전통장류로부터 분리한 발효미생물을 이용한 꾸지뽕 열매 발효물의 특성 및 장류제품 개발

Phenolic acid 및 flavonoid분석을 위한 시료는 분말 2 g을 취하여 100% methanol 30 mL를 가하여 0.5시간 동안 초음파 처리한 후 원심분리하여 상등액을 취하였다. 위의 과정을 3번 반복하였으며 상등액을 모두 합하여 45°C에서 감압 농축하여 용매를 모두 증발 시켜 100% methanol 4 mL에 용해하였다. 이것을 0.45 μm NYLON syringe filter로 여과한 후 분석용 시료로 사용하였다.

DPPH 자유라디칼 소거활성 및 tyrosinase 저해활성 분석 을 위한 분석용 시료는B. licheniformis SCDB 1234균으로 발효하여 동결건조gi여 사용하였다. 각 시료 1 g씩을 취해 methanol 30 mL를 가하여 0.5시간 동안 초음파 처리 후 원심분리하였다. 위의 과정을 3번 반복하여 상등액만을 모 아 45°C에서 농축한 후 2 mL methanol에 녹여 0.45 μm NYLON syringe filter로 여과 후 20배 희석하여 사용하였다.

Phenolic acid와 flavonoid 조성은 HPLC를 사용하여 분석 하였다. HPLC 기기는 Sycam(Germany)사의 S2100 pump, S5200 autosampler와 S3210 photo-diode array(PDA) 검출기 를 사용하였다. Column은 Waters사의 sunfire ODS C₁₈(4.6×250 mm, i.d. 5 μm)와 C₁₈ guard column(4.6×20 mm, i.d. 5 μm)을 사용하였다. 성분 분리는 gradient mode로 하였 으며, 이동상 A는 0.1% formic acid in 10% acetonitrile, 이동 상 B는 0.1% formic acid in 90% acetonitrile을 사용하여 기울기 용리 조건에서 분석하였다. 분석은 상온에서 실시 하였으며 유량은 1.0 mL/min, injection volume은 20 μL, 검출기 파장은 280 nm로 하여 분석하였다. 기울기 용리 조건은 100% A/0% B at 0 min, 100% A/0% B at 2 min, 90% A/10% B at 4 min, 37% A/63% B at 25 min, 50% A/50% B at 10 min, 100% A/0% B at 4 min으로 하였다.

DPPH에 의한 자유라디칼 소거활성은 Blois의 방법(9)을 약간 변형하여 측정하였다. 시료 20 μL와 0.1 M Tris-HCl 완충용액(pH 7.4) 80 μL 및 500 μM DPPH in methanol 용액 100 μL를 96-well plate에 넣고 실온에서 30분간 방치한 다음 ELISA microplate leader(VersaMax, Molecular Devices, CA, USA)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정 하였으며, 대조구로서는 BHA(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)와 BHT(Sigma-Aldrich Co.)를 사용하였다. DPPH 자유 라디칼 소거활성은 다음과 같이 계산하였으며, 각 시료는 3반복 측정하여 평균값으로 표시하였다.

DPPH radical scavenging activity (%)=[1-(A/B)]×100

A : absorbance of sample

B : absorbance of blank

Tyrosinase 저해활성은 Jung 등(10)의 방법을 약간 변형 하여 측정하였다. 즉, 35°C의 수조에서 온도를 미리 조정한 0.175 M phosphate buffer(pH 6.8) 60 μL, 5 mM L-DOPA 용액 60 μL 및 시료 40 μL를 96-well plate에 넣고 mushroom tyrosinase(110 U/mL) 60 μL를 첨가하여 35°C에서 2분간 반응시킨 다음 ELISA microplate leader(VersaMax, Molecular Devices, CA, USA)를 사용하여 475 nm에서 흡광 도를 측정하였으며, 대조구로서는 arbutin(Sigma-Aldrich Co., USA)과 kojic acid(Sigma-Aldrich Co.)를 사용하였다. tyrosinase 저해활성은 다음과 같은 식에 의해 계산 하였으 며, 각 시료는 3반복 측정하여 평균값으로 표시하였다.

Tyrosinase inhibition rate(%)

= [1-(A_{sample (475 nm)} / A_{control (475 nm))}]×100

유기산과 유리당의 분석은 시료 5 g에 증류수 45 mL를 가하여 1시간동안 균질화 시킨 후 0.45 μm membrane filter 와 Sep-pak C₁₈ cartridge(MeOH 2 mL, Water 2 mL로 활성화) 에 통과시킨 후 HPLC로 분석하였다. 유기산의 column은 Aminex column HPX-87H(300×7.8 mm)을 사용하였으며, column 온도는 60°C, mobile phase는 0.01 N H₂SO₄, flow rate는 0.6 mL/min, injection volume은 20 μL, 검출기는 Agilent Detector DAD 210 nm로 분석하였다. 유리당의 column은 Ashipak NH2P-504E(4.6 mm×250 mm)을 사용하 였으며, column 온도는 35°C, mobile phase는 acetonitrile/water 75:25(v:v), flow rate는 1.0 mL/min, injection volume은 20 μL, 검출기는 RI-detector(Shiseido SI 2)로 분석하였다

유리아미노산은 시료 2 g을 취하여 3차 증류수 30 mL 넣고 교반한 후 50 mL로 정용한수 초음파를 이용하여 20분 간 추출한 후 원심분리(3000 rpm, 10분)한 다음 상등액 2 mL에 5% TCA 2 mL를 넣은 후 원심분리(10,000 rpm, 10분) 한 후 상등액을 취하여 0.02 N-HCL로 희석한 후 0.2 μm syringe filter에 통과시킨 후 아미노산분석기(Amino acid analysis(Hitachi L-8900, Hitachi High Technologies America, Inc., USA)로 분석하였다. 이 때 column은 hitachi 4.6×60mm(speration), hitachi 4.6×40 mm(ammonia filtering)을 사 용하였으며, column 온도는 50°C, mobile phase는 buffer set(PH-SET KANTO), flow rate(mL/min)는 buffer 0.4, ninhydrin 0.35, injection volume은 20 μL였다.

Lipase 저해활성은 Jung 등(11)의 방법을 변형하여 측정 하였다. Porcine pancreatic lipase 0.3 mg에 10 mM MOPS와 1 mM EDTA(pH 6.8)를 포함하는 buffer를 30 μL를 넣고 tris buffer(100m M tris-HCl, 5 mM CaCl2, pH 7.0)를 850 μL 첨가하여 enzyme buffer를 준비하였다. Enzyme buffer에 시료 20 μL를 첨가하여 37°C에서 15분간 반응시켰다. 반응 후 10 mM ρ-nitrophenyl butyrate(Sigma-Aldrich Co., USA) 20 μL를 첨가하여 다시 37°C에서 15분간 반응시켰다. ρ-nitrophenyl butyrate가 ρ-nitrophenol로 가수분해된 정도를 Elisa reader (Infinite 200 TECAN, Bio tex, Austria)를 사용하 여 흡광도 400 nm에서 측정하였다. Lipase 저해활성(%)은 다음과 같이 계산하였다.

Pancreatic lipase inhibitory activity(%)=[1-(B-C)/A]×100

A : Absorbance without addition of the sample

B : Absorbance of the sample

C : Absorbance without addition of the enzyme

AGI 활성은 Watanabe 등(12)의 방법을 약간 변형하여 측정하였다. 시료 50 μL에 0.5 U/mL α-glucosidase 효소액 50 μL (in 0.1M PBS, pH 6.8)을 혼합하여 37°C에서 10분 동안 pre-incubation하였다. 3 mM ρ-NPG(ρ-nitro-phenyl-α-glucopyranoside, in 0.1 M PBS, pH 6.8) 100 μL를 가한 후 37°C에서 10분간 반응시킨 후 0.1M Na₂CO₃ 100 μL를 가하여 반응을 정지시켰다. 이때 생성된 ρ-nitrophenol의 양 을 분광광도계(Infinite M200, Bio-tex)를 사용하여 흡광도 405 nm에서 측정하였다. 각 시료의 AGI 활성은 다음 식에 의해 시료 반응구와 무처리구 사이의 흡광도 차이를 백분율 (%)로 나타내었다.

AGI activity(%) = [ 1- (As - Ab) / Ac ] × 100

As : Absorbance of the sample

Ab : Absorbance without addition of the enzyme

Ac : Absorbance without addition of the sample

실험결과 중 항비만 활성 결과에 대하여 Minitab 16 statistical program(Minitab Inc.)을 사용하여 분산분석 (ANOVA) 하고, 이중 꾸지뽕 발효물의 항비만 활성은 사후 검정(Tukey)을 실시하였으며, 꾸지뽕을 이용한 된장의 항 비만 활성은 공변량분석(ANCOVA, generally linear model) 을 이용하여 유의성을 검정하였다.

꾸지뽕 열매를 A. oryzae koji, Lactobacillus 6종, Bacillus 2종의 균을 접종하여 37°C에서 72시간 발효시킨 결과, 대부 분의 발효 미생물들에 의하여 꾸지뽕 열매 발효물의 polyphenol류 및 flavonoid 함량이 크게 증가하는 경향을 보였다. 특히A. oryzae koji에 의한 발효에서는 protocatechuic acid(487.53 μg/g)가, Lactobacillus속 균들에 의해서는 chlorogenic acid(207.08~365.82 μg/g)가 발효에 의해서 크게 증대하는 것으로 나타났다(Table 1). 기능성 flavonoid 성분 으로는 kaempferol이 대부분의 균주들에 의하여 큰 폭으로 증가되었는데 무발효 꾸지뽕의 9.54 μg/g에 비해 발효 꾸지 뽕의 경우 57.89~217.04 μg/g의 범위로 거의 10배 정도 함량 이 증가되는 경향을 보여 열매 중의 kaempferol은 배당체 형태로 존재하다가 발효 미생물들의 발효ž분해에 의하여 aglycone인 kaempferol 함량이 크게 증가하는 것으로 보여 진다. 그 중에서도B. licheniformis SCDB 1234균주는 원료 중의 kaempferol 함량인 9.54 μg/g 대비 217.04 μg/g으로 약 22배의 높은 생성율을 보여 향후 꾸지뽕 열매의 기능성 분 증강에 우수한 균으로 평가되었다. Seo 등(13)도 꾸지뽕 열매의 유산균 발효에 의하여 꾸지뽕 열매에 함유된 폴리페 놀의 함량이 약 47% 증가된다고 보고한 바 있다.

우수 균주로 선발한 B. licheniformis SCDB 1234균주로 꾸지뽕 열매를 상온에서 7일간 발효시키면서 경시적으로 성분변화를 검토한 결과(Table 2, Fig. 1), phenolic acid 성분 들보다 taxifolin, quercetin, kaempferol 등과 같은 flavonoid 성분들의 함량이 크게 증가하는 것으로 나타났다. Taxifolin 은 1.8배, quercetin은 2.4배, kaempferol(188.31 μg/g)은 약 8배의 함량 증가를 보여B. licheniformis SCDB 1234균주는 꾸지뽕 열매의 기능성 flavonoid 함량 증대에 우수한 균주임 이 확인되었다. 이들 기능성 flavonoid의 발효기간에 따른 변화는 배양 6일째에 가장 높게 나타났다. kaempferol은 혈당 감소, 고지혈증 억제 등에 효과가 있다는 실험 결과들 이 보고되어 있다(14,15). 또한, 항산화, 항염증, 항균 작용 이 있고, 암세포의 사멸(apoptosis)을 유도하여 항암작용에 관여하는 것으로 알려져 있어(16-18) 꾸지뽕 열매의 발효물 은 우수한 기능성 소재로 충분한 가치가 있음을 확인할 수 있었다.

Fig. 1. Changes of kaempferol contents dur ing fermentation.

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Kang 등(19)도B. lichenifornis와B. subtilis 균주로 꾸지뽕 열매를 발효하고 70% ethanol추출물 중의 polyphenol류는 각각 35.67%와 46.37%가 증가하였고, total flavonoid 함량 역시 대조구에 비하여 각각 25.97% 및 20.13%가 증가하였 다는 보고와 유사한 경향을 보였다. Baek(20)은 B. licheniformis 균주로 40°C에서 48시간 발효시킨 청국장의 polyphenol 함량은 발효하기 전에 비하여 38.05%가 증가한 다고 하였고, Lee 등(21)은B. subtilis 균주로 40°C에서 24시 간 발효시킨 탈지대두 grits 발효물의 80% ethanol 추출물은 total polyphenol 및 flavonoid 함량이 발효시키기 전에 비하 여 3.8~4.8배 증가한다고 보고하여 본 연구결과와 유사한 경향을 나타내었다. 균주 발효군에서 total polyphenol 및 flavonoid 함량이 증가한 현상은 발효과정 중에 분해되거나 새롭게 합성되는 성분에 의한 결과로 사료된다(22).

발효기간에 따른 꾸지뽕 열매 발효물의 생리활성을 검토 하고자 DPPH법에 의한 항산화활성과 tyrosinase 저해활성 을 조사한 결과는 각각 Fig. 2A 및 Fig. 2B와 같다. 꾸지뽕은 polyphenol류와 flavonoid류가 풍부하여 기본적으로 높은 항산화력을 가지고 있기 때문에 발효균 처리에 의한 항산화 활성(DPPH법)의 비교를 위하여 발효물 시료를 20배 희석 하였음에도 불구하고 DPPH radical 소거활성이 50~57% 수준으로 양호한 활성을 보였다. 대조구로 사용한 BHA, BHT과의 비교 결과 발효 꾸지뽕은 BHA, BHT의 92~99 ppm 농도와 유사한 항산화 활성을 보여 항산화활성이 우수 한 면을 보이고는 있으나 발효에 의하여 polyphenol류와 flavonoid류의 증가에 따른 변화가 그리 높지 않았던 것은 분석시료의 희석에 의한 영향도 있겠지만 가장 크게 증가한 (약 8배) kaempferol의 영향도 상당히 미쳤을 것으로 판단된 다. Villa 등(23)은 보통 식물체에서 발견되는 polyphenol류 와 flavonoid류를 대상으로 DPPH 소거활성을 비교한 결과 kaempferol의 DPPH radical 소거활성에 대한 EC₅₀값이 18.8×10^-3 mM으로 타 polyphenol류와 flavonoid류에 비하여 현저히 낮다고 보고한 바 있어 이의 영향이 컸을 것으로 추측된다.

Fig. 2A. Changes of anti-oxidation activity of fermented Cudrania tricuspidata fruits by B. licheniformis SCDB 1234 during fermentation periods.

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Fig. 2B. Changes of tyrosinase inhibition rate of fermented Cudrania tricuspidata fruits by B. licheniformis SCDB 1234 during fermentation per iods.

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Tyrosinase 저해활성도 20배 희석한 시료에 대하여 대조 구로 arbutin와 kojic acid와 비교분석한 결과 시료를 20배 희석하였음에도 불구하고 50~64%의 저해활성을 보여 발 효 꾸지뽕은 우수한 미백용 소재로서의 가능성을 보였고 이때의 활성은 arbutin이나 kojic acid의 95 ppm과 90 ppm와 같은 양호한 저해활성을 나타내었다. 발효기간에 따른 변 화는 발효 초기부터 증가하였고 그 이후의 변화는 비교적 적었다. Kang 등(19)도B. lichenifornis와 B. subtilis 균주로 꾸지뽕 열매를 발효하고 70% ethanol추출물에 대한 ABS 라디칼 소거능, SOD 유사활성, ferrous ion chelating 효과와 tyrosinase 저해활성 등이 균주발효군에서 활성이 증가하여 발효 꾸지뽕열매는 기능성 증진용 소재로 활용가치가 높다 고 주장한 바 있다.

꾸지뽕 열매 발효물의 첨가 시점에 따라 숙성전 된장과 숙성후 된장으로 구분하였다. 숙성전 된장은 3개월간 염수 침지후 장분리한 메주에 첨가하였고, 숙성후 된장은 1년간 숙성시킨 된장에 첨가하여 4주간 발효패턴을 분석하였다. 숙성기간 중 꾸지뽕 열매 발효액의 첨가량을 무첨가, 3%, 5%, 7% 및 10%로 하여 시료별 변화를 측정하였다.

유기산의 함량은 유기산의 종류에 따라 상이한 결과를 보였다(Table 3). Citric acid는 숙성이 진행될수록 감소하는 경향을 보였고, 숙성후 된장보다 숙성전 된장에서의 함량 이 높게 나타났다. Lactic acid는 된장에 비해 숙성후 된장이 현저히 높은 값을 나타내었으며, citric acid와는 반대로 숙 성이 진행될수록 증가하였다. 본 연구결과는 재래식 된장 에서 lactic acid 가 가장 높은 함량을 나타내었다는 연구결 과(24)와 일치하였다.

Acetic acid는 숙성전 된장 실험구의 경우 숙성 2주차에는 증가하였지만 숙성 4주차에는 감소하는 경향을 보였고, 발 효물이 첨가되지 않은 실험구에서는 0일차에는 검출되지 않았지만 2주차에는 급격하게 증가했음을 알 수 있었다. 반면 숙성후 된장의 경우, 숙성이 진행될수록 acetic acid의 함량은 감소하였다. 이는 호기성균인 초산균의 일시적인 증식에 의해 증가된 초산이 혐기적인 된장의 발효조건에 따라 숙성기간에 따라 초산이 감소하는 경향을 보이는 것으 로 사료된다. 숙성전 된장의 succinic acid는 숙성이 진행될 수록 증가하는 경향을 보였으나 그 양은 미비한 수준이었 다. Ooxalic acid의 경우는 숙성이 진행되면서 숙성전 된장 에서는 전반적으로 감소하는 경향이었으며 숙성후 된장에 서는 숙성기간에 상관없이 비슷한 수치를 보였다. 이는 oxalate, malate, citrate, succinate 순으로 함유하고 있다는 결과(25)와는 상이한 결과였다.

유리당 중 fructose는 숙성전 된장과 숙성후 된장 모두에 서 0일차에는 검출 되었지만, 숙성이 진행되면서 검출되지 않았다. Glucose는 숙성전 된장의 경우 전반적으로 숙성이 진행될수록 증가하였다가 감소하는 경향을 보였다. Sucrose 는 숙성 0일차에서만 검출되었으며 숙성전 된장은 발효액 이 첨가되지 않은 실험구에서만 검출되었다. Maltose는 숙 성전 된장의 경우 숙성이 진행될수록 증가하는 경향을 보였 으며, 숙성후 된장은 꾸지뽕열매 발효액의 첨가량에 따라 일정한 패턴을 보이지는 않았다(Table 4). 본 연구결과의 유리당 함량은 된장의 유리당의 함량중 glucose가 가장 높 게 나타났다는 연구결과(26)와 유사하였다.

유리아미노산을 분석한 결과(Table 5), 숙성전 된장의 경우 발효물을 첨가한 후 숙성이 이루어지기 때문에 숙성이 진행될수록 유리아미노산이 증가하였지만, 숙성후 된장은 숙성이 상당부분 진행된 시점에 발효물을 첨가하였기 때문 에 발효물이 유리아미노산에 미치는 영향이 낮은 것으로 판단된다. 숙성전 된장과 숙성후 된장 모두 꾸지뽕 열매 발효물 첨가량에 따라 유리아미노산의 유의적인 증가나 감소의 경향은 보이지 않았다. 재래된장에서 맛에 대한 기 여도는 leucine과 isoluecine 같은 쓴맛 성분이 가장 큰 영향 을 미치며, 다음으로 cysteine, aspartic acid, glutamic acid와 같은 구수한 맛 성분이 영향을 미친다고 보고 되고 있다 (27). 본 연구결과 꾸지뽕 된장의 구수한 맛 성분으로는 glutamic acid가 aspartic acid의 함량보다 높은 결과를 나타 내었는데 이는 전통된장에서 glutamic acid가 aspartic acid 보다 더 많이 존재한다는 보고(28)와 유사하였다. 이는 꾸지 뽕 열매 발효물의 첨가가 된장의 맛성분의 패턴에는 영향을 미치지 않는 것으로 사료된다.

α-Glucosidase는 α-amylase에 의해 분해된 당질을 최종적 인 단당류로 전환시킨다. 이러한 효소의 활성 저해는 당질 가수분해와 흡수과정을 지연시킴으로 식후 당 농도를 제한 한다고 보고되고 있다(31). 또한 α-Glucosidase 저해제는 제2형 당뇨와 같은 당질 관련 질병을 위한 치료제 개발에 유용하다고 제시하고 있다(32).

꾸지뽕 열매 발효액을 제조하여 AGI활성을 비교 분석한 결과는 Fig. 5A와 같다. 꾸지뽕 열매의 발효전 AGI활성은 89.27±0.59~89.78±0.35% 이었으며, 발효후에는 93.60±1.14~95.95±0.32%로 발효전보다 발효후가 높게 측정되었다.

Fig. 5A. α-glucosidase inhibitory activity in fermentation mater ials of Cudrania tricuspidata fruits. □, Before fermentation; ■, After fermentation. S-C & S-B, FMFCT fermented after NaCl addition; SB-C & SB-B, FMFCT fermented without NaCl addition. Data are expressed as means±SD of three experiments.

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꾸지뽕 열매 발효액을 첨가한 숙성전 된장과 숙성후 된 장에 대하여 AGI 활성을 측정한 결과는 Fig. 5B와 같다. 숙성전 된장의 경우 발효 0일차(63.26±0.02~65.26±0.08%) 보다 발효후인 숙성 4주차(70.25±0.69~84.89±0.08%)의 AGI활성이 높게 나타났으며, 숙성후 된장도 발효 0일차 (63.32±0.08~67.44±0.08%)보다 발효4주차(74.55±0.04~91.25±0.04%)의 AGI활성이 높게 나타났다. 꾸지뽕 열매 발효액을 10%첨가한 숙성전 된장의 AGI활성은 84.89±0.08%, 숙성후 된장은 91.25±0.04%를 나타내어 숙성후 된 장이 높게 나타났다. Lee 등(33)이 24종의 된장메탄올추출 물에 대한 AGI 활성을 측정한 결과, 0.97~18.53%의 저해활 성을 보였고, 이는 대조구인 시판 식후혈당강하제 acabose (99.54±3.13%)에 비해 월등히 낮은 수준이었으나, 본 연구 에서 개발한 꾸지뽕 열매 발효액을 10% 첨가한 꾸지뽕 된장에서는 acabose와 유사한 저해활성을 보여주었다. 결 과적으로 꾸지뽕 열매 발효액을 첨가한 꾸지뽕 된장은 식후 혈당강하능력이 있는 것으로 사료된다.

Fig. 5B. α-glucosidase inhibitory activity in Doenjang added fermentation materials of Cudrania tricuspidata fruits. □, 0 day; ■, 4 week aging. D-0, Doenjang+FMFCT 0%; D-5, Doenjang+FMFCT 5%; D-10, Doenjang+FMFCT 10%; DS-0, Aged Doenjang+FMFCT 0%; DS-5, Aged Doenjang+FMFCT 5%; DS-10, Aged Doenjang+FMFCT 10%. Data are expressed as means±SD of three experiments.

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