재래 식초에서 초산균의 분리와 발효특성 신속 비교

본 연구에서는 한국미생물자원센터(KCTC) 및 한국농업 미생물자원센터(KACC)에서 분양받은 초산균을 대조구로, 국립농업과학원 발효식품과에서 분리한 균주를 공시균으 로 사용하였다. 분리균은 전국의 4개 지역(경기 성남, 경북 청도, 전북 무주, 충남 서천)에서 복분자 식초 및 감식초 시료를 수집하여 GYCEA 배지에 도말하고 30°C에서 배양 한 후, 초산균을 순수분리 하였다(12). 분리균의 동정은 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 하였다. 프라이머는 Universal PCR primer인 27F (5’-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3’)와 1492R (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’) 을 사용하였고, PCR은 initial denaturation 5분, 그리고 94°C 에서 45초간 denaturation, 55°C에서 60초간 annealing 및 72°C에서 60초간 extension cycle을 35회 수행하였다. PCR 산물의 염기서열은 ㈜제노셀에 의뢰하여 염기서열을 분석 하였다(12). Phylogenetic tree 작성은Lasergene사의DNASTAR pro software (Seqman Pro, Ver 8.1.5)와 The National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 제공하는 Advanced Blast Search 프로그 램을 통하여 GenBank에 보고 된 유사 균주와의 염기서열을 비교하여 계통분류학적 유연관계를 분석한 후, MEGA V4.0을 이용하여 Tamura-Nei distance model과 neighborjoining method에 의해 계통도를 작성하였다(14,15).

초산균의 발효 특성을 분석하기 위해, 초산 과산화, 초산 및 pH 내성, 정치배양시 콜로이드 생성 유무, 초산 발효능을 조사하였다. 초산 과산화는 시험배지(D-glucose 5 g/L, glycerol 5 mL/L, polypeptone 5 g/L, yeast extract 5 g/L, bromocresol purple 30 mg/L, acetic acid 10 mL/L, ethanol 10 mL/L, agar 15 g/L)에 초산균을 접종하여 푸른색의 콜로 니가 생성되면 과산화 특성이 있는 것으로 판정하였다(16). 초산 및 pH 내성 시험배지(D-glucose 5 g/L, glycerol 5 mL/L, polypeptone 5 g/L, yeast extract 5 g/L, acetic acid 30 mL/L, ethanol 20 mL/L, agar 15 g/L), (D-glucose 5 g/L, glycerol 5 mL/L, polypeptone 5 g/L, yeast extract 5 g/L, pH 3.0~3.4, ethanol 20 mL/L, agar 15g/L)에 초산균을 접종하여 30°C 및 37°C에 3일간 배양하여 콜로니 생성 유무로써 초산 내성 을 판정하였다(16). 정치배양시 콜로이드 생성은 시험배지 (D-glucose 5 g/L, glycerol 20 mL/L, polypeptone 10 g/L, yeast extract 10 g/L, potato extract 200 mg/L)에 초산균을 30°C에 3일간 정치배양 후, 콜로이드 형성 유무를 판정하였 다(16). 초산 생성능은 시험배지(D-glucose 10 g/L, glycerol 10 mL/L, polypeptone 2 g/L, yeast extract 2 g/L, potato extract 100 mg/L, acetic acid 10 mL/L, ethanol 40 mL/L)에 초산균을 30°C에 5일간 진탕 배양하여 2일마다 적정산도를 측정하였 다(17).

종초용 우수 초산균 선발은 전국 4개 지역에서 수집한 재래 식초에서 GYCEA 배지에 도말하여 30°C에서 배양하 여 clear zone을 형성하는 집락을 초산균으로 추정하고 순수 분리하였다. 일반적으로 GYCEA 배지에서 초산균이 생육 하면 배지내 CaCO₃를 분해하여 투명환(clear zone)이 형성 된다. 따라서 투명환의 크기가 클수록 초산 생성력이 뛰어 난 것으로 판단할 수 있다(12).

분리 초산균의 16S rRNA 염기서열을 비교분석한 결과는 Fig. 1과 같다. KACC16934(RDA-F) 및 Gam2 균주는 A. pasterianus DSM3509(GQ240636)와 염기서열이 99.9%, 100% 일치하여 유연관계가 가장 가까움을 확인할 수 있었 다. 따라서 KACC16934, Gam2 균주는A. pasterianus 또는 그 근연종으로 판단되어A. pasterianus로 동정하였다. V5-7 균주는 A. malorum DSM14337(JF793957)과 V8-1 균주는 Gluconacetobacter xylinus NRBC15237(AB680815)와 염기 서열이 각각 100% 일치하여 A. malorum V5-7 Ga. xylinus V8-1로 동정하였다. 또한, V11-5 균주는 Ga. intermedius DSM11804(JF793991)와 RDA-S 균주는Ga. entanii LTH4560(NR028909)와 염기서열이 99.8%, 99.7% 일치하 여Ga. intermedius V11-5, Ga. entanii RDA-S로 동정하였다. Table 1.

Fig. 1. Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences showing the positions of the acetic acid bacter ia isolated from different kind of vinegar .

Download Original Figure

초산을 한 번 더 산화시켜 pH를 높이고, 산도를 떨어뜨리 는 초산의 과산화 조사에서는 분리 균주 모두 음성으로 나타났으며, 식초 발효시 과산화로 인한 식초 제조의 실패 는 적은 것으로 판단된다. 초산균은 당과 알코올을 초산으 로 산화시킬 수 있는 능력에 따라 초산과 젖산을 과산화시 킬 수 있는Acetobacter 속 및Gluconacetobacter 속이 있으 며 알코올보다 당을 더 선호하며 초산을 과산화시킬 수 없는 Gluconobacter 속으로 구분된다(3). 본 실험에서는 Acetobacter 속과 Gluconacetobacter 속 모두 과산화하지 않는 것으로 나타났다. Saeki 등(16)이 보고한 바에 따르면 A. rancens, A. lovanienis, A. xylium, A. aceti, A. pasteurianus, G. sphaericus 중에서 A. rancens, A. aceti 등 몇몇 균주가 초산을 과산화한다고 보고되었다. 초산균이 초산을 과산화 하는 것은 초산균이 존재하는 곳의 알코올 농도, 초산 농도, 온도 등 환경 요인에 따라 달라질 수 있으므로 이에 대한 세부적인 연구가 필요하다.

초산에 대한 내성은 Gluconacetobacter 속 균주에서만 나타나는 것으로 확인되었다. pH에 대한 내성은 A. malorum V5-7, A. acetii KCTC1010에서 가장 높은 활성을 보였고, Gluconacetobacter 속 균주와A. pasteurianus Gam2 에서도 pH 3.3 까지 내성을 보이는 것으로 나타났다. A. malorum KACC12222, A. pasteurianus KACC13994는 pH 3.5까지 내성을 있는 것으로 관찰되었다. A. pasteurianus KACC16934, Ga. entanii RDA-S에서는 pH 3.5 이하에서는 콜로니가 발견되지 않았다. 초산균의 최적 생장 pH는 5.0~6.5이며 보다 낮은 pH에서도 생육하는 균주도 발견되 어 균주의 특성이 다양한 것으로 생각된다(11).

발효 중 콜로이드 생성 조사에서 Gluconacetobacter 속 중 Ga. intermedius V11-5, Ga. xylinus V8-1 균주만 다량의 콜로이드를 생성하였으며, 이는 식초 발효균으로 적합하지 않은 성질이다(16). Acetobacter 속 균주중 A. malorum KACC1222, V5-7, A. pasteurianus KACC16934, Gam2는 상층부에 얇은 균막이 발견되었으나, 이는 균주의 성장이 활발한 것을 의미함으로 식초 발효균으로 적합한 것으로 생각된다. 초산균이 생성하는 콜로이드는 초산균의 glucose 대사에 의해 생산되는 dextrans, levans, cellulose이며 세포 외 다당체이다. 이러한 세포외 다당체는 최종 식초 제품의 품질에 해로운 것으로 알려져 있다(18).

초산 생성능 결과는 Fig. 2에 나타내었다. 상위 4종의 균주가 발효 3일 이후부터 식초 발효에 필요한 총산 4% 이상 생성하는 것으로 나타냈다. A. malorum V5-7, A. pasteurianus Gam2, Ga. intermedius V11-5, A. malorum KACC12222에서 가장 높은 산 생성능을 보였다. 상위 4종 외 A. pasteurianus KACC13994, A. pasteurianus KACC16934, Ga. entanii RDA-S 균주도 발효 5일 이후에는 총산이 3% 이상 될 것으로 예상되며, 초산균 7균주가 종초 로써 가능성을 나타내었다.

Fig. 2. Acetic acid production by isolated acetic acid bacteria and type strains. Acetic acid bacteria were grown shaking on 100 mL of medium containing 1.0% D-glucose, 1.0% glycerol, 0.2% polypeptone, 0.2% yeast extract, 10.0% potato extract, 1.0% acetic acid, 4.0% ethanol in 250 mL flask at 30°C for 5 days. Acetic acid contents were determined by titration with 0.1 N NaOH against phenolphthalein. The data are averages based on three trials.

Download Original Figure

식초 제조를 위해, 요구되는 초산균의 특징은 알코올을 보다 산화시킬 수 있는 능력, 빠른 초산 생성능, 초산 내성, 초산의 비과산화, 낮은 pH 내성, 박테리오파지 저항성, 세 포외 다당 비생성, 불쾌한 냄새를 내지 않는 것이 필요하다 (11). 본 연구에서 국내 재래식초에서 분리된 초산균을 대상 으로 웰빙형 발효식초 제조를 위한 초산균의 특성 일부를 규명하였다. 하지만 제조 현장에 적용하기 위해서는 현장 기술과 환경에 적합한 맞춤형 종초 제조 기술에 대한 연구 가 필요하다. 본 연구를 통해 종초용 초산균의 선발과 계량 으로 국내 발효 식초의 품질 향상에 도움이 되길 바란다. Table 2.