생강나무(Lindera obtusiloba Blume)와 초피나무(Zanthoxylum piperitum DC) 추출물의 항균활성

본 실험에 사용된 시료는 2012년 3월 충북 괴산에서 채취 한 생강나무 줄기, 경남 산청군이 산지인 초피 과피를 구입 하여 -20°C에 냉동 보관하며 시료로 사용하였다.

실험에 사용한 균주는 그람 음성균 3종(E. coli O157:H7 ATCC 35150, E. coli ATCC 8739, Salmonella Typhimurium ATCC 29629)과 그람 양성균 3종(Staphylococcus aureus ATCC 35556, MRSA(Methilcillin-resistant Staphylococcus aureus) ATCC 43300, Bacillus cereus ATCC 13061)을 선정 하여 사용하였다. 각각의 실험 전 Stock culture로 -70°C에 보관된 균들을 tryptic soy broth(TSB, Merck, Darmstadt, Germany)에 접종하여 37°C에서 20시간 배양하였다. 각 균 은 2번의 계대배양을 시킨 후의 정지기 균을 사용하였다.

각 시료 50 g을 60% ethanol과 water을 추출용매로 하여 1,000 mL씩 첨가하여, 60% ethanol은 60°C 80 rpm, water는 80°C 80 rpm의 수욕 상에서 10시간동안 2회 반복 추출한 후, 8,000 rpm에서 20분간 원심 분리 후 상등액을 감압여과 (Whatman No. 2, England)하였다. 추출여액을 rotary vacuum evaporator(EYELA N-1NW, Tokyo, Japan)로 40°C 수욕 상에서 감압 농축 후 -70°C 냉동고에서 얼린 후, 동결 건조한 후, 분말상태의 추출물을 -20°C 냉동고에 보관하면 서 항균 활성 측정 실험에 사용하였다. 추출용매에 따른 생강나무, 초피 과피의 추출수율은 Table 1과 같다.

생강나무 줄기와 초피 과피 추출물의 항균활성 검색은 한천배지 확산법을 변형하여 실시하였다. 각 추출물을 Dimethyl sulfoxide(DMSO)에 녹여 3.12, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 mg/mL의 농도 범위로 시험액을 준비하였다. 6종의 식 중독균을 TSB 액체 배지에 각각 배양하여, 10⁵ CFU/mL 농도로 petri dish에 pour plating하여 응고시킨다. 응고 된 배지 위에 멸균된 유리 실린더를 얹어 농도별 추출물 50 μL를 주입한 후 배지에 흡수시켜 37°C에서 24시간 배양한 다음 유리 실린더 주변의 clear zone 직경(mm)을 측정하여 항균 활성을 비교하였다.

생강나무 줄기와 초피 과피 추출물의 열 안정성은 50 mg/mL의 농도로 희석하여 60, 70, 80, 100°C에서 10분간 water bath에서 열처리하였으며, 한천배지 확산법을 변형한 방법으로 6종의 균에 대한 항균 활성을 측정하였다.

본 실험은 독립적으로 2회 반복 실시하여 실험결과를 SPSS 통계분석(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)프로그램을 이용하여 각 실험군간 평균을 계산하였으며, 유의성 검정 은 p<0.05 수준에서 Duncan의 다중비교로 처리하였다.

생강나무 추출물의 항균활성을 알아보기 위하여 60% ethanol, 열수 추출물의 항균력을 측정한 결과는 Table 2에 나타냈다. 모든 추출물에서 추출물의 농도가 증가할수록 항균력을 나타내는 생육저해환의 크기가 커짐을 확인할 수 있었으나 그람음성균과 그람양성균에 대한 항균력의 차이는 뚜렷하게 나타나지 않았다. 60% ethanol 추출물의 항균활성은 100 mg/mL의 농도에서 MRSA에 대해 가장 큰 저해환(31.50 mm)을 보여 가장 높게 나타났고, B. cereus 에 대해서는 가장 작은 저해환(25.00 mm)을 나타냈으며 항균활성은 식중독 균들간에 유의적인 차이를 보였다 (p<0.05). 열수추출물의 항균활성은 100 mg/mL 농도에서 는 S. aureus에 대해 가장 높게 나타났으며(25.5 mm), B. cereus에 대해서 가장 약한 것으로 나타났다(21 mm) (p<0.05). Cha 등(5)은 생강나무 줄기의 ethanol 추출물에서 항균 효과가 나타나지 않았다고 보고한 바 있으나, 이는 시험미생물간의 항균활성에 대한 민감도 차이에 의한 것으 로 사료된다. Park(23)은 생강나무의 꽃, 잎, 줄기의 ethylacetate 추출물을 이용한 항균 연구에서 줄기와 잎의 추출물이 꽃 추출물보다 우수한 항균활성을 나타냈다고 보고하였으며, S. aureus SA2균에 대해 항균력을 시험한 결과, 수증기 증류로 분리한 생강나무 꽃의 정유 성분이 S. aureus의 성장을 억제했다고 보고하였다(33). 이와 같은 추출 부위와 추출 용매에 따른 항균 효과의 차이는 추출물 이 가진 항균 성분 때문인 것으로 사료된다.

초피 과피의 60% ethanol, 열수 추출물의 항균활성을 나 타낸 결과는 Table 3에 나타내었다. 초피 과피 추출물에서 도 추출물의 농도가 증가할수록 생육 저해환이 커지는 경향 을 나타났다. 60% ethanol 추출물의 항균력은 100 mg/mL의 농도에서 그람양성균인 S. aureus, B. cereus 균에 대해 25 mm 크기의 억제효과를 나타났으며 그람 음성균인E. coli 에 대해서는 23 mm의 저해환을 보였다(p>0.05). 초피 과피 의 열수추출물도S. aureus에 대해 높은 항균활성을 보였으 나(22 mm), E. coli에 대해서는 낮은 항균활성(19 mm)을 보여 항균력은 그람양성균과 그람음성균 간에 유의적 차이 를 보였다(p<0.05). 초피 과피 추출물의 그람양성균에 대한 높은 항균력은 그람양성균과 그람음성균의 세포벽의 구조 적 차이 때문인 것으로 보여진다(37). Park 등(32)은 초피 과피와 종자의 methylene chloride 추출물에서 정유 성분을 추출하여St. mutans에 대한 항균 효과를 보고하였고, 초피 종자의 정유 성분을 분석하여 caracrol(0.24%), β-caryphyllene (1.72%), α-humulene(0.88%) 등을 검출하였다. 본 실험에 사용된 유기용매는 Park 등(32)이 연구한 것과 종류는 다르 지만 60% ethanol, 열수 추출물에 의해 항균 효과를 가진 성분이 추출되어 균의 성장을 억제한 것으로 사료된다.

생강나무 줄기와 초피 과피의 60% ethanol, 열수 추출물 의 농도가 낮아짐에 따라 균주 간 항균활성을 나타낸 생육 저해환의 크기가 작아졌으나, 추출물별 균주 간에 유의적 인 차이는 나타나지 않았다(p>0.05). 또한 생강나무 줄기와 초피 과피의 추출물에 따른 생육저해환의 크기를 봤을 때 60% ethanol추출물이 열수 추출물에 비해 다소 높은 항균력 을 나타냈다. 이는 Lim 등(30)이 초피 과피의 유기용매별 추출물의 B. cereus에 대한 항균성을 시험한 결과 ether나 ethanol 추출물이 hexane, 물 추출물보다 높은 항균 효과를 나타내었다는 보고와 유사한 결과이다. 또한 감초, 황백, 오미자, 목단피 등 한약재를 대상으로 추출물의 항균 활성 을 비교한 결과 ethanol 추출물이 열수 추출물보다 우수한 항균 효과를 나타냈다는 보고(4,34,35)와 유사한 결과이다. 유기용매에 의한 항균 활성을 비교한 결과, ethanol추출물 이 열수 추출물보다 항균 효과가 높은 것으로 보아 ethanol 추출로 인해 열수 추출보다 항균 효과가 큰 성분이 추출된 것으로 사료된다.

생강나무 줄기와 초피 과피의 추출물별 50 mg/mL의 농 도에서 60, 70, 80, 100°C 온도별로 10분간 처리한 후 추출 물질의 열안정성을 알아보았다(Table 4, 5). 열처리를 하지 않은 대조군(비열처리)과 처리군(온도별 열처리)의 항균활 성을 나타내는 생육 저해환을 비교하였을 때 저해환의 크기 에는 차이가 거의 없었으며, 이는 생강나무 줄기와 초피 과피 추출물은 열에 안정하다는 것을 의미한다(p<0.05). 생 강나무 줄기의 60% ethanol 추출물을 80°C로 10분간 열처리 를 하였을 때 항균활성을 나타내는 저해환 크기가 대조군 과 다른 온도 처리 시 나타낸 23∼26 mm의 저해환 크기에 비해 비교적 작았으나(21.5∼24 mm) 유의적인 차이는 없었 다. 이는 오미자, 울금의 ethanol 추출물을 60∼120°C, 60∼ 100°C범위에서 20분간 열처리한 연구(9, 12)와 Kim 등(36) 이 적송잎 ethanol, 열수 추출물을 80∼121°C로 10분 또는 20분간 열처리를 하여도 항균활성에 변화가 없었음을 보고 한 것과 유사하였다. 대부분의 가공 식품은 공정 중 열처리 공정을 거치는 경우가 많으므로 열에 안정한 천연 항균물질 의 개발이 필요하며, 본 실험 결과를 볼 때 생강나 무 줄기와 초피 과피의 ethanol, 열수 추출물의 항균 물질은 열에 안정한 것으로 보여 천연보존료로서 산업적 응용이 가능할 것이라 사료된다.