지모 추출물의 항산화 및 pancreatic lipase 저해 활성 평가

본 실험에 시료로 사용한 지모(Anemarrhena asphodeloides) 는 2011년 10월 경 채취하여 건조한 것을 2012년 2월에 대구시 소재 약업사에서 구입하여 잘게 세절한 다음 사용하 였으며, 표본시료는 대구한의대학교 한약재약리학과 천연 물화학실험실에 보관하고 있다.

건조된 지모 12 kg을 잘게 자른 후 70% methyl alcohol (MeOH) 42 L로 3일간 3회 반복 추출한 후 얻어진 용액을 여과한 후, 감압 농축하여 얻어진 추출물(3.4 kg)에 대해 항산화 효능의 평가로 이용된 DPPH 및 ABTS⁺ 라디칼에 대해서 1000 mg/mL의 시험농도에서 각각 81.5%와 57.8% 의 소거능을 나타내었고, pancreatic lipase 저해효능을 평가 한 결과 1000 mg/mL의 농도에서 74.3%의 저해능을 나타내 었다. 활성부분에 함유되어 있는 활성물질의 형태를 추정 하기 위해 농축 결과물 3.4 kg을 물에 현탁하여 저극성 용매 인 n-Haxane 으로 먼저 추출한 후 수층을 다시 ethyl acetate (EtOAc), n-butyl alcohol(n-BuOH)을 이용하여 각각 순차적 으로 3회 분획하여 추출하였다. 각 용매추출 분획을 감압 농축하여 건조 시킨 후 n-Haxane 가용분획(22.9 g), EtOAc 가용분획(143.0 g), n-BuOH 가용분획(841.0 g), H₂O 가용분 획(1.2 kg)을 각각 얻었으며 각 분획물을 대상으로 라디칼 소거능 및 지방분해효소 저해능을 평가하였다.

지모 70% methanol 추출물의 전자공여능은 Blois 방법 (29)에 따라 측정하였다. 각 시료용액에 120 μl에 0.45 mM의 희석한 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 용액 60 μl을 넣고 교반한 후 15분간 방치한 다음 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 대조물질로는 (+)-catechin를 사용했으며 전자공여능은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 차 이를 백분율로 나타내었다.

지모 70% methanol 추출물의 2,2'-azinobis-3- ethylben zothiazoline-6-sulfonic acid(ABTS) radical 소거능을 Re(30) 의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다. 7 mM ABTS (in water)와 2.4 mM K₂O₈S₂ 동량을 혼합 후 실온, 암소에서 12시간 방치하여 라디칼의 생성을 유도한 후 ABTS⁺ 라디 칼 용액을 희석하여 734 nm에서 흡광도 값이 0.6-0.7 정도가 되도록 희석하여 사용하였다. 희석한 ABTS⁺ 라디칼 용액 100 μl와 생약 추출액 100 μl을 혼합하여 실온에서 7분간 반응시킨 후 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 대조 물질로는 (+)-catechin를 사용하였으며 결과는 시료를 처리 하지 않은 군에 대한 %로 표시하였다.

Pancreatic lipase 저해활성 측정은 Kim 등(31)이 행한 방 법을 변형하여 실시하였다. 즉 enzyme buffer(10 mM MOPS, 1 mM EDTA, pH 6.8)에 porcin pancreatic lipase를 0.5 g/200 mL의 농도로 4℃에서 용해한 후 4000 rpm으로 원심분리하여 상층액을 사용하여 169 uL Tis buffer(100 mM Tris-HCl, 5 mM CaCl2, pH 7.0) 와 6 uL enzyme buffer를 혼합하였다. 샘플은 distilled water로 용해하여 다양한 농도 로 희석하여 사용하였다. 기질로 p-nitriphenyl butyrate (p-NPB)을 10 mM이 되게 DMF에 용해한 후 enzyme과 sample을 먼저 37℃에서 15분 동안 shaking incubation 시킨 후 기질을 첨가 하여 37℃에서 30분 동안 shaking incubation 시켰다. 405 nm에서 ELISA reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다. Pancreatic lipase 저해활성은 시료용액의 첨가 군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

총 페놀성 화합물의 함량은 Folin-Denis 방법(32)에따라 측정하였으며, 추출물 혹은 분획물을 1.0 mg/ml 농도로 조 제한 후, 75 ml의 증류수가 함유된 100 ml의 시험관에 1 ml넣고 잘 혼합하여 Folin-Denis 시액 5 ml와 탄산나트륨 포화용액 15 ml를 차례로 넣은 다음 이것을 잘 혼합하여 실온에서 60분 방치한 후, UV/VIS 분광광도계로 640 nm에 서 흡광도를 측정하였으며, 표준물질은 tannic acid를 이용 하여 표준곡선을 작성하여 양을 환산하였다.

DPPH는 생체 내에 존재하는 라디칼은 아니지만 그 자체 가 홀수전자를 갖고 있어 517 nm에서 강한 흡광도를 나타 낸다. 따라서 항산화능이 있는 물질과 반응하게 되면 안정 한 형태로 돌아가면서 흡광도 값이 감소한다(33). Table 1에 서 나타낸 것처럼 지모 70% methanol 추출물 및 각 유기용 매 분획에 대해서 라디칼 소거능을 평가한 결과, 1000 mg/ml의 농도에서 methanol 추출물이 81.5%의 라디칼 소거 능을 나타내었으며, 특히 n-BuOH 분획물이 1000 mg/ml의 농도에서 91.2%의 가장 우수한 라디칼 소거능을 나타내었 으며, 이 결과는 positive control로 사용된 녹차의 항산화 성분으로 잘 알려져 있는 (+)-catechin과 같은 농도에서 비 교한 결과이다. EtOAc 분획물 또한 1000 mg/ml의 농도에서 87.6%의 우수한 라디칼 소거능을 나타내었지만, H₂O 층에 서 매우 약한 라디칼 소거능을 나타내었다. 또한 n-Hexane 분획물은 라디칼 소거능이 없는 것으로 보여졌다. DPPH 라디칼 소거능과 총 페놀성 화합물의 함량사이에는 밀접한 상관관계가 있다는 보고(34)에 근거하여 지모의 항산화 활 성과 페놀성 화합물의 연관성을 평가한 결과, Table 1과 Fig. 2에서 나타낸 것처럼, DPPH 라디칼 소거능은 페놀성 화합물의 함량이 상대적으로 높은 n-BuOH 층과 EtOAc 층에서 가장 높은 것을 확인할 수 있다.

Re의 방법(30)을 변형하여 7 mM ABTS와 2.4 mM K₂O₈S₂ 동량을 혼합한 후, 실온, 암소에서 12시간 방치하여 라디칼 의 생성을 유도한 후, ABTS⁺ 라디칼 소거능을 측정하였다. 그 결과 Table 2에서 보는 것처럼 지모 70% methanol 추출물 의 1000 mg/ml 농도에서는 57.8%의 ABTS⁺ 라디칼 소거능 을 나타냄을 알 수 있었으며, 각 분획물중에서도 특히 EtOAc 및 n-BuOH 분획층이 125 mg/ml의 농도에서 86.1% 및 76.9%의 매우 우수한 라디칼 소거능을 나타내었으며, positive control인 (+)-catechin의 활성에 상당하는 효능을 확인하였다. EtOAc 분획층의 62.5 mg/ml의 농도에서 74.4%, 31.3 mg/ml의 농도에서 55.0%의 라디칼 소거능을 나타내어 소거능의 농도 의존적 성향을 보였다. H₂O 분획 층과 n-Hexane 분획층에서는 거의 효능이 나타나지 않았 다. Table 4에서 나타낸 것처럼 총 페놀성 함량 상대적으로 높게 나타난 EtOAc, n-BuOH 층에 ABTS⁺ 라디칼 소거 활성 물질의 존재가 시사되었으며, 특히 EtOAc 층에 대해서 이 들 활성물질의 동정이 필요하다고 사료된다.

Pancreatic lipase는 지방질 가수분해 효소로 triglyceride 의 에스테르결합을 가수분해시켜 glycerol과 fatty acid으로 분해한다. 섭취한 지방은 lipase의 작용에 의해 주로 monoglyceride와 fatty acid로 분해되어 담즙산염과 미셀을 형성해서 흡수된다. 흡수된 지방산은 소장상피세포에서 triglyceride로 재합성되어 순환혈액 속에 들어가고 간장, 지방조직, 근육 등으로 보내져 사용되고 남은 triglyceride는 각 조직에 축적된다. 이때 지방의 축적이 과도하면 비만을 초래할 수 있다. 지방 흡수의 중요한 역할을 하는 lipase의 활성저해를 통해 지방이 체내에 소화, 흡수 되지 않고 체외 로 배설되게 함으로 지방의 축척을 막을 수 있다. 현재 시판 중인 비만치료제로서 orlistat (상품명:xenical)은 triglyceride 를 분해하는 췌장의 지방분해 효소인 lipase에 비가역적인 결합을 하여 불활성화 시킴으로서 triglyceride 및 cholesterol의 흡수를 감소시킴과 동시에 배설 시키는 기작 으로 항비만 작용을 하지만 복부고통, 설사 등의 부작용이 문제시되고 있어(35), 이들 부작용이 없는 천연 항비만 소재 개발을 위한 연구가 활발하게 이루어지고 있다(19). 전통 약용식물로부터 항비만 선도물질개발을 목표로 하여 지모 의 70% methanol 추출물을 극성에 따라 n-hexane, EtOAc, n-BuOH로 순차 분획하여 얻어진 각 분획에 대하여 pancreatic lipase를 이용한 실험을 통해 활성을 Table 3에 나타내었다. 그 결과 EtOAc 분획층의 125 mg/mL의 지방분 해효소에 대한 저해능은 87.1%의 비교적 강한 저해활성을 나타내었으며, 이 활성은 농도의존적 이었다.

지모 70% methanol 추출물 및 각 분획물의 수율과 각각에 함유하고 있는 총페놀성 화합물의 함량을 Fig. 1과 Fig. 2에 차례로 나타내었다. 지모 70% methanol 추출물의 경우 28.3%의 추출 수율과 1g당 13.4 mg의 페놀성 화합물을 함유 하는 것으로 나타나 새로운 생리활성 천연 소재로서 활용 가능성에 대해 더 많은 연구가 이루어질 필요성이 있는 것으로 사료된다. 또한 EtOAc 분획물이 1 g당 19.1 mg의 페놀성 화합물을 함유하는 것으로 나타났으며, n-BuOH 분 획물이 17.6 mg, H₂O층에서는 1 g당 4.2 mg의 페놀성 화합 물의 함량이 확인되었다. n-hexane 분획물은 3.0 mg의 상대 적으로 낮은 페놀 함류량을 나타내는 것으로 분석되었다.

Fig. 1. Extraction yield of the methanolic extract and organic solvent fractions of A. asphodeloides

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Fig. 2. Total phenolic contents of the methanolic extract and organic solvent fractions of A. asphodeloides Data represent the mean±SD three replications.

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