연속수증기증류추출법에 의한 오렌지와 자몽의 휘발성 유기화합물 확인

본 실험에 사용한 시료는 광주지역 농산물 시장에서 미국산 오렌지와 자몽을 구입하여 증류수로 세척한 후 과육과 과피로 분리한 다음 각각 진공으로 포장하여 -70℃의 deep freezer(MDF-U4086S, Sanyo, Tokyo, Japan)에 보관하여 시료로 사용하였다.

본 연구에 사용한 모든 시약은 Sigma(Milwaukee, WI, USA)사 에서 구입한 특급시약을 사용하였으며, 휘발성 유기성분의 추출을 위하여 diethyl ether, n-pentane 등의 유기용매를 Fisher Scientific(Waltham, MA, USA)에서 구입하여 이를 다시 Wire spiral packed double distilling appratus (Normschliff Geratebau, Germany)로 재증류하여 사용하였다. 물은 순수재증류장치(Millipore corporation, Bedford, MA, USA)를 이용하여 얻은 Milli Q water를 사용하였다. 무수 Na2SO4는 650℃ 회화로에서 하룻밤 태우고 desiccator에서 방냉한 후 유기용매의 탈수에 사용하였다.

오렌지 및 자몽의 과육(300 g)과 과피(40 g)를 ultra turrax로 분쇄하여 Milli Q water 500 mL를 혼합하여 1 N NaOH 용액으로 pH 7.0을 맞추었다. 1 M phosphate buffer(pH 7.0)를 이용하여 pH를 7.0으로 고정 한 후 Schultz 등의 방법(13)에 따라 개량된 연속수증기증류추출장치(Likens & Nickerson type simultaneous steam distillation and extraction, SDE, Normschliff, Germany)를 이용하여 n-pentane : diethyl ether 혼합용매(1:1, v/v) 100 mL로 상압하에서 3시간 동안 휘발성 화합물을 추출하였다. 정량분석을 위하여 n-butylbenzene 0.5 μL를 내부표준물질로 시료에 첨가하여 사용하였다. 추출 후 추출용매층에 무수 Na2SO4를 첨가한 후 냉암소에서 하루 동안 수분을 제거하였다. 휘발성 유기화합물의 유기용매 분획분은 Vigreux column(250 mL, Normschliff Geratebau, Wertheim, Germany)을 이용하여 3 mL로 농축하고 GC용 vial에 옮겨 담아 질소가스 기류하에서 0.5 mL까지 농축하여 GC-MS의 분석시료로 사용하였다.

SDE방법으로 추출하여 농축된 휘발성 유기화합물의 분석을 위해서 GC-MS는 QP 2010(Shimadzu, Kyoto, Japan) 기기를 이용하였다. 분리된 유기화합물의 이온화는 EI (electron impact ionization)방법으로 하였으며, GC-MS 기기분석조건으로 ionization voltage는 70 eV로 하였다. Injector와 detector의 온도는 각각 250℃와 300℃로 하였으며, 분석할 분자량의 범위는 40~350(m/z)으로 설정하였다. Column은 DB-5(60 m×0.25 mm i.d., 0.25 μm film thickness, J&W, Santa Clara, CA, USA)를 사용하였고, GC-MS 분석을 위한 온도 프로그램은 40℃에서 3분간 유지한 후, 150℃까지 2℃/min의 속도로 상승시켜 5분간 유지하고, 동일한 속도로 180℃까지 승온시켜 5분간 유지하였다. 다시 4℃/min의 속도로 200℃까지 상승시킨 후 10분간 유지한 다음 5℃/min의 속도로 230℃까지 상승시킨 후 10분간 유지하도록 설정하였다. Helium을 carrier gas로 사용하였으며 유속은 1.0 mL/min으로 유지하였다. 추출한 휘발성 유기화합물은 1 μL를 split ratio 1:30으로 주입하였다.

GC-MS에 의해 TIC(Total ionization chromatogram)에 분리된 각 peak의 성분 분석은 mass spectrum library(NIST 05, WILEY 7 과 FFNSC 2)와 mass spectral data book의 spectrum과의 일치(14)를 확인하였으며, 문헌상의 retention index(15) 및 표준물질의 분석 data를 비교 확인하였다. 동정된 휘발성 화합물의 상대적 정량을 위하여 내부표준물질로 첨가된 n-butyl benzene과 각 휘발성 화합물의 peak area% 비교하여 각 휘발성 화합물의 함유량을 계산하였다.

오렌지(C. sinensis)를 과육과 과피를 구분하여 SDE 방법으로 휘발성 향기성분을 추출한 후 GC-MS로 확인한 화합물들의 상대적 농도를 Table 1에 나타내었고, chromatogram은 Fig. 1에 도식하였다. 오렌지에서 확인된 휘발성 화합물은 과육에서 96종 과피는 109종으로 함량은 각각 120.55 mg/kg 및 4,510.81 mg/kg의 향기성분을 확인하였다. 오렌지 과육에서 확인된 휘발성 화합물의 관능기별로는 alcohol류가 21종으로 가장 많았으며, 그 다음으로는 aldehyde류 18종, ester류 19종, hydrocarbon류 19종, ketone류 10종, acid류 3종 및 oxide류 6종이 확인되었다. 관능기별 peak area는 hydrocarbon류가 66.03%으로 가장 높아 주요 휘발성 향기성분들로 확인되었으며, aldehyde류 8.15%, ester류 15.43%, alcohol류 4.59%, acid류 2.30%, ketone류 3.00% 및 oxide류 0.52% 순으로 나타났다.

오렌지 과피의 휘발성 화합물은 관능기별로는 alcohol류가 30종으로 가장 많았으며, 그 다음으로 hydrocarbon류 28종, aldehyde류 18종, ester류 18종, acid류 6종, ketone류 5종 및 oxide류 4종이 확인되었다. 관능기별 peak area는 hydrocarbon류가 89.06%으로 가장 높았으며, aldehyde류 3.93%, alcohol류가 3.93%, acid류 1.23%, oxide류 0.89%, ester류 0.69% 및 ketone류 0.30% 순으로 나타났다.

오렌지의 휘발성 향기성분 중 가장 높은 함량으로 확인된 화합물은 limonene으로 과육에서는 54.31%의 peak area을 보였으며, 함량은 65.32 mg/kg으로 동정되었다. 또한 과피에서 확인된 총 향기성분의 66.70%를 차지하였으며, 함량은 3,008.10 mg/kg이 함유되어 있었다.

Limonene은 monoterpene hydrocarbon류로 citrus속 과일의 중요한 향기성분으로 상쾌한 향이 특징이며, mandarin에 65~94% 함유되어 있고, sweet orange에 83~97% 함유되어 있다는 Jeong 등(16)의 연구결과와 다소 차이를 보였다. 오렌지 과육에 limonene 다음으로 많이 함유된 성분은 sesquiterpene hydrocarbon류인 valencene이 9.15 mg/kg으로 확인되었다. Valencene은 발렌시아 오렌지의 주요 향기성분으로 terpene cyclase enzyme(CVS)에 의해 Farnesyl pyrophosphate(FPP)로부터 생합성되며, 자몽의 맛과 향기에 영향을 주는 nootkatone의 전구체이다(17). 오렌지 과피에서 valencene은 35.18 mg/kg으로 과육보다 과피가 약 3.8배 이상 함량 차이가 나타났다.

오렌지의 휘발성 화합물 중 terpene류는 과육에서 50종, 함량은 85.82 mg/kg이 확인되었으며, 과피에서는 74종, 4,314.82 mg/kg가 함유됨을 확인하였다(Table 3). 과육과 과피 모두 monoterpene hydrocarbon류의 함량이 높았으며, 과육에서는 sesquiterpene hydrocarbon류, 과피에서는 oxygenated monoterpene류의 순서로 함량이 많았다(Fig. 2).

오렌지에서 확인된 monoterpene hydrocarbon류는 limonene, β-myrcene, α-pinene, α-terpinolene, δ-3-carene, camphene, carvomenthene, γ-terpinene 및 sabinene 등이 분석되었다. 오렌지 과육에서 과피보다 상대적으로 높은 비율로 확인된 휘발성 화합물은 camphene, carvomenthene, γ-terpinene로 나타났으며, β-myrcene(10.89%), δ-3-carene(3.88%), α-pinene(3.16%), sabinene(1.84%) 및 α-terpinolene(0.59%)는 오렌지 과피에서 높은 함량을 보였다. β-myrcene은 10 mg/kg 이하의 농도에서도 citrusy와 sweet-balsamic-herbac eous의 특징을 가지며, γ-terpinene은 오렌지 과피오일의 구성성분으로 약간 bitter-herbaceous 이지만 40 mg/kg 이하 농도에서는 pleasant와 citrusy한 특징이 있다고 보고되었다(18). Sesquiterpene hydrocarbon류는 valencene, 7-epi-α-selinene, selina-4,11-diene, α-bulnesene, α-humulene, α-copaene, (E)-caryophyllene, α-selinene 및 (Z)-caryophyllene 등이 확인되었다. α-selinene, (Z)-caryophyllene는 과육에서만 동정되었고, 과피에서만 확인된 성분은 β-elemene, β-copaene, aromadendrene, (E)-β-farnesene, γ-muurolene, germacrene D 및 (E,E)-α-farnesene이 동정되었다.

Oxygenated monoterpene류는 camphor, α-terpineol, linalool, (E)-carveol, (E)-β-terpineol, (E)-limonene oxide, (Z)-limonene oxide, carvone, limona ketone 및 perilla alcohol 등이 확인되었다. Camphor, limona ketone, (Z)-linalool oxide, (Z)-sabinene hydrate은 과육에서만 확인되었으며, citronellal, citronellol, geraniol, geranial, (E)-carvyl acetate, citronellyl acetate, (E)-sabinene hydrate, piperitone, isopiperitenone은 과피에서만 확인되었다. Citrusy note와 floral-woody한 특성을 가진 linalool은 오렌지의 여러 가지 휘발성 화합물과 조화를 이루어 오렌지의 맛에 긍정적인 효과를 기여한다고 알려져 있다(19). Oxygenated sesquiterpene 류는 nootkatone, valerianol, humulene epoxide II, caryophyllene oxide, α-sinensal, intermedeol, β-sinensal 및 (E,E)-farnesol 등이 확인되었는데, nootkatone은 자몽의 특징적인 휘발성 화합물로 astringent, pungent, aromatic, musty한 특성을 가지며, 오렌지 과육에서 0.68%, 과피에서 0.17%의 peak area를 나타내었다. Valerianol은 과육에만 함유되어 있었고 α-sinensal, T-cadinol, (E)-nerolidol, α-elemol, spathulenol, γ-eudesmol, T-muurolol 및 (E,E)-farnesol은 과피에서만 확인되었다. 오렌지 과피보다 과육에 더 많이 함유된 화합물은 ester류인 ethyl 3-hydroxyhexanoate, ethyl (E)-2-hexenoate, ethyl octanoate, ethyl decanoate, ethyl linolenate, ethyl linoleate, ethyl palmitate 및 ethyl oleate 등이 확인되었다.

Ethyl 3-hydroxy-hexanoate는 오렌지 주스의 주요 휘발성 화합물로 오렌지 제품에 바람직한 맛을 기여하며, 오렌지가 성숙 할 수록 증가하는데(20) 본 연구에서는 오렌지 과육에서만 1.10%(1.32 mg/kg)로 확인되었다.

오렌지(C. sinensis)와 동일한 방법으로 자몽(C. paradisi Macf.)의 휘발성 향기성분을 추출하여 GC-MS로 확인한 결과를 Table 1과 Fig. 1에 나타내었다. 자몽에서 확인된 휘발성 향기성분은 과육에서 총 85종으로 195.60 mg/kg이며, 과피는 124종으로 함량은 4,223.68 mg/kg으로 확인되었다.

자몽의 과육에서 확인된 휘발성 향기성분은 관능기별로 aldehyde류 18종으로 가장 많았으며, 그 다음으로는 alcohol류가 17종, hydrocarbon류 16종, ester류 13종, ketone류 10종, acid류 3종 및 oxide류 8종이 확인되었다. 관능기별 peak area는 hydrocarbon류 63.69%로 가장 높아 주요 휘발성 향기성분들로 확인되었으며, oxide류 11.30%, ester류 9.64%, aldehyde류 6.74%, alcohol류 5.12%, ketone류 2.77% 및 acid류 0.83% 순으로 나타났다.

Fig. 1. GC-MS chromatograms of the volatile flavor compounds in orange and grapefruit.

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자몽 과피의 휘발성 향기성분은 관능기별로 ester류가 28종으로 가장 많았으며, 그 다음으로는 hydrocarbon류 27종, alcohol류 26종, aldehyde류 22종, acid류 7종, ketone류 6종 및 oxide류 8종이 분석되었다. 관능기별 peak area는 hydrocarbon류가 74.46%으로 가장 높았으며, ester류 6.14%, aldehyde류 5.43%, alcohol류가 4.99%, oxide류 4.78%, ketone류 2.74% 및 acid류 1.49% 순으로 확인되었다

자몽의 휘발성 향기성분 중 가장 높은 함량으로 확인된 화합물은 limonene으로 과육에서는 53.74%의 peak area을 보였으며, 함량은 105.00 mg/kg으로 동정되었다. 또한 과피에서 확인된 총 향기성분의 44.29%를 차지하였으며, 1,870.24 mg/kg이 함유되어 있었다. 자몽 과육에 limonene 다음으로 많이 함유된 성분은 sesquiterpene hydrocarbon류인 (E)-caryophyllene(7.86%)이 15.36 mg/kg으로 확인되었고, 과피에서 (E)-caryophyllene(2.04%)은 85.98 mg/kg으로 과육보다 많은 함량이 확인되었다. Nootkatone은 자몽의 특징적인 향기 성분으로 자몽 과피의 오일 성분이고, 자몽 주스의 고유한 구성 요소로 보고된(21) 화합물로 자몽의 과육에서 0.58%(1.14 mg/kg), 과피에서 2.46%(103.94 mg/kg)로 확인되었다.

자몽의 휘발성 향기성분 중 terpene류는 과육에서 50종으로 전체 peak area의 80.37%(157.03 mg/kg)로 확인되었으며, 과피에서는 74종으로 전체 향기성분의 89.95%(3,798.11 mg/kg)를 차지하였다(Table 3). 과육과 과피 모두 monoterpene hydrocarbon류의 함량이 각각 105.90 및 2,882.66 mg/kg으로 가장 높았으며, 그 다음으로 oxygenated monoterpene류의 함량이 26.80 및 491.09 mg/kg으로 확인되었다(Fig. 2).

Fig. 2. Comparison of the relative concentrations of terpenoids in orange and grapefruit.

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자몽에서 확인된 monoterpene hydrocarbon류 중 과육에서는 limonene, β-myrcene, α-pinene, camphene, (E)-β-ocimene 및 sabinene 순으로 확인되었으며, 과피에서는 limonene, β-myrcene, β-pinene, α-pinene, (E)-β-ocimene, sabinene 및 γ-terpinene 순으로 나타났다. Sesquiterpene hydrocarbon류는 중 과육에서는 (E)-caryophyllene의 함량이 가장 높았으며, 다음으로 α-humulene, (Z)-caryophyllene, δ-cadinene, β-copaene, β-elemene, valencene 및 selina-4,11 -diene 등 순으로 확인되었다. 과피에서는 (E)-caryophy llene, δ-cadinene, β-cubebene, α-copaene, germacrene D, bicyclogermacrene, valencene 및 α-humulene 등 순으로 확인 되었다.

Oxygenated monoterpene류는 (Z)-Linalool oxide, (E)-Linalool oxide, linalool, geraniol, neryl acetate, perilla alcohol, α-terpineol, camphor 및 (E)-carveol 등이 확인되었다. Camphor, limona ketone, geranyl acetone은 과육에서만 확인되었으며, citronellal, citronellol, (Z)-carveol, (E)-carvyl acetate, (Z)-carvyl acetate은 과피에서만 존재하는 것으로 나타났다. Oxygenated sesquiterpene류 중 과육에서는 caryophyllene oxide(1.85%)의 함량이 가장 높았으며, 다음으로 nootkatone, humulene epoxide II, α-copaene, intermedeol, farnesyl acetone 및 (E)-nerolidol 등 순으로 확인되었다. 과피에서는 nootkatone, intermedeol, α-elemol, caryophyllene oxide, (E)-nerolidol, β-sinensal, (E,E)-farnesol 및 α-sinensal 등 순으로 함유되어 있었다. Shaw 등(22)은 신선한 자몽 주스의 향기성분으로 1-ρ-menthene-8-thiol을 보고하였고, Wilson 등(23)은 자몽과피 오일의 limonene 함량이 94~97%이며, myrcene은 1~2% 정도 함유되어 있다고 하였으나, 본 연구에서는 1-ρ-menthene-8-thiol은 동정되지 않았고, limonene의 상대적 비율은 44.29%로 낮았으며, myrcene은 14.62%로 높게 확인되었다.

오렌지와 자몽의 휘발성 향기성분을 과육과 과피로 분리하여 휘발성 성분을 분석한 결과 작용기별 area%를 비교하였을때 오렌지 과육보다 자몽과육에 많은 함량을 나타낸 것은 alcohol류, oxide류 이었으며, aldehyde류, ester류, hydrocarbon류, ketone류 및 acid류는 오렌지 과육이 자몽 과육보다 높은 함량을 보였다. 오렌지 과피에서 자몽 과피보다 높은 함량을 보인 화합물은 hydrocarbon류로 확인되었으며, aldehyde류, alcohol류, ester류, ketone류, oxide류 및 acid류는 자몽 과피에서 오렌지 과피보다 더 높게 확인되었다(Table 2). Aldehyde류 중 octanal과 decanal의 상대적 비율은 0.2~2.2%로 오렌지의 주요 향기성분으로 보고되었으나, Alexander 등(24)의 연구에서는 오히려 nonanal의 함량이 2.4%로 더 많이 확인되어 본 연구와 일치한 결과로서 nonanal의 함량이 octanal과 decanal 보다 더 높게 동정되었다.

Terpenoid 화합물의 함량은 오렌지의 과육보다 자몽과육에서 더 높게 확인되었으며, 과피에서는 자몽의 과피보다 오렌지 과피의 함량이 높았다(Table 3). Monoterpene hydrocarbon류인 limonene의 함량이 오렌지 과육은 65.32 mg/kg이며, 자몽 과육은 105.00 mg/kg으로 많은 차이를 나타내었다. 또한 α-pinene, camphene, sabinene, β-myrcene의 함량은 오렌지 과육이 자몽 과육보다 높았다. Carvomenthene은 오렌지 과육에서만, α-terpinolene 오렌지 과육과 과피에서 확인되었으나 자몽에서는 확인되지 않았다. β-Pinene은 자몽 과피에서만 확인된 화합물이며, α-thujene 및 1,3,8-ρ-menthatriene은 오렌지와 자몽의 과피에만 함유되어 있었다. Sabinene은 오렌지 과피가 자몽과피 보다 높은 함량을 보였고, (E)-β-ocimene은 자몽 과피가 오렌지 과피보다 20배 이상 더 많이 함유됨을 확인하였다.

Oxygenated monoterpene류 중 borneol, nerol, citronellyl acetate, piperitone, isopiperitenone 및 (Z)-sabinene hydrate는 오렌지에서만 확인된 성분으로 (Z)-sabinene hydrate는 과육에서, piperitone 및 isopiperitenone은 과피에서 확인되었다. (Z)-Linalool oxide와 (E)-linalool oxide는 자몽에서는 다량 확인되었으나 오렌지에서는 매우 적은양이 함유되어 있었다. Limona ketone 및 camphor는 과육에서만 확인된 성분이며, citronellol, citronellal 및 (E)-carvyl acetate는 과피에만 함유되어 있었다. Oxygenated sesquiterpene류 중 α-elemol γ-eudesmol, T-muurolol, T-cadinol, (E,E)-farnesol 및 α-sinensal은 과피에서만 확인되었다. Intermedeol, nootkatone, caryophyllene oxide 및 humulene epoxide II는 오렌지보다 자몽에 더 많이 함유되어 있는 성분들이다. Sesquiterpene hydrocarbon류 중 (E)-caryophyllene의 함량은 자몽에 다량 함유되어 있는데, 특히 과육의 area% 비율이 높았다. α-Humulene, germacrene D, δ-cadinene등은 자몽에서 높은 함량을 나타내었으며, valencene은 오렌지에 다량 확인되었고, β-copaene, aromadendrene, α-selinene 및 (E,E)-α-farnesene은 오렌지에서만 확인된 성분이다. Sesquiterpene hydrocarbon류, oxygenated monoterpene류, sesquiterpene hydrocarbon류의 함량은 자몽이 오렌지보다 높았다. Ester류인 phenylacetaldehyde 및 ethyl acetate는 과육에 다량 함유되고, limonene, β-myrcene, α-pinene, sabinene은 오렌지 및 자몽의 과피에 다량 함유되었음을 알 수 있었다.

결과적으로 오렌지와 자몽의 주요 휘발성 향기성분은 monoterpene hydrocarbon류인 limonene, terpinene, terpinolene 및 pinene 등 휘발성 화합물로서 방향성이 우수한 것으로 나타났으며, cadinene 및 germacrene D 등의 sesquiterpene은 방향성이 낮은 것으로 보고되고 있다(25).