LPS로 자극한 RAW264.7 대식세포에서 보리순 에탄올 추출물의 항염증 효과

본 실험에서 사용한 보리순은 전라남도 보성에서 구입하 여 4℃에서 저온 저장하여 이용하였다. 에탄올 추출물은 시료 중량의 10배의 70% 에탄올을 첨가하여 실온에서 24시 간 교반하여 추출하고 추출후 상층액과 침전물을 분리하였 다. 동일한 방법으로 3회 반복하여 추출하였다. 추출액은 여과지(Whatman No. 2, Sigma-Aldrich, MO, USA)를 이용 하여 여과한 후 감압농축기(N-100, EYELA, Tokyo, Japan) 로 농축하여 동결건조하였다. 그 후 냉동실에서 보관하면 서 실험에 사용하였다.

마우스 대식세포 RAW264.7는 10% heat-inactivated FBS(HyClone, PA, USA), 100 U/mL penicillin/streptomycin (HyClone, PA, USA)을 함유한 DMEM(HyClone, PA, USA) 배양액에서 37℃, 5% CO₂ 조건으로 배양기에서 배양하였 다.

보리순 에탄올 추출물의 대식세포에 대한 세포 독성은 Berridge 등(11)의 연구를 참고하여 CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation assay kit(promega, WI, USA) 를 사용하여 측정하였다. RAW264.7 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 96 well plate(Corning, NY, USA)에 5×10⁴ cells/mL의 세포를 100 mL 씩 분주하여 37℃ 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양한 후 보리순 에탄올 추출물을 농도별(0, 5, 10, 50, 100, 500, 1000 μg/mL)로 처리 한 후 24시간동안 배양하였다. 배양액을 제거 한 후 kit manual에 따라 실험을 진행하여 540 nm에서 흡광도를 측정 하였다.

염증성 사이토카인의 측정은 효소면역정량법(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 방법을 이용하였다 (12). 96-well plate에 RAW264.7 세포를 4×10⁵ cells/well로 현탁하고, 다양한 농도의 보리순 에탄올 추출물(50, 100 μg/mL)을 전처리 하고 2시간 뒤에 LPS(1 μg/mL)로 자극하 여 24시간 배양하였다. 배양이 끝난 세포들을 모아 원심분 리하여 상층액만을 수집하여 TNF-a, IL-1β, IL-6를 ELISA kit(R&D Systems, MN, USA)를 이용하여 측정하였다.

RAW264.7 세포를 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에 1×10⁵ cells/mL의 세포수로 96 well plate(Corning, NY, USA) 에 분주한 다음, 보리순 에탄올 추출물 50, 100 μg/mL으로 세포에 처리하여 2시간 동안 배양한 후 자극제 LPS(1 μ g/mL)를 처리하고 배양하였다. 24시간 후 세포배양 상등액 100 μL과 Griess 시약(1% sulfanilamide, 0.1% naphthylethylendiamine in 2.5% phosphoric acid) 100 μL를 혼합하여 96 well plate에서 10분간 반응시킨 다음, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

RAW264.7 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시 킨 후 6 well plate(Corning, NY, USA)에 4×10⁵ cells/mL의 세포수가 되도록 3 ml씩 분주하여 37℃ 5% CO₂ incubator에 서 24시간 배양하였다. 새로운 DMEM배지로 교환한 후 보리순 에탄올 추출물 50, 100 μg/mL으로 세포에 처리하여 2시간 동안 배양한 후 자극제 LPS를 처리하고 배양하였다. 24시간 후 단백질 발현을 측정하기 위하여 배지를 제거하 고 cold PBS로 세척한 후 cell lysates는 lysis buffer(10 mM pH 7.4 Tris-HCl, 5 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 1 mM EDTA abd 1 mM EGTA)를 첨가하여 단백질을 추출하였다. 단백 질을 정량하여, l0% SDS-PAGE에 전기영동 한 후, membrane으로 transfer하여 5% skim milk에 1시간동안 blocking하였다. COX-II, iNOS, MAPKs 및 phospho-IκBα의 단백질 발현은 ECL(Amersham, PA, USA)을 이용하여 확인 하였다(12).

NF-κB의 활성화 정도를 분석하기 위해 보리순 에탄올 추출물(50, 100 μg/mL)을 처리한 RAW264.7 세포로부터 핵단백질을 분리하였다. 보리순 추출물로 처리된 세포 (2×10⁶ cells/dish)를 PBS로 세척하여 회수하고, 180 μL의 hypotonic buffer(10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl₂, 0.02% NaN₃, 0.5 mM DTT, 1mM PMSF, pH 7.4)를 넣고, 20 μL의 5% nonidet NP-40을 첨가하여 5분 동안 반응 시켰다. 이후 원심분리(1,800×g, 4℃, 5분)한 후 상층액을 세포질 추출물로 이용하였다. 침전물은 hypotonic buffer로 한 번 세척하고, hypertonic buffer(20 mM 4-(2-hydroxyethyl)- 1-piperazineethanesulfonic acid, 25% glycerol, 420 mM NaCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.2 mM ethylenediaminetetraacetic acid, 0.02% NaN₃, 0.5 mM DTT, 1 mM PMSF, pH 7.4)를 넣고 1시간 동안 얼음 위에 방치시킨 다음 원심분리 (13,000×g, 4℃, 10분)하여 상층액을 회수하여 핵 단백질을 분리하여 실험에 이용하였다.

만성 접촉성 피부염 모델을 위해 oxazolone으로 감작시 킨 뒤 반복적으로 피부에 도포하여 접촉성 피부염을 유도한 뒤 병변 부위를 관찰함으로써 보리순 에탄올 추출물의 만성 접촉성 피부염 저해효과를 확인하였다(13). 실험은 hairless 마우스의 등 부위에 에탄올 100 μL의 5% oxazolone을 잘 도포하여 감작시켰다. 그리고 7일후 추출물을 잘 도포한 다음 30분 후에 다시 oxazolone을 5%로 조제하여 도포하여 접촉성 피부염을 유발시켰다. 2일 간격으로 9회 반복하여 피부염을 유발시키고 병변 부위를 관찰하였다(Fig. 1). 보리 순 추출물은 에탄올 200 μL에 100 μg/mL 농도로 도포하였 다. 음성대조군은 ethanol만을 도포하였고 양성대조군은 oxazolone에 보리순 추출물 대신 ethanol만을 도포하였다.

Fig. 1. Oxazolone challenges and topical administration of bar ley leaf ethanol extract. Mice were sensitized with oxazolone (5%, 100 μL) or EtOH (100 μL) to dorsal skin. After seven days, each mouse was sensitized with oxazolone to the same skin site. Hairless mice received nine epicutaneous applications of 5% oxazolone after treatment of 100 μg/mL barley leaf ethanol extracts on alternate days on the dorsal skin. Twenty-four hours after the last applications of 5% oxazolone, each mouse was observed.

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실험 결과의 통계처리는 SPSS 프로그램(10.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하였으며, 유의차 검증은 one-way ANOVA test를 이용하여 분석하였다.

대식세포는 염증 반응에 관여하는 주요한 세포로 알려져 있으며 여러 가지 자극원 또는 다른 세포들이 분비하는 사이토카인에 의해서 활성화되는데 이런 대식세포에 의해 서 부종, 열, 통증 등의 염증 반응이 유발되고 염증 부위로 다른 면역세포들을 이동시킨다(14). 그러므로 본 연구에서 는 염증 반응에 중요한 역할을 수행하는 대식세포에 대한 보리순 에탄올 추출물의 효과를 확인하기 위하여 먼저 대식 세포에 대한 세포 독성을 확인하였다. 보리순 에탄올 추출 물 5, 10, 50, 100, 500, 1000 μg/mL의 농도를 첨가하여 proliferation kit를 이용하여 세포 생존율을 측정하여 Fig. 2에 나타내었다. 실험 결과를 보면, 보리순 에탄올 추출물 1000 μg/mL에서 약간의 독성이 관찰되었으나 나머지 농도 에서는 세포 독성이나 성장 저해 효과는 보이지 않았다. 보리순 에탄올 추출물은 고농도를 제외하면 세포 독성을 보이지 않으므로 기능성 소재로서의 적용 가능성을 가질 것으로 보인다.

Fig. 2. Effect of bar ley leaf ethanol extract on cell viability of RAW264.7 cells. RAW264. cells pretreated with various concentrations of barley leaf ethanol extract for 24 h, cell viability analyzed by proliferation assay kit.

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염증의 초기 반응은 주로 COX-II와 iNOS와 이들에 의한 친염증성 매개물들에 의해 유도되며 여기에는 PGE2와 NO 등이 있다(15). COX-II는 PG를 통하여 상피 세포의 재생, 혈관 생성 등을 자극하며, 종양 형성에도 참여하는 것으로 보고되고 있다. 또한 류마티스 관절염 같은 만성 염증 질환 과 대장, 두경부, 폐, 방광, 전립선, 위 등 인체에 발생한 악성 종양에서 COX-II가 발현되어 여러 질병의 표적이 되 었으며, COX-II 억제제를 이용한 치료법 개발에 관한 연구 결과들이 보고되고 있다(16). NO 생성은 대부분 iNOS에 의한 생성이 많으며 생성된 NO는 박테리아를 제거하는 역할을 하지만 과도하게 생성될 경우 염증을 일으켜 조직 손상, 유전자 변이, 신경 손상을 유발한다. iNOS는 외부자 극에 반응하여 생체를 방어하려는 목적으로 단시간에 과량 의 NO를 생성하게 된다(17). 또한 iNOS는 LPS 등과 같은 활성물질을 처리했을 경우에도 증가된다고 알려져 있다. 따라서 iNOS의 발현양상에 대한 연구가 활발히 진행 중이 다(18). 그래서 본 연구에서는 LPS 유도된 RAW 264.7 대식 세포에 보리순 에탄올 추출물을 처리하여 염증성 매개물들 의 발현을 관찰하였다. 실험은 LPS자극과 보리순 에탄올 추출물을 처리한 후, 세포배양 상등액에서 NO 함량을 측정 하였고 세포질에서 단백질을 분리하여 western blot 방법을 이용하여 COX-II와 iNOS의 단백질 발현양을 측정하였다. 그 결과, LPS를 대식세포에 처리하므로써 NO 생성이 증가 하였고 COX-II와 iNOS의 단백질 발현이 현저히 증가되는 것을 확인하였다. 그리고 증가된 NO 함량과 단백질 발현이 보리순 에탄올 추출물을 처리했을 때 농도의존적으로 감소 되었다(Fig. 3).

Fig. 3. Inhibitory effect of barley leat ethanol extract on NO production or COX-II and iNOS expression in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. RAW264.7 cells were treated with barley leaf ethanol extracts as indicated dose, then stimulated with LPS (1 μg/mL) for 24 h. NO contents in supernatant was measured suing Griess reagent. Equal amounts of total protein were resolved by SDS-PAGE. Expressions of COX-II and iNOS protein were determined by immunoblot analysis using specific antibodies. The β-actin was used as a loading control.

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신체에 염증 반응이 개시되기 위해서는 많은 인자들이 관여하게 된다. 이때 다양한 염증 매개물이 관여하게 되는 데 그 중에서 염증성 사이토카인이 참여하게 된다. 이러한 세포 내 다양한 염증조절인자들은 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 등과 같은 proinflammatory cytokines, PG, 활성산소 등 다양 한 매개물질이 관여한다(19,20). 특히 대식세포에서 LPS와 같은 자극에 의하여 염증 반응에 관계된 전사 인자가 활성 화되고 그 결과로 iNOS, COX-II를 발현시켜 NO와 PGE2를 생성하여 염증을 일으킨다(21). 따라서 보리순 추출물이 염증성 사이토카인의 생성에 미치는 영향을 살펴보기 위하 여 RAW264.7 세포에 LPS를 처리한 후, 추출물을 농도별로 처리하여 ELISA 방법을 이용하여 측정하였다. 그 결과 모 든 사이토카인이 보리순 에탄올 추출물에 의하여 생성이 억제됨을 확인하였다(Fig. 4). TNF-α의 경우 보리순 추출물 50, 100 μg/mL에서 각각 81.8%, 84.9%의 억제율을 나타내 었고 농도간의 차이는 크게 나지 않았다. IL-β는 각 농도별 로 36%, 57%의 억제율로 농도의존적인 경향을 나타내었 다. IL-6는 각 농도별로 30.6%, 51.8%의 억제율로 농도의존 적인 경향을 나타내었다.

Fig. 4. Effect of barley leaf ethanol extract on LPS-induced cytokine production. RAW264.7 cells were treated with barley leaf ethanol extracts as indicated dose, then stimulated with LPS (1 μg/mL) for 24 h. The supernants were harvested and TNF-α, IL-1β and IL-6 levels were measured by ELISA as described in Method. The values are means ± S.D. of three independent experiments. CTL, control. 50, barley leaf ethanol extract 50 μg/mL. 100, barley leaf ethanol extract 100 μg/mL. ^*, p<0.05 vs (+); ^**, p<0.01 vs (+).

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MAPK는 염증성 사이토카인 발현에 중요한 조절인자로 서, ERK, JNK, p38 등의 신호전달경로를 가지고 있다. MAPK 분자의 의한 신호 전달 체계는 LPS와 같은 염증 유발 인자에 반응하여 세포를 활성화시켜 염증성 사이토카 인의 발현을 증가시킨다(20). 특히 대식세포에서 LPS는 표면의 toll like receptor 4(TLR4)를 자극하여 하부 세포신호 전달경로인 MAPK의 활성화를 유도하며 활성화된 신호전 달경로는 전염증성 사이토카인, NO, PG와 같은 여러 가지 염증성 매개인자들의 발현을 유도한다(22). 본 연구에서는 보리순 에탄올 추출물의 항염증 효과가 MAPK 분자 조절에 의한 것인지 조사하였다. RAW264.7 대식세포에 보리순 추출물을 처리한 후 LPS로 자극을 주고 세포질에서 단백질 을 분리하여 western blot 방법을 이용하여 각각 분자들의 인산화를 측정하였다. 그 결과 LPS에 의해 EKR, JNK, p38 의 인산화가 증가하였고 보리순 추출물에 의하여 농도의존 적으로 감소되는 것을 확인하였다(Fig. 5).

Fig. 5. Effect of bar ley leaf ethanol extract on MAPK activation in LPS-stimulated RAW264.7 cells. RAW264.7 cells were treated with barley leaf ethanol extracts as indicated dose, then stimulated with LPS (1 μg/mL) for 24 h. Total proteins were harvested after LPS stimulation. Equal amounts of total protein were resolved by SDS-PAGE. Phosphorylation of ERK, JNK and p38 protein were determined by immunoblot analysis using specific anti-p-ERK, anti-p-JNK and anti-p-p38 antibodies.

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염증성 사이토카인의 발현은 NF-κB 전사인자에 의해서 조절된다(23). NF-κB는 외부 자극에 의해 사이토카인, 케모 카인 등 다양한 매개체의 세포 내 합성을 조절하는 전사인 자이다. NF-κB는 세포질에서 IκB와 결합하여 불활성화 형 태로 존재하나, IκB가 LPS와 같은 자극원에 의해 인산화가 되면 IκB로부터 유리되어 핵으로 이동하여 iNOS, COX-II 및 염증 사이토카인과 같은 다양한 매개체의 합성을 유도하 게 된다(24). 따라서 LPS로 자극한 RAW264.7 세포를 세포 질과 핵을 분획하여 NF-κB 및 IκBα의 활성화에 대한 보리 순 에탄올 추출물의 억제 효과를 실험하였다. 실험 결과 LPS 자극에 의해 세포질의 p-IκBα의 양은 증가하였고 그와 는 반대로 IκBα 양은 감소하였다. 즉, 인산화에 의해 IκBα의 분해가 일어났음을 확인할 수 있었다. 그리고 보리순 에탄 올 추출물 의해 p-IκBα의 양이 감소되는 것으로 보아 IκBα 의 인산화가 억제됨을 확인하였다. IκBα의 분해가 일어나 게 되면 IκBα와 결합되어 있던 NF-κB가 유리되어 핵 내 이동이 증가하게 되어 염증 매개체들의 세포 내 합성을 증가시킨다. 이러한 NF-κB 활성은 보리순 에탄올 추출물이 IκBα의 인산화를 억제시킴으로서 IκBα와 결합되어 있는 NF-κB의 유리를 억제하여 염증 매개체들의 세포 내 합성을 억제시킨다고 할 수 있다.Fig .6

Fig. 6. Inhibitory effect of barley leaf ethanol extracts on the degradation of IκBα and NF-κB in LPS-stimulated RAW264.7 cells. RAW 264.7 cells pretreated with a various concentration of barley leaf ethanol extracts for 1 h and stimulated with 1 μg/ml of LPS. Nuclear and cytoplasmic proteins were isolated by lysis buffer and examined for IκBα, pIκBα and NF-κB with immunoblot analysis. Equal amount of nuclear and cytoplasmic proteins were analyzed by immunoblotting with anti-IκBα, anti-p-IκBα and anti-NF-κB p65 antibody. The β-actin was used as a loading control.

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아토피 피부염은 피부장벽기능 이상, Th2 사이토카인이 우세한 염증반응, 혈청 IgE의 증가를 보이고, 임상 및 면역 학적 소견이 만성 알레르기 접촉피부염과 유사하여 최근에 는 합텐으로 유도한 아토피 피부염 동물 모델을 사용하고 있다(13). Oxazolone 도포로 유도한 아토피 피부염 마우스 모델은 사람의 아토피 피부염과 매우 유사한 임상적, 장벽 학적 및 면역학적 특징을 나타내고 다른 아토피 피부염 모델보다 간단하게 만들 수 있는 모델이다(25). 본 연구에서 는 oxazolone으로 접촉피부염을 유발한 hairless 마우스 피 부에서 보리순 에탄올 추출물의 항염 효과를 확인하기 위하 여 등에 5% oxazolone 100 μL로 1회 감작시킨 후 7일 후에 5% 100 μL를 격일간 9회 도포하였다. 이때 보리순 추출물을 함께 도포하여 접촉성 피부염의 완화 효과를 확인하였다. 대조군으로 에탄올을 같은 방법으로 도포하였다. 마지막 도포 24시간 후 oxazolone 을 도포한 hairless mouse에서 인설, 홍반, 부종, 찰상 등의 습진 병변이 발생하였다. 그러 나 보리순 에탄올 추출물 100 μg/mL을 동시에 처리하였을 때 병변 부위가 유의적으로 완화된 것을 육안으로 관찰할 수 있었다. 즉 보리순 추출물이 접촉성 피부염의 완화 효과 가 있을 가능성을 제시하고 있다.Fig .7

Fig. 7. Effect of barley leaf ethanol extracts on the dorsal phenotypes. The hairless mice (n=6) were sensitized with 100 μl of 5% oxazolone in ethanol or vehicle (ethanol) applied to the dorsal skin and after 7 days, challenged with 100 μl of 5% oxazolone in ethanol every two days. Barley leaf ethanol extracts (100 μg/mL) were topical administered before oxazolone treatment. After 3 weeks, the difference in the skin irritation between oxazolone group and extracts-treated group was determined based on the change of dorsal pathological phenotype. Control, normal hairless mouse group; EtOH, ethanol-treated group; Oxazolone, oxazolone-treated group; Ox+EtOH, oxazolone-treated after EtOH group; Ox+100, oxazolone-treated with 100 μg/mL of barley leaf ethanol extracts group.

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