Lipopolysaccharide로 유도된 Raw 264.7 세포에서 마늘대 추출물(Allium sativum L. Stems)의 염증성 사이토카인 및 iNOS, COX-2 발현에 대한 효과 검증

본 실험에 사용한 마늘대는 국내산을 구입하여 재료로 사용하였다. 열수추출물(ASSW)의 용매는 시료 중량의 10 배 양을 가하여 85°C에서 4시간씩 3회 반복 추출하였고, 70% 에탄올 추출물(ASSE)은 시료 중량의 10배의 용매를 가하여 실온에서 24시간 침지하여 상등액과 침전물을 분리 하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다. 각 추출물들은 여과 및 농축 후 동결 건조하여 냉장실에 보관하면서 본 실험의 시료로 사용하였다.

총 페놀 화합물은 Folin-Denis 방법(16)으로 측정하였으 며, 시료를 10 mg/mL 농도로 증류수에 녹인 다음 0.2 mL Folin Ciocalteu reagent를 첨가하여 잘 혼합한 후 3분간 실온 에 방치하였다. 3분 후 Na₂CO₃ 포화용액 0.4 mL를 가하여 혼합하고 증류수를 첨가하여 4 mL로 만든 후 실온에서 1시간 방치하고, 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 총 폴리페놀 화합물은 tannic acid를 이용한 표준곡선으로 부터 양을 환산하였다.

전자공여능(EDA: electron donating abilities)은 DPPH를 ethanol에 녹여 용액을 준비하고, ASSW와 ASSE를 각각 5, 10, 50, 100, 500, 1000 μg/mL의 농도로 제조하여 각 농도 별 시료 120 μL에 DPPH 60 μL를 첨가한 후 96 well plate에 혼합하여 실온에서 빛을 차단하고 30분간 반응시킨 후 ELISA reader(Spectra max 190, Molecular devices, Sunnyvale, ,CA, USA)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하여 DPPH의 free radical 소거활성을 측정하였다. Positive control로는 L-ascorbic acid를 사용하였다.

7 mM ABTS 수용액과 2.45 mM potassium persulfate를 같은 양으로 혼합하고 암실에서 24시간동안 방치하여 반응 시킴으로써 ABTS⁺ 이온을 형성시킨다. 형성된 ABTS⁺ 이 온 용액을 용매로 희석시킨후 희석된 ABTS⁺ 용액 100 μL과 추출물 100 μL를 가하여 실온에서 7분간 반응시킨 다음 파장 734 nm에서 흡광도를 측정하여 radical 소거능(%)으 로 나타내었다. Positive control로는 L-ascorbic acid를 사용 하였다.

본 실험에 이용한 Raw 264.7 세포의 배양은 10% FBS과 1% penicillin/streptomycin(100 U/mL)을 첨가한 DMEM 배 지를 사용하였으며, 37°C, 5% CO₂incubator(VS-9160GC, Hanbaek Scientific Co., Daejeon, Korea)에 적응시켜 계대 배양하였다.

세포 독성 측정은 Carmichael(17)의 방법에 따라 측정하 였다. Raw 264.7 cells 은 96 well plate에 5×10⁴ cells/well이 되게 0.18 mL 분주하고, 시료를 농도 별로 조제하여 0.02 mL 첨가한 후 37°C, 5% CO₂incubator에서 24시간 배양하 였다. 마늘대 10, 25, 50, 100, 250, 400 μg/mL 농도별로 24 시간 동안 처리하였다. 여기에 2.5 mg/mL 농도로 제조한 MTT 용액 0.02 mL 첨가하여 4시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO 0.1 mL를 가하여 실온에서 30분 간 반응 시킨 뒤 ELISA reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성 측정은 시료용액의 첨가군와 무첨 가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

Nitric oxide(NO) 측정은 cell의 supernatant에서의 nitric oxide의 양을 nitrite and nitrate로서 측정을 하였다(18). Nitrite에 대한 nitrate로 환원된 후의 안전한 형태인 griess reagent(Sigma Chemical Co., Ltd., St. Louis, Missouri, USA) 를 사용하였으며, 6 well plate에 2 × 10⁶개의 cell을 confluence가 80%일 때, 1× PBS로 2번 washing한 후 무혈청 배지를 사용하여 12시간 이상 배양시킨 다음 LPS (lipopolysacchride) 10 μg/mL을 control 군을 뺀 모든 well에 다 넣어서 자극시켰다. 2시간 후에 시료를 농도별로 처리하 여 실험하였다. NO 생성량은 24시간 후에 supernatant를 모아 griess regent로 10분간 반응시킨 후에 540 nm에서 흡 광도로 측정하였다.

Raw 264.7 세포를 2×10⁵ cells/mL 로 조절한 후 6 well plate에 접종하고 24시간 동안 전 배양하였다. 세포에 1 μ g/mL의 LPS와 추출물을 동시에 처리하여 24시간 재 배양 하였다. 세포배양액 내의 IL-6, TNF-α, IL-1β, PGE2 cytokine의 분비량을 ELISA kit(Mouse ELISA set, R&D Systems, Minneapolis, MN 55413, USA)를 이용하여 측정하 였다.

세포를 1X PBS로 2회 세척 후 RIPA buffer 10 mL에 complate mini 1 tab를 가하여 70 μL로 용해해서 centrifuge (CVS-15000CFNII, Vision, Daejeon, Korea)를 이용하여 4°C 12,000 rpm에서 15분간 원심 분리 하였다. 원심 분리하여 얻은 상층액은 Bradford assay로 정량하여 20 μL의 단백질 을 10%의 SDS-PAGE에서 전기 영동하여 분리하였다. 분리 된 단백질은 power supply electrophoresis(Powerpac^TM HC, BIO RAD, California, USA)를 이용하여 PVDF membrane에 옮긴 다음 실온에서 30분 동안 blocking buffer(5% skim milk in TBST)에서 incubation 시켰다. 1차 항체(iNOS, COX-2)를 희석하여 2시간 동안 반응한 다음, 다시 10분 간격으로 TBST로 3회 washing 하고 membrane을 HRP가 중합된 각각의 2차 항체를 1:1,000로 희석하여 60분 동안 반응시켰다. 3회 washing 한 뒤 Western Imaging system (CAS-400SM, Davinch-K, Seoul, Korea) 기기를 이용하여 iNOS, COX-2 밴드 확인 및 정량을 실시하였다.

모든 실험은 3회 반복하여 측정하였고, 그 결과는 평균값 ±표준편차로 나타냈으며 통계적 분석은 SPSS 프로그램을 이용하여 각 처리구간의 유의성(**p<0.05,*p<0.01)검증을 위해 분산분석(analysis of variance, ANOVA) 후 Turkey test 로 다중비교를 실시하였다.

Phenol성 화합물은 phenolic hydroxyl기를 갖기 때문에 단백질 및 기타 거대 분자들과 쉽게 결합하여 항산화, 항암, 항염증 및 항알레르기 작용 등의 다양한 생리활성을 나타내 는 것으로 알려져 있다. 또한 이런 phenol성 화합물들은 염증 반응에 관여하는 enzyme activity뿐만 아니라 enzyme expression을 조절하여 항염증 활성을 나타낸다(19,20). 일 상적으로 섭취하고 있는 식용식물에서 천연 항산화제를 탐색하는 연구가 활발히 진행되고 있으며, 현재 알려진 천 연 항산화 영양성분으로는 β-carotene 비타민 E, 비타민 C 등의 비타민과 같은 미량무기질 및 페놀계 화합물들로 이들 의 항암효과 또한 항산화 능력에 기인한다고 보고되고 있다 (21,22). Tannic acid를 지표물질로 하여 작성한 표준곡선에 의해 마늘대의 폴리페놀 함량을 측정하여 Table 1와 같이 나타내었다. 마늘대 열수추출물(ASSW)은 37.08 mg/g, 70% 에탄올 추출물(ASSE)은 44.7 mg/g 으로 열수추출물보다 에탄올추출물에서 폴리페놀 함량이 더 높은 것으로 나타났 다. 약용식물 추출물의 폴리페놀 함량 분석(23)에서 나온 갈근(5.50 mg/g), 갈화(6.46 mg/g), 감국(2.48 mg/g) 등을 비 교하였을 때 ASSW, ASSE의 폴리페놀 함량이 매우 높은 것을 확인 할 수 있었다.

항산화 효과에 널리 사용되는 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)는 분자 중에 있는 여분의 전자를 공유함으로서 안 정한 자유라디칼의 성질을 가지고 있고, DPPH 용액이 다른 물질과 혼합되면 환원이 많이 될수록 보라색을 잃게되는 형상을 나타낸다(24). 517 nm의 흡광도에서 자유라디칼 소 거 활성능력을 통하여 남아있는DPPH의 비율로 항산화의 기능을 측정할 수 있다(25). 마늘대의 DPPH 라디칼 소거 활성능력을 측정한 결과 Fig. 1와 같이 나타내었다. ASSW, ASSE 모두에서 농도 의존적으로 증가하였으며 1,000 μ g/mL에서 ASSW의 경우 44%, ASSE의 경우 50.83%를 나타 냈다. 기능성 소재로 사용시 ASSW보다 ASSE에서 약간 더 높은 항산화 효과도 기대할 수 있을 것으로 보인다.

Fig. 1. Electron donating ability of Allium sativum L. Stems extracted with distilled water and 70% ethanol. ASSW, extracted with water; ASSE, extracted with 70% ethanol.

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ABTS[Diammonium 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline- 6-sulfonate)] 라디칼 이온은 추출물의 항산화 활성을 측정 하는데 사용되는 파장대를 이용하여 측정하는 실험중 하나 로 사용되어오고 있다(26-28). 마늘대 열수추출물 및 70% 에탄올 추출물의 ABTS⁺ 전자공여능은 Fig. 2와 같이 나타 내었다. 모든 추출물에서 농도 의존적으로 활성이 증가하 였으며 1,000 μg/mL에서 ASSW의 경우 96.85%, ASSE의 경우 97.79%를 나타내었다. 대조군인 Vitamin C의 경우 50 μg/mL의 농도에서 97.94%의 소거능을 나타내었으며, ASSW, ASSE가 1,000 μg/mL에서 Vit.C의 농도가 50 mg/mL 일 때의 소거능과 비슷한 항산화력을 나타낸다는 것을 확인 하였다.

Fig. 2. ABTS⁺ cation radical scavenging activity of extracted from Allium sativum L. ASSW, extracted with water; ASSE, extracted with 70% ethanol.

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MTT assay 시험법을 통해 macrophage cells 에 대한 마늘 대 추출물의 농도조건 별 세포독성을 확인하였다(Fig. 3). 마늘대 열수추출물과 에탄올추출물 모두 250 μg/mL 이상 시료농도 조건에서 세포독성을 나타내는 것을 확인하였으 며, 각 추출물의 항염증 효능에 대한 상대적 비교를 위하여 세포독성을 나타내지 않은 100 μg/mL 농도를 시험시료 농 도조건으로 설정하였다.

Fig. 3. Cell viability of ASSW, ASSE on Raw 264.7 cell. Raw 264.7 cells were treated with 5, 10, 25, 50, 100, 250, 400 μg/mL of ASSW, ASSE dissolved in media for 1 hr prior to the addition of LPS (1 μg/mL), and the cells were further incubated for 24 hr. Data represent the mean±SD with eight separate experiments.

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Inducible nitric oxide synthase(iNOS)에 의해 L-arginine으 로부터 생성되는 무기 유리체로 정상적인 상태 에서는 신경 전달, 혈관 확장, 면역 반응 등의 생리적인 기능을 조절하는 중요한 역할을 하지만(29,30), 염증 반응에서 과발현된 NO 는 혈관 투과성을 증가시켜 부종을 일으키고 염증을 심화시 켜 다양한 세포 및 조직손상을 일으켜 만성 염증 질환 및 자가면역질환 등을 초래하는 것으로 알려져 있다(31). LPS 로 유도된 Raw 264.7 Cells에 마늘대추출물 농도별(5, 10, 25, 50, 100 μg/mL)로 처리하여 상등액속에 있는 NO의 양을 측정하였고, 25 μg/mL부터 NO 생성량이 유의적으로 줄어 100 μg/mL에서 ASSW는 약 18% ASSE의 경우는 약 23%의 저해효과를 나타냈다. ASSW보다 ASSE에서 NO 생성 억제 효과가 조금더 우수함을 확인함으로써 ASSE에서 iNOS 효소억제능이 ASSW보다 높을 것으로 사료된다(Fig. 4).

Fig. 4. Inhibitory effects of ASSW, ASSE on the production of nitr ic oxide Raw 264.7 cells. Raw 264.7 cells were cultured with LPS (1 μg/mL) in the presence or absence of ASSW, ASSE for 24 hr to determine the level of NO. Nor : LPS not induced group, Con : LPS induced group. [A] ASSW : extracted with water. [B] ASSE : extracted with 70% ethanol. The data represent the mean±SD of three separate experiments (significant as compared to control. **p<0.05,*p<0.01).

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산화적 스트레스로 인하여 인체에 나타나는 피부 관련 질환의 대다수가 염증을 동반하는데, 이로 인해 노화가 촉 진되며, 피부 질환이 더욱 악화되고, IL-1β, TNF-α, IL-6와 같은 염증성 사이토카인이 생성된다(32,33). PGE2 또한 NO 와 마찬가지로 손상된 부위나 조직에서 통증과 발열의 전달 에 주로 관여하는 중요한 염증매개물질로서 COX-2에 의해 합성되는데 과량 생산되면 과도한 면역만응을 야기하여 다발성경화증, 파킨슨병, 알츠하이머병, 대장암과 같은 각 종 염증성 질환을 유발시키게 된다(34). IL-6는 대표적인 염증성 사이토카인으로서 다양한 요인에 의해 합성되어 분비되면서 급성 혹은 만성 염증질환의 발생 및 진행 과정 에서 중요한 역할을 하며(35,36), TNF-α는 염증 반응 초기 에 해당 부위로 호중구를 유도하며, 급성 염증 반응을 일으 키고 악화 시키는 인자이고(37), IL-1β는 대식세포를 활성 화시키고, 림프구 및 호중구의 내피세포 접착을 항진시키 며, 케모카인의 생성을 유도하여 염증 부위에 염증세포의 침윤을 상승시킨다(38). 본 연구에서 ASSW, ASSE는 염증 성 사이토카인 IL-1β, IL-6, TNF-α의 생성을 유의적으로 감소시켰으며, 각각 IL-1β는 100 μg/mL의 농도에서, IL-6는 100 μg/mL의 농도에서, TNF-α 는 100 μg/mL의 농도에서 유의한 감소를 나타냈다. PGE₂는 ASSW 100 μg/mL의 농도 구간에서 발현량이 현저하게 감소하였으며, ASSE는 농도 의존적으로 발현량이 감소되어 100 μg/mL에서 33.87%의 저해율을 나타내었다(Fig. 5). 결과적으로 ASSE가 ASSW 보다 염증 관련 사이토카인의 생성 억제가 높다는 것을 알 수 있었으며, 다른 염증 세포들의 이주를 비롯하여 활성 과 분화도 감소시킬 수 있음을 추정할 수 있었다.

Fig. 5. Effect of ASSW, ASSE on the production of cytokines stimulated by LPS. Production of [A] IL-6, [B] IL-1β, [C] TNF-α, [D] PGE₂ were measured in the medium of Raw 264.7 cells cultured with LPS (1 μg/mL) in the presence or absence of ASSW, ASSE for 24 hr. The amount of IL-6, IL-1β, TNF-α, PGE₂ was measured by immunoassay as described in materials and methods. Nor : LPS not induced group, Con : LPS induced group. (a) ASSW : extracted with water. (b) ASSE : extracted with 70% ethanol. Data represent the mean±SD with three separate experiments. (significant as compared to control. **p<0.05,*p<0.01).

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iNOS의 발현은 세포내 Ca²⁺ 농도와 관계없이 세균성 독 소 또는 염증 및 면역반응, 허혈, 조직손상, 산화성 스트레스 등에 따라 유리되는 여러 종류의 cytokine(IL-1β, TNF-α 등)에 의해서 유전자 전사단계에서 유도되며, 이에 따라 NO가 대량 생성 유리될 경우에는 질병의 병태생리에 중요 한 인자로 관여할 수 있다(39). COX-2는 염증 반응뿐만 아니라 혈액응고, 신장기능, 혈관조절 및 면역 반응 등에 관여하고, 염증성 cytokine이 분비되면 COX-2가 활성화 된 다(40). 또한 COX-2는 염증조직, 악성 종양조직에서 정상 세포에 비해 많은 양의 프로스타글란딘의 생성을 유도하여 혈관 생성을 촉진하고 세포의 증식을 도울 뿐 아니라 면역 능력을 억제함으로써 암세포 성장에 좋은 환경을 제공하여 COX-2의 발현은 또 다른 질병의 병원성과 직접적인 연관 성을 시사하고 있다(41). ASSW, ASSE의 iNOS, COX-2 protein 발현에 대한 효과를 알아보기 위해 western blot을 수행하였다. 그 결과, LPS 처리에 의해 증가된 열수 추출물 의 iNOS, COX-2 발현은 100 μg/mL의 농도구간 까지 일정 하게 나타냈으며(Fig. 6), 70% EtOH의 추출물에서 iNOS의 발현은 100 μg/mL 농도구간에서 현저하게 억제됨을 확인 하였고, COX-2의 발현은 농도 의존적으로 저하되어 특히 50 μg/mL, 100 μg/mL의 농도에서 현저하게 억제되는 것을 확인하였다(Fig. 7).

Fig. 6. Inhibitory effects of ASSW on the protein levels of iNOS and COX-2 Raw 264.7 cells. Raw 264.7 cells (5×10⁴ cells/well) were pre-incubated for 24 hr, and the cells were stimulated with lipopolysaccharide (1 μg/mL) in the presence of complex extracts sample (10, 25, 50, 100 μg/mL) for 24 hr. Nor : LPS not induced group, Con : LPS induced group. The data represent the mean±SD of three separate experiments (significant as compared to control. **p<0.05,*p<0.01).

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Fig. 7. Inhibitory effects of ASSE on the protein levels of iNOS and COX-2 Raw 264.7 cells. Raw 264.7 cells (5×10⁴ cells/well) were pre-incubated for 24 hr, and the cells were stimulated with lipopolysaccharide (1 μg/mL) in the presence of complex extracts sample (10, 25, 50, 100 μg/mL) for 24 hr. Nor : LPS not induced group, Con : LPS induced group. The data represent the mean±SD of three separate experiments (significant as compared to control. **p<0.05,*p<0.01).

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