항원을 분리하고 농축시키는 IMS 방법을 수행하였다. 그 결과, HAV 항체가 결합된 자성비드를 washing buffer로 세척 후 얻은 세척분획물(Washout)과 PBS buffer로 세척된 자성비 드를 glycine buffer(pH 2.8)로 바이러스를 용출시킨 후 Tris 용액(pH 7.5)으로 중화 처리 된 용출분획물(Eluent)을 대상 으로 RT-PCR을 수행한 결과, 150bp의 HAV 증폭산물이 세척분획과 용출분획에서 모두 검출되었으나(Fig. 1A), 310bp의 NoV와 352bp의 HEV 증폭산물은 세척분획에서만 검출되고 용출분획에서는 검출되지 않았다(Fig. 1B). 이 결 과를 통해 여러 바이러스로 오염된 식품에서 특정 바이러스 를 순수하게 분리 및 검출하고자 할 때 IMS방법을 이용하 면 짧은 시간에 바이러스를 농축 및 회수할 수 있음을 확인 하였다.

Fig. 1을 통해 IMS 방법을 이용하면 짧은 시간 내에 순수 하게 HAV의 분리가 가능하다는 것을 확인하였다. 그러나 IMS 방법에 의해 바이러스 농축방법의 농축 효율을 확인하 고자 기존의 PEG 농축법과 농축 효율을 비교하였다. 10⁴TCID₅₀/mL의 HAV를 10배씩 단계희석하여 이 중 200 μL를 가지고 RT-PCR을 실시하였을 때 10^-3까지 검출되었 으며(Fig. 2A), 이 바이러스를 동일한 양으로 각각 상추 표 면에 접종하여 IMS를 통한 농축샘플과 PEG 농축을 통하여 RT-PCR을 실시하였다. 그 결과 IMS 농축과 PEG 농축 모두 10^-3까지 검출되었다(Fig. 2). 두 농축 방법을 비교하고자 농축을 통한 RT-PCR 결과, 바이러스의 희석됨에 따라 PCR 밴드가 약해지는 것이 확인하였으며, 두 방법 모두 10^-3까지 HAV를 검출할 수 있었다. 기존의 보고된 논문에 의하면, 낮은 수준의 바이러스를 검출 시 PEG 농축에 비해 IMS를 통한 농축방법이 효과적이며, 이는 항체 특이적 바이러스 농축을 통해 다른 PCR 저해물질의 제거가 용이하며 상대적 바이러스 손실이 적기 때문이다(11,20). 이는 소량으로 식 품 내에 존재하여 인체에 감염을 일으키는 식중독 바이러스 를 검출할 시에 IMS를 통한 바이러스 농축방법은 소량의 바이러스를 10분이라는 단 시간에 농축하여 검출할 수 있 으므로 효과적인 농축 방법임을 확인하였다.

Fig. 2. Compar ison of the two methods for concentrating HAV by RT-PCR assay. (A) The limit of detection for the RT-PCR assay was assessed with 10-fold ser ial dilutions of HAV stock. The amplified VP1 gene (150 bp) of HAV was detected by RT-PCR after concentration using (B) polyethylene glycol (PEG) and (C) immunomagnetic separation (IMS). M, 100 bp marker; lane 1, 100 μL of 1:10 dilution; lane 2, 100μL of 1:100 dilution; lane 3, 100 μL of 1:1000 dilution; lane 4, 100 μL of 1:10000 dilution.

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Fig. 1. RT-PCR assay for detecting enter ic virus including hepatitis A virus (HAV), norovirus (NoV), and hepatitis E virus (HEV) using immunomagnetic separation (IMS). The amplified VP1 gene (150 bp) of HAV was only detected in the eluent fraction (A). Three amplified genes, VP1 (150 bp), VP1 (213 bp), and RdRp (352 bp) of HAV, NoV, and HEV, respectively, was detected in the washout fraction (B). M, 100 bp marker.

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식중독 바이러스의 정성적 분석을 RT-PCR으로 할 경우 3시간 이상의 분석시간이 소요되는데, 보다 신속하게 HAV 를 검출할 수 있는 방법을 고안하고자 본 연구에서는 형광 물질인 quantum dot이 결합된 2차 항체를 이용하여 HAV를 형광검출을 실시하였다(15,20). 그 결과 HAV를 형광으로 검출할 수 있었으며, 바이러스가 희석됨에 따라 형광의 세 기 또한 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 3). Quantum dot이 라벨링된 항체를 이용하여 간염 A형 바이러스를 검출 시, RT-PCR의 검출한계인 10³~10TCID₅₀/mL까지 형광 검출치 를 확인 할 수 있었다(Fig. 3).

Fig. 3. Detection of HAV using a fluorescent quantum dot (QD) probe. Ten-fold serially diluted HAV was prepared from a stock culture: 1:10 (a), 1:100 (b), 1:1000 (c), 1:10000 (d), and negative control, which was prepared with PBS without HAV (e). The excitation and emission wavelengths were 420 and 625 nm, respectively

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