저온 적응성 효모와 발효온도에 따른 약주의 품질특성 변화

본 실험에서 사용한 효모는 전국에서 수집한 메주, 누룩 등의 발효식품에서 분리한 균주들 중에서 저온적응성이 우수한 Saccharomyces cerevisiae Y297 균주를 사용하였다(14). 비교균주로 시판효모인 Fermivin(S. cerevisiae, Oenobrands SAS, Narbonne, France)를 사용하였다. 실험에 사용된 효모는 yeast extract 1%, peptone 2%, dextrose 2%(YPD, BD, Franklin Lakes, NJ, USA) 액체배지에 배양 후, glycerol를 20% 첨가하여 -80℃에서 보관하여 실험에 사용하였다. 멥쌀은 2014년 9월 경기도 철원에서 재배된 것을 시중에서 구입하여 사용하였다.

멥쌀 1 kg을 수세하여 2시간 물에 침지한 후 1시간 물 빼기 후 1시간동안 증자하고 냉각한 후 입국과 물 1.5 L 그리고 대조구와 선발효모를 증자한 쌀에 접종 후 각 온도별(15℃, 20℃, 25℃)로 20일 발효하였다. 제조된 밑술은 원심분리 후 분석용 시료로 사용하였다.

pH는 술덧 여액 10 mL를 취하여 pH meter(Orion star A211, Thermo, Walrham, MA, USA)로 측정하였다. 총산 함량은 상등액 10 mL를 페놀프탈레인 지시약 2~3방울을 넣은 후, 0.1 N NaOH 용액으로 적정한 후 초산으로 환산하였다.

에탄올 함량은 시료 100 mL를 증류한 후, 주정계를 이용하여 측정하였다(14). 아미노산도는 시료 10 mL에 페놀프탈레인 지시약 2~3방울을 가하고 0.1 N NaOH 용액으로 중화한 후 중성포르말린 용액 5 mL를 넣은 후 0.1 N NaOH 용액으로 담홍색이 될 때까지 적정하여 측정하였다(15).

효모는 YPD 액체배지에서 온도(15℃, 25℃)에 따라 2일간 배양하여 원심분리 후 회수한 균체를 Yeast protein extraction buffer kit(GE healthcare, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질은 2-D Quant kit(GE healthcare, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 단백질을 정량한 후 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)로 단백질을 분리하였다. SDS- PAGE 겔은 Electric transfer kit(Mini Trans-Blot Elec- trophoretic Transfer Cell, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 100 V에서 50분 동안 사용하여 polyvinylidene Difluoride (PVDF) membrane(Millipore, Billerica, MA, USA)로 단백질을 옮겼다. 그 후 Blocking Solution(ATTO corporation, Tokyo, Japan)에 1시간 반응 후 1차 항체로 Anti-HSP104 ab69549(Abcam, Cambridge, UK)를 이용하여 1:5,000배로 희석하여 4℃에서 8시간동안 반응하였다. 2차 항체는 Goat Anti- rabbit lgG horseradish peroxidase ab6721(Abcam, Cambridge, UK)로 1:10,000배로 희석하여 125도에서 1시간 반응한 후 Amersham imager 600(GE healthcare, St. Louis, MO, USA)을 사용하여 밴드를 확인하였다.

샘플은 약주를 원심 분리한 상등액 5 mL을 Sep-pak C₁₈ cartridge에 통과시킨 후 0.2 μm 실린지 필터로 여과하여 HPLC(Chromaster 5000, Hitachi, Ltd., Tokyo, Japan)로 ODS-100W(4.6 mm×250 mm) column을 사용하여 유기산을 측정하였다. 유리아미노산은 충남대 공동실험실습관에 의뢰하여 amino acid analyzer(L-8900, Hitachi Co., Tokyo, Japan)로 분석하였다(16). 향기분석은 0.2 μm 실린지 필터로 여과된 샘플을 한국기초과학지원연구원 서울서부센터의 GC Chromatograph/Mass Spectrometer(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. 샘플은 Solid-phase microextraction (SPME) 방식으로 추출하여 분석하였다(17).

실험결과의 통계처리는 3회 반복하여 평균(mean)과 표준편차(SD)로 표시하였고 SPSS Statistic 24 통계프로그램을 이용하여 일원배치 분산분석을 사용하여 p<0.05 수준에서 Duncan’s multiple range test(DMRT)로 평균 간 다중비교를 하였다.

발효식품에서 분리한 효모들을 저온(15℃)에서 배양하여 저온적응성, 내성(알코올, 당, 염)등이 확인된 균주들을 동정하였고 향기관련 효소활성을 사전 연구(13)를 통해 확인하였다. S. cerevisiae Y297의 저온적응성 특징을 확인하기 위해 온도관련 단백질인 HSP104의 발현 정도를 확인하였다. 실험균주로는 S. cerevisiae Y297와 대조구를 사용하였고 온도는 15℃와 25℃에서 2일간 배양한 후 단백질을 추출하여 5 ug의 단백질 샘플을 SDS- PAGE와 Western blot을 실시하였다(Fig. 1.) 그 결과, 15℃에서의 S. cerevisiae Y297은 대조구에 비해 70%이상 높은 HSP104 단백질 발현을 보였고 25℃에서의 S. cerevisiae Y297은 대조구에 비해 15%이상 높은 발현 밴드를 확인할 수 있었다. Chiba 등(6)의 연구에서 CSF1, HSP12, HSP26, HSP104, LOT2, LTE1, NRS1, TCP1, TIP 및 TIR2 유전자들에 대한 저온에서의 RNA 발현정도를 확인한 결과, CSF1, HSP104, TIR2 유전자들이 저온 발효 시 발현정도가 증가하는 것으로 보고되고 있다. 또한 저온에서는 과오폴딩단백질(misfolded protein)이나 응집 등을 유발한다고 보고되고 있는데 HSP104 단백질은 이러한 스트레스를 감소시켜 저온에서 균 성장에 있어서 유용한 유전자로 보고되고 있다(18,19).

Fig. 1. Low temperature-induced HSP104 expression in Saccharomyces cerevisiae strain Y297 in YPD medium. Primary antibody (HSP104) was tested for its ability to detect horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody in cultured S. cerevisiae strain Y297.

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멥쌀과 입국 그리고 효모(대조구, S. cerevisiae Y297)를 혼합하여 온도별(15℃, 20℃, 25℃)로 발효하여 성분을 분석하였다(Table 1). pH의 경우, 대조구는 온도가 높아질수록 pH가 낮아졌지만 S. cerevisiae Y297 처리구의 경우 큰 차이를 보이지 않았다. 총산도 역시, 대조구는 온도가 높아질수록 산도가 높아졌지만 S. cerevisiae Y297 처리구의 경우 큰 차이를 보이지 않았다. Jin 등(20)과 Baek 등(21)의 연구에 의하면 발효 온도가 올라갈수록 산의 생성도 많아진다고 보고되고 있다. 대조구의 경우 비슷한 양상을 보이지만 S. cerevisiae Y297 처리구는 통계적인 차이가 거의 없이 비슷한 수치를 보였다. 아미노산도의 경우 S. cerevisiae Y297 처리구의 20℃에서 가장 높은 아미노산도를 보였다. 알코올 함량은 전처리구에서 유의적인 차이를 보이지는 않았으나 S. cerevisiae Y297로 20℃ 처리구에서 가장 높은 알코올 함량(17.9%)을 나타내었다. Control 효모와 Y297 효모는 15℃, 25℃ 온도 조건에 알코올 함량이 각각 16%, 15% 내외로 나타났으며, 20℃ 온도에서 알코올 함량이 3% 정도 차이가 발생하였다. 다양한 효모를 25℃에서 막걸리 발효한 후의 알코올 함량은 10.0~14.8% 이며 이는 효모의 특성으로 보고되었다(22).

온도별 유기산 측정 결과(Table 2)는 oxalic acid, lactic acid, acetic acid, succinic acid의 총 4종류의 유기산이 검출되었다. Lactic acid는 대조구의 15℃에서 1.23±0.01 mg/L이고 20℃와 25℃에서는 각각 2.77±0.01 mg/L과 3.78±1.13 mg/L으로 유의적인 차이는 보이지 않았으나 온도에 따라 증가하는 경향을 보였다. S.cerevisiae Y297 처리구에서는 모든 온도에서 유의적인 차이가 보이지 않았다. Baek 등(21)의 실험에서 20℃와 30℃에서 발효한 술덧의 lactic acid 양을 확인한 결과 20℃에서 보다 많은 양이 검출되었는데 이는 온도 조건에 영향을 받은 것으로 보고되고 있다. 본 실험에서는 비슷한 결과를 보인 대조구와 달리 S. cerevisiae Y297 처리구는 모든 온도에서 lactic acid의 양이 큰 차이를 보이지 않았다(Table 2). 또한, 대조구의 succinic acid는 lactic acid와 비슷한 경향을 보였지만 S. cerevisiae Y297 처리구는 온도에 따라 검출량이 증가하는 경향을 보였다. 약주에서 검출되는 lactic acid는 막걸리의 주요 유기산이며 향미에 좋은 않는 영향을 주는 것으로 보고되었다(23). Bang 등(24)은 효모종류에 따른 막걸리의 유기산 특성에서 사용한 Fermivin 효모는 522.4 mg/L로 보고하였다. 본 연구에서는 lactic acid 함량이 다소 낮았지만 20℃, 25℃에서 대조군보다 Y297 효모의 함량이 약 3배 정도 낮게 검출되어 약주의 향미가 대조군보다 좋을 것으로 판단된다. Acetic acid는 lactic acid와 같이 막걸리 향미에 좋지 않는 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며(23), 막걸리의 주요 유기산 중 하나이다. 대조군은 15℃에서 acetic acid 함량이 가장 낮았으며, Y297은 20℃, 25℃에서 함량이 낮았다. 쌀 막걸리의 주된 유기산 중 하나인 succinic acid은 Lee 등(25)이 보고한 연구에서 막걸리 발효 과정 중 주요한 유기산으로 확인되었다. 위 유기산 함량을 종합하였을 때 acetic acid, lactic acid 함량은 낮고 succinic acid 함량은 높은 Y297로 20℃ 발효한 것으로 판단된다.

발효온도에 따른 유리아미노산의 생성정도를 분석한 결과(Table 3), 대조구의 경우는 온도에 따른 유리아미노산의 생산량이 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다. S. cerevisiae Y297 처리구에서는 20℃에서 발효된 조건에서 1,040.48±64.20 mg/L로 가장 높은 유리아미노산을 생산하는 것으로 나타났다. Baek 등(21)과 Woo 등(26)의 실험에서는 온도가 높아지면서 유리아미노산의 함량도 높아지는 것으로 나타났지만 S. cerevisiae Y297 처리구에서는 20℃ 조건에서 가장 높은 유리아미노산 농도를 보였다. 이러한 결과는 품질분석과 유기산 및 유리아미노산의 전반적인 결과에서도 S.cerevisiae Y297 처리구의 15℃ 및 20℃에서도 비슷한 결과를 확인할 수 있었다. 이러한 결과들을 통해 대조구에 비해 Y297 처리구는 15℃와 20℃에서 발효 과정 중 품질 특성에서 큰 영향을 주지 않는 것으로 확인되었다. 이는 Y297균주가 저온 발효를 통해 술의 품질과 향에 영향을 주는 성분들의 손실을 낮추면서 발효 효율을 유지할 수 있는 저온적응성 균주를 확보하려는 목적에 부합하는 균주임을 확인할 수 있었다.

Kang 등(27)은 쌀 및 쌀 전분을 활용한 약주의 품질특성 연구에서 쌀약주의 유리아미노산이 498.38~5,976.93 ppm 검출된다고 보고하였다. 주류에 아미노산이 적으면 맛이 가볍고, 많으면 잡미가 증가하여 품질을 저하시키기 때문에 적정한 함량을 유지하는 것이 중요하나 최적 함량에 대해서는 아직 밝혀진 바는 없다. 아미노산은 발효과정 중 효모의 대사에 의하여 고급알코올(fusel oil)로 변환되어 주류의 향기를 부여하기도 하며, 아미노산 산화효소 및 아미노산 탈수효소에 의하여 oxalic acid로 변하여 맛의 변화를 주기도 한다(28).

사전연구를 통해 향기성분에 대한 정성분석결과 처리구당 50종 내외의 향기관련 물질들이 검출되었다. 본 실험에서는 이 성분들 중 대표적인 6개의 향기성분[ethyl acetate, 1-propanol, 1-butanol(3-methyl-, acetate), 1-propanol(3-methyl-), acetic acid, phenylethyl alcohol]에 대해 온도별로 향기성분을 측정한 결과(Table 4)이다. S. cerevisiae Y297 처리구에서는 약주의 주요 향기성분 중 하나로 과일향이 난다고 알려져 있는 ethyl acetate이 41.46±0.54 mg/L로 가장 높은 수치를 보였고 Higher alcohol 중의 하나이며 감미성의 바나나향을 갖고 있는 1-butanol(3-methyl-)와 phenylethylalanine으로 부터 유래한 성분으로 와인, 위스키등의 다양한 주류에서 중요한 방향족 알코올 성분으로 알려진 phenylethyl Alcohol은 각각 41.96±0.29 mg/L과 13.88±3.28 mg/L의 수치를 보였다. 안 등(29)의 실험에서 막걸리는 1-butanol (3-methyl-)과 phenylethyl Alcohol이 각각 3.28 mg/L와 225.68 mg/L로 검출된다고 보고하였다.