Bacillus Subtilis CBD2로 배양된 백미 발효물의 미세캡슐 제조 및 물리화학적 특성

본 실험에 사용된 백미는 경상북도 의성군에서 2013년 10월에 재배된 것을 구입하여 건식 분쇄기(FM-909W, Hanil Co., Sejong, Korea)로 분쇄한 다음 표준망체(0.074 mm, Chung Gye Sang Gong Sa, Seoul, Korea)를 통과시킨 분말을 사용하였다.

발효를 위해 사용된 미생물은 된장으로부터 분리 동정한 Bacillus subtilis CBD2를 이용하였다(15). Starter는 백미 분 말 20 g을 삼각플라스크에 넣고 멸균 한 다음 40 mL의 멸균수를 첨가하여 사용하였으며 B. subtilis CBD2는 nutrient broth(NB, Difco, Detroit, MI, USA)에 접종하여 37°C에서 24시간 배양하여 사용하였다. 백미 발효는 미리 배양된B. subtilis CBD2 starter액을 2% 접종 후 37°C 배양기 (IL-21, Jeio Tech Co., Daejeon, Korea)에서 96시간까지 발효 하여 실험용 시료로 사용하였다.

분무건조공정을 이용한 미세캡슐의 제조는 백미 발효물 500 mL에 alginic acid(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 1.0%(SD-A) 와 chitosan(223 kDa, Kittolife, Seoul, Korea)을 각각 0.3%(SD-Ach0.3), 0.5%(SD-Ach0.5) 및 1.0%(SD-Ach1.0)를 첨가한 다음 고압균질기(HG-15D, DAIHAN scientific Co., Wonju, Korea)를 이용하여 4,000 rpm에서 15분간 균질화하였다. 제조된 균질액은 주입 온도 160°C, 방출 온도 110°C로 설정하였고, 분무속도는 17,000 rpm에서 시료공급속도는 12 mL/min의 조건으로 아토마이 저(atomizer)가 장착된 분무건조기(KL-8, Seogang Engineering Co., Ltd, Cheonan, Korea)를 이용하여 미세캡슐 분말을 제 조한 다음, –70°C 이하의 암소에 보관하면서 분석용 시료 로 사용하였다. 대조구로는 피복물질을 첨가하지 않고 동 결건조기(FreeZone-2.5, Labconco Co., Kansas, MO, USA) 를 이용하여 건조한 분말을 사용하였다.

생균수 측정은 배양액 1 mL에 0.85% sodium chloride (Duksan Pure Chemicals, Seoul, Korea) 용액 9 mL를 혼합하 여 10배 희석법으로 희석한 다음, 각각의 희석액 100 μL를 1.5% agar(Sigma-Aldrich Co.)가 첨가 된 nutrient broth(NB, Difco.)에 접종하여 평판 측정법으로 생균수를 측정하였다. 각각의 plate는 37°C 배양기(Jeio Tech Co.)에서 24시간 배양 한 다음 형성된 colony 수를 계측하고, colony에 희석배수를 곱하여 시료 mL당 colony forming unit(CFU)로 나타내었다.

Amylase 활성 측정은 50 mM sodium phosphate(Duksan Pure Chemicals.) 완충용액(pH 7.0)에 0.5% soluble starch (Sigma-Aldrich Co.)를 기질로 이용하여 제조된 용액 0.5 mL에 시료 0.5 mL를 효소액으로 첨가하여 37°C에서 30분 간 환류수조(BS-31, Jeio Tech Co.)에서 반응시켰다. 이 때 생성된 환원당의 함량은 3,5-dinitrosalicylic acid(DNS, Sigma-Aldrich Co.)방법(16)으로 측정하였으며, 본 연구에 서 효소 활성의 1 unit은 1분에 1 μmol의 glucose(Sigma- Aldrich Co.)를 생산하는 효소량으로 정의하였다.

수분함량 측정은 분말을 페트리디쉬에 담아 적외선 수분 측정기(MB-45, Moisture analyzer, INC., Ohaus, USA)를 이 용하여 105°C에서 분말의 수분함량이 항량에 도달할 때까 지 건조하여 측정하였다.

색도 측정은 분말을 표준색도가 Y=94.5, a=0.18, b=0.32 로 보정된 색차계(Chromameter CR200, Minolta Co., Osaka, Japan)를 사용하여, 밝기를 나타내는 L(lightness), 적색도를 나타내는 a(redness), 황색도를 나타내는 b(yellowness)값을 측정하였으며, 색차 ΔE는 동결건조 분말을 대조구로 하여 아래와 같이 계산하였다.

입자크기 측정은 레이저입도분석기(LS-13-320, Beckman coulter, Fullerton, CA, USA)를 이용하여 isopropyl alcohol에 분산시켜 측정하였다. 입자표면구조는 각 시료에 gold ion coating한 후 주사형 전자현미경(S-4800, Hitachi high- Technologies Co., Tokyo, Japan)을 이용하였다. 전자현미경 을 이용한 관찰은 3.0 kV에서 1,000배 비율로 관찰하였다.

수분흡수지수(water absorption index, WAI) 및 수분용해지 수(water solubility index, WSI) 측정은 phillips의 방법(17)을 변형하여 측정하였다. 동결건조 및 미세캡슐 분말 0.5 g에 20 mL 증류수를 첨가하여 3,000 rpm에서 20분간 원심분리 (VS-6000CFN, Vision scientific Co., Bucheon, Korea) 한 후 침전물은수분흡수지수로 사용하였으며, 상등액은 미리무게 를 구한 수기에 분리하여 105°C에서 4시간 동안 건조시킨 고형분을수분용해지수로 사용하여 아래와같이 계산하였다.

In vitro 인체 내 소화모델은 Hur 등(18)의in vitro human digestion의 multi-step model을 일부 수정하여 이용하였으 며, 동결건조 및 분무건조 미세캡슐 분말의 amylase 활성 측정을 통해 인체 내 소화모델을 분석하였다. 사용된 액은 대한약전에 따라 당일 제조 하였으며, 위장액(pH 1.2)은 0.1 N hydrochloric acid(HCl, Duksan Pure Chemicals.)을, 소장액(pH 6.8) 및 대장액(pH 7.4)은 0.1 M sodium phosphate(Duksan Pure Chemicals.) 완충용액을 사용하여 제조하였다. 반응은 환류수조(BS-31, Jeio Tech Co.)에서 37°C, 50 rpm으로 진행되었으며, 먼저 삼각플라스크에 시료 0.2 g 및 위장액 12 mL를 첨가하여 2시간 반응하였다. 이 후 소장액 18 mL를 첨가하여 1시간 반응 한 다음 대장액 6 mL를 첨가하여 2시간 반응을 진행하였다. 각 용액 첨가 시 sodium bicabonate(Duksan Pure Chemicals.) 및 sodium hydroxide(Duksan Pure Chemicals.)를 사용하여 pH를 보정 한 다음 amylase 활성을 측정하였다.

실험결과는 3회 반복으로 행하여 평균±표준편차로 나타 내었으며 SPSS(19.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하 여 분산분석(ANOVA)을 실시하였으며, 각 측정 평균값의 유의성(p<0.05)은 Duncan’s multiple range test로 검정하였다.

백미 발효물의 배양특성은 예비 실험을 통해 선정된 96 시간 발효 후의 생균수, pH 및 amylase 활성을 Table 1에 나타내었다. 백미에 B. subtilis CBD2를 2%로 접종하여 96 시간 발효한 결과 생균수는 7.61 log CFU/mL이었고 pH는 5.08을 나타내었다. 생균수는 Yang 등(19)의 B. subtilis CBD2를 이용한 곡류 발효물의 배양특성에서 미생물들이 곡류를 자기 증식에 효과적으로 이용함에 따라 96시간 이 후 6.89 log CFU/mL로 생균수가 증가하였다고 보고하여 본 연구결과와 유사함을 알 수 있었다. 백미 배양물은 초기 에 비해 96시간 발효한 다음 pH가 감소하였으며, 이는 미생 물에 의해 발효가 진행되면서 생성된 lactic acid와 acetic acid 등의 여러 가지 산의 생성과 관계가 있는 것으로 사료 된다(20). Amylase 활성은 159.43 unit/mL로 나타났으며, Park 등(21)의 곡물별 담자균 배양물의 효소활성에서 120시 간 발효한 다음 백미의 α-amylase 활성은 46.16~91.74 unit/mL를 나타내어 본 연구에서 배양된 백미 발효물의 활 성이 높게 나타남을 알 수 있었다.

백미 발효물 동결건조 및 분무건조 미세캡슐 분말의 수 분함량 및 색도를 측정한 결과는 Table 2와 같다. 수분함량 은 동결건조 분말에서 2.30%로 가장 낮은 함량을 나타내었 으며, 분무건조 미세캡슐 분말에서 2.90~3.68%로 키토산 함량이 증가함에 따라 높게 나타났다. Beom 등(22)의 수창 포 열풍 및 동결건조 분말의 수분함량에서 각각 8.67~16.62% 및 3.61~11.04%로 나타났으며, Lee(23)의 국내 쌀 품종의 수분함량이 7.19~13.81%로 나타나 본 연구에서 제 조된 백미 분말의 수분함량이 낮게 나타남을 알 수 있었다. 이는 분무 건조 공정에서 가열 공기 온도가 높아지면 열전 달 효율성의 증가로 인해 분말의 수분함량이 감소한다는 연구결과에 따라(24), 위생적이고 균일한 품질의 저장성 높은 분말을 얻을 수 있을 것으로 사료된다.

색도는 동결건조 분말 L값, a값 및 b값이 각각 95.85, -0.30 및 5.60을 나타내었으며, 분무건조 미세캡슐 분말에 서는 키토산 함량이 증가함에 따라 L값(92.25~96.18) 및 a값(-0.79~-1.26)은 낮아지고 b값(5.60~15.69)은 증가하는 경향을 나타내었다. 특히 동결건조 분말을 기준으로 본 △E 값은 키토산 0.3%에서 2.92로 가장 낮고 키토산 1.0%에서 10.95로 가장 높게 나타나 키토산 함량이 증가할수록 색차 의 변화가 증가하였다. Lee와 No(25)는 키토산 첨가 생면 연구에서 키토산 함량이 증가할수록 L값은 낮아지고 b값은 높은 경향을 나타내었으며 Kim 등(26)은 키토산 및 젤라틴 폴리머 필름 제조에서 색도는 키토산 함량이 증가할수록 L값 및 a값은 감소되었고 b값은 반비례로 증가되어 본 연구 와 유사한 경향을 나타내었다.

백미 발효물 동결건조 및 분무건조 미세캡슐 분말의 입 자크기 및 입자표면구조를 Table 2 및 Fig. 1에 나타내었다. 입자크기는 동결건조 분말에서 357.87 μm로 분무건조 미세 캡슐 분말에 비해 유의적으로 크게 분석되었으며, 미세캡 슐 분말의 입자크기는 48.13~68.48 μm로 키토산 함량이 증가할수록 유의적으로 감소되는 경향이었다. Park 등(27) 은 키토산 분자량에 따른 β-carotene의 미세캡슐화 및 품질 특성에서 분자량별로 입자크기가 26.55~109.80 μm의 범위 를 나타내었으며 분자량이 증가함에 증가한다고 보고하였 다. 본 연구에서는 입자크기가 100 μm 이하로 균일한 분포 를 보여주었고, 분무건조 공정을 통해 제조된 균일한 입자 크기의 미세캡슐 분말은 흐름성이 양호할 것으로 사료된다.

Fig. 1. Scanning electron microscopic photographs of the r ice powders fermented with Bacillus subtilis CBD2 (magnification ×1,000). FD, freeze-dried powder; SD-A, spray-dried powder with 1.0% alginic acid added; SD-ACh0.3, spray-dried powder with 1.0% alginic acid and 0.3% chitosan added; SD-ACh0.5, spray-dried powder with 1.0% alginic acid and 0.5% chitosan added; and SD-ACh1.0, spray-dried powder with 1.0% alginic acid and 1.0% chitosan added.

Download Original Figure

분무건조 미세캡슐 분말의 입자표면구조는 전반적으로 구형의 모양을 나타냄에 따라 흐름성이 양호할 것으로 사료 되며, 알긴산 단독 첨가군의 경우 매끈한 굴곡을 가진 표면 구조를 나타내었으나, 키토산 함량이 증가할수록 표면 굴 곡이 증가하는 경향을 나타내었다. Kim 등(28)은 부형제 종류에 따른 분말의 주사전자 현미경 관찰에서 입자 표면의 부드러운 구형이 아닌 움푹 들어간 자국들은 건조 과정 중에 입자들이 수축함에 따른 현상이라고 보고하였다.

백미 발효물을 이용한 동결건조 및 분무건조 미세캡슐 분말의 수분흡수지수(WAI) 및 수분용해지수(WSI) 측정 결 과는 Table 3과 같다. 분말의 식품산업 활용 측면에서 수분 흡수지수(WAI) 및 수분용해지수(WSI)는 중요한 가공적성 요인으로 알려져 있으며(29), 수분흡수지수의 경우 분무건 조 미세캡슐 분말에서 2.40~2.65로 동결건조 분말 2.66에 비해 낮은 흡수지수를 나타내어 분무건조 미세캡슐 분말에 서 저장 안정성이 높을 것으로 사료되며, 키토산 함량이 증가함에 따라 수분흡수지수가 높게 나타났다. Ko등(30)은 건조방법에 따른 표고버섯분말의 흡습특성에서 수분흡수 지수는 동결건조가 열풍건조에 비해 높았다고 보고하여 본 연구결과와 유사하였다.

수분용해지수는 분무건조 미세캡슐 분말에서 9.17~ 10.89%로동결건조분말7.12%에비해높은 용해지수를나타 내었으며, 동결건조분말및알긴산단독첨가에비해키토산 함량이 증가할수록 수분용해지수가 높게 나타남을 확인하였 다. 미세캡슐의 입자크기가작아질수록 수분용해지수가높아 지는 경향을 나타내었는데, Kum 등(31)은 품종 및 입자크기 에 따른 쌀가루의 수분흡수지수 및 수분용해지수 측정결과 입자크기가 작을수록 수분흡수지수 및 수분용해지수가 증가 한다고보고하였으며, Choi 등(32)의흑미의입자크기및제분 조건에서 입자가 작을수록 수분용해지수가 3.70%에서 16.30%로 증가 한다고 보고하여 본 연구결과와 유사한 경향 을 나타내었다. 이는 분무건조 미세캡슐 분말 제조시 열처리 를 통해 백미의 전분분자를 손상시켜 수용액과 분말이 쉽게 결합 한 것으로 판단되며, 키토산 함량이 증가할수록 입자 크기가 낮아져 수분 용해지수가 증가한 것으로 사료된다.

백미 발효물을 이용한 동결건조 및 분무건조 미세캡슐 분말의 생균수 및 amylase 활성을 Table 4에 나타내었다. 생균수는 동결건조 분말에서 7.01 log CFU/g으로 가장 높게 나타났으며, 분무건조 미세캡슐 분말간의 생균수는 4.46~4.62 log CFU/g로 유의적인 차이를 나타내지 않았다. Amylase 활성은 동결건조 분말에서 506.02 unit/g으로 유의 적으로 높게 나타났으며, 키토산 1.0% 첨가 분무건조 미세 캡슐 분말에서 196.63 unit/g으로 활성이 가장 낮게 나타났 다. 알긴산 단독 첨가군의 활성은 268.57 unit/g이었으며, 키토산 첨가량이 증가함에 따라 활성이 낮아지는 경향을 나타내었다. Yang 등(19)의Bacillus subtilis를 이용한 곡류 발효 분말의 생균수 및 amylase 활성이 각각 6.89~7.14 log CFU/g 및 152.27~506.02 unit/g으로 본 연구와 유사한 활성 을 나타내었다. 식품산업에서 동결건조는 건조후의 복원성 이 우수하여 널리 활용되고 있으나 Kim 등(33)의 연구에서 효소식품을 동결건조 하는 경우 장시간 건조에 따른 효소 실활이 일어날 수 있다고 보고하였다. 특히 동결건조 분말 은 효소의 저장 및 섭취과정에서 열과 강산, 강알칼리에서 효소 활성이 불안정하므로 pH 및 온도 등의 영향에 대한 안정성 향상을 위해 알긴산 및 키토산 피복물질을 통해 효소 의 저장성 및 인체 내 안정화가 용이할 것으로 사료된다.

동결건조 및 분무건조 미세캡슐 분말의 인체 내in vitro 소화모델 분석을 통해 인체 내 이용률 및 안정화 정도에 대한 분석 결과를 Fig. 2에 나타내었다. 분무건조 미세캡슐 분말의in vitro 소화모델을 확인하기 위해 muti-step model 의 방법을 이용하였으며, 이는 각각의 소화 단계별로 식품 소재의 bioavailability를 측정할 수 있을 뿐만 아니라 인체의 소화조건과 매우 유사하다는 장점을 가지고 있다(18). 모든 분말은 위장액(pH 1.2)에서 활성을 나타내지 않았으며, 키 토산을 0.3% 첨가한 분무건조 미세캡슐 분말은 소장액(pH 6.8)에서 269.14 unit/mL의 활성을 나타내었다. 특히 대장액 (pH 7.4)에서 222.28 unit/mL의 활성을 유지하여 백미 발효 물의 섭취 후 위장 환경에서 생리활성을 잃지 않고 이를 소장 및 대장에서 방출되었으며, 최종적으로 85.93%의 인 체 내 이용률을 통해 안정화 효과가 가장 잘 이루어진 것으 로 나타났다. 동결건조 분말의 경우 소장액(pH 6.8)에서 활성이 39.31 unit/mL, 대장액(pH 7.4)에서 152.57 unit/g으 로 초기 활성 대비 30.15%의 인체 내 이용률을 나타내어 분무건조 미세캡슐 분말에 비해 활성이 낮게 나타났다. 이 는 Hari 등(34)의 insulin 함유 비드 제조에서 알긴산 단독 첨가군에서 43%의 유효물질을 함유하고 있었으나, 키토산 을 0.3% 함유한 다음 유효물질 함량이 70%로 증가한다고 보고하였다. 또한, Chang 등(35)은 효소 특성 개선을 위한 β-glucosidase의 효소 고정화 연구에서 키토산 비드 제조시 높은 pH와 고온에서 비고정 효소보다 안정성이 증가한다 고 보고하였다. in vitro 소화 모델을 통하여 각 소화기관별 백미 발효 분말의 인체 내 소화모델을 확인 한 결과, 분무건 조 미세캡슐 분말은 위액에서 안정하게 통과하여 소장 및 대장에서 amylase 활성을 나타냄을 확인하였다. 즉, amylase함유 백미 발효 분말을 섭취한 다음 위장의 낮은 pH에서 효소활성을 잃지 않고 소장 및 대장에서 안정적으 로 흡수 가능한 분말 제조가 가능 할 것으로 사료되며, 본 연구에서 제조된 분무건조 미세캡슐 분말은 알긴산의 위장 관 체류시간 연장과 일정한 방출효과를 가지는 키토산에 의해 산성 조건에서의 효소활성을 보호하며 인체 내 이용률 향상을 통해 효소식품 및 서방성 약물 전달체로서의 응용연 구에 크게 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

Fig. 2. In vitro release profiles of the rice powders fermented with Bacillus subtilis CBD2: Dissolution behavior in the simulated pH 1.2, pH 6.8. and pH 7.4. FD, freeze-dried powder; SD-A, spray-dried powder with 1.0% alginic acid added; SD-ACh0.3, spray-dried powder with 1.0% alginic acid and 0.3% chitosan added; SD-ACh0.5, spray-dried powder with 1.0% alginic acid and 0.5% chitosan added; and SD-ACh1.0, spray-dried powder with 1.0% alginic acid and 1.0% chitosan added. The data are expressed as means±SD (n=3).

Download Original Figure