돌산갓의 부위별 sinigrin 함량

본 실험에 사용한 돌산갓(Dolsan leaf mustard, Brassica juncea)은 전남 여수시 돌산읍 소재 돌산갓 영농조합에서 2014년 3월 20일에 파종하여 5월 26일에 수확된 갓을 구입 하여 사용하였다. 돌산갓은 뿌리, 줄기, 잎 세 부분으로 나누 어 분쇄하여 사용하였다. 추출 및 분석을 위한 시약은 sinigrin(Sigma Chemical CO., St. Louis, MO, USA), acetonitrile(J.T. Baker, USA), ammonium chloride(SAMCHUN PURE CHEMICAL CO., LTD.), CH₃OH(J.T. Baker, USA), CH₂OH(DUKSAN PURE CHEMICAL CO., LTD.)을 사용 하였다.

돌산갓의 부위별 sinigrin 함량 측정을 위해 뿌리, 줄기, 잎을 원통여지에 각각 10 g씩 취하고 round flask에 50% acetonitrile(CH₃CN) 200 mL를 넣어 soxhlet extractor와 연결 하여 water bath 92°C, 24시간 추출하여 실온에서 냉각 후 사용하였다(15). 10% ammonium chloride(NH₄Cl), 60% CH₂OH, 70% CH₃OH (16)은 시료 부위별로 각각 10 g씩 취하여 용매 200 mL로 2~3분간 교반 후 Whatman No. 4(Whatman International Ltd., England)로 여과하였다. Fig 1

Fig. 1. Myrosinase-catalyzed hydrolysis of mustard glucosinolates sinigrin.

Download Original Figure

표준시약 sinigrin을 125, 250, 500, 1000 ppm의 농도로 제조하여 228 nm, 242 nm에서 3회 반복 측정하였으며 평균 값으로 standard curve을 Fig. 2에 나타냈다.

Fig. 2. Sinigr in standard curve with values measured at 228 nm (A) and 242 nm (B).

Download Original Figure

돌산갓 부위별 용매추출 후 syringe filter 0.45 μm(Toyo Roshi Kaisha, Ltd, Tokyo, Japan)로 여과한 여액을 vial에 담아 3회 반복 측정하여 분석하였다. Sinigrin과 그 유도물 질의 UV detector 파장은 228 nm와 242 nm에서 측정하였으 며 HPLC 분석 조건은 Table 1과 같다.

정량분석을 위한 표준시약으로 sinigrin을 이용하였으며 125, 250, 500, 1000 ppm의 농도로 제조하여 표준곡선을 작성하였다. HPLC chromatogram의 peak area와 관계는 228 nm과 242 nm에서 각각 r²=1.000, r²=0.999를 나타내었다. 각 파장별 standard curve의 regression equation을 이용하여 돌산갓의 수분함량을 제외한 실제 갓의 무게를 이용하여 정량화하였고 Fig. 3은 최적의 UV detector 파장을 선택하기 위해 228 nm 와 242 nm에서 sinigrin 함량을 측정한 결과이 다. Tsao(16)과 Rungapamestry(17)는 detector 228 nm에서 sinigrin을 측정하였고 allylisothiocyanate는 242 nm에서 측 정했을 때 감도가 높게 나타났다고 하였다. 본 연구에서도 sinigrin은 UV detector 파장을 비교하였을 때 242 nm보다 228 nm가 높게 나타났다. 또한 돌산갓 부위별 sinigrin 함량 은 줄기부위에서 728 ppm으로 가장 높게 나타났으며, 뿌리 와 잎에서는 각각 539 ppm, 345 ppm으로 나타났다. 이 결과 로부터 이후 실험에서는 UV detector 파장을 228 nm로 측정 하였다.

Fig. 3. Sinigr in contents of Dolsan leaf mustard by the HPLC UV detector wavelengths at 228 nm and 242 nm.

Download Original Figure

최적의 추출 용매를 선택하기 위해 돌산갓을 뿌리, 줄기, 잎으로 나누어 50% CH₃CN, 10% NH₄Cl, 60% CH₂OH, 70% CH₃OH 로 각각 추출하였고, 이때 sinigrin 함량은 Fig. 4와 같았다. 50% CH₃CN에서 돌산갓의 부위별 sinigrin 함량 이 다른 용매들보다 높게 나타났으며 10% NH₄Cl, 60% CH₂OH, 70% CH₃OH 은 큰 차이가 없음을 확인할 수 있었 다. Tao 등(15)의 보고에 의하면 갓의 종자에 함유된 glucosinolates 함량 조사에서 추출 용매로 water, 60% CH₂OH, 10% NH₄Cl을 사용했을 때 10% NH₄Cl, 60% CH₂OH, water 순으로 보고하였으나 본 연구에서는 차이가 나타나지 않았다. 또한 Tsao 등(16)의 sinigrin 추출법으로 50% CH₃CN을 이용하여 24시간 환류 추출한 시료가 가장 추출율이 높았다고 보고하여 본 연구와 비슷한 결과를 나타 내었다.

Fig. 4. Sinigirn contents of Dolsan leaf mustard extracted by different solvents.

Download Original Figure

Sinigrin 표준물질과 돌산갓 부위별 HPLC 분석결과를 Fig. 4에 나타내었다. 추출 용매는 50% CH₃CN를 사용하였 고, UV detector 파장은 228 nm에서 분석하여 retention time(RT)으로 비교하였다. 표준물질과 돌산갓의 부위별 추 출물의 RT는 sinigrin 2.054 min, 뿌리 2.032 min, 줄기 2.059 min, 잎 2.035 min으로 나타났다. 이 결과는 돌산갓 부위별 추출물의 RT와 표준물질의 RT가 거의 일치한다는 것을 보여주었다. 또한 돌산갓 잎의 경우 줄기와 뿌리에서 나타 나지 않은 다른 peak(RT 2.553 min)가 발견되었다. 돌산갓 줄기와 뿌리에서 나타나지 않은 이 peak는 glucoraphanin (RT 2.495 min)이라는 표준물질의 RT와 거의 일치하였다. 돌산 갓 잎에서 나타난 glucoraphanin으로 추정되는 이 물질은 주로 broccoli에 높은 농도로 함유된 항암성분으로 알려져 있다. Rangkadilok 등(18,19)은 cabbage, cauliflower, Brussels sprouts은 sinigrin의 농도가 높았고, broccoli에서 glucoraphanin의 농도가 높았다고 보고하였다. 지금까지 보 고된 결과에 의하면 Brassica species의 seed 중에서 Brassica juncea에서는 glucoraphanin이 검출되지 않았다. 그러나 본 연구의 결과로부터 seed와 식물에 함유된 생리활성 물질에 는 차이가 있음을 알 수 있었다. 특히 돌산갓에 대한 sinigrin 분석 자료가 거의 없어, 향후 십자화과 경엽채소류의 추가 적인 비교 분석 및 연구가 필요하다고 판단된다.Fig. 5

Fig. 5. HPLC chromatograms of different par ts of Dolsan leaf mustard extracted by 50% CH₃CN.

Download Original Figure