상황버섯균 접종 황기의 배양 중 이화학적 성분변화

본 실험에 사용된 균주는 국립원예특작과학원 버섯과에서 분양받은 상황버섯(Phellinus linteus)균주를 분양받아 본 연구실에서 계대배양하면서 사용하였으며, 상황버섯균 배양용 약재 황기(Astragali memvranaceus)는 충북 제천산 3년근으로(Hanbangchon, Yeongcheon, Korea)에서 구입하여 사용하였다.

균의 고체배양용 MYG배지(malt extract 1.0%, yeast extract 0.4%, glucose 0.4%, agar 2%)를 제조하여 사용시 25℃에서 15일간 평판 배양한 다음 접종원으로 사용하였다.

황기 2 kg을 톱밥형태로 분쇄한 뒤 황기 및 미강을 4:1 비율로 미강 0.5 kg 첨가하고, 2 L증류수를 가해 혼합한 후 각 300 g씩 톱밥종균 배양병에 병입 하고, autoclave (Vision Scientific, Co., Ltd., Daejeon, Korea)에서 120℃, 40분 멸균시킨 다음, 각 배양병에 상황버섯균주를 접종하여 25℃ 온도의 incubater(VS-1203PFHLN, Vision Scientific, Co., Ltd., Daejeon, Korea)에서 30일간 배양하며 발효시켰다. 상황버섯균 배양 황기는 -80℃ 초저온냉동기(deep freezer, Ilsin BioBase Co., Ltd., Dongducheon, Korea)에서 24시간 동결시킨 후 동결건조기(freeze dryer, Ilsin BioBase Co., Ltd., Dongducheon, Korea)에서 72시간 동결 건조시킨 것을 마쇄하여 시료로 사용하였다.

상황버섯균 배양 황기의 수분 함량은 적외선 수분 측정기(MS-70, AND Co., Japan)를 이용하여 측정하였으며, pH는 시료 2 g을 칭량하여 8 mL의 증류수를 가하여 균질화한 후 3,000 rpm에서 15분간 원심분리한 후 상등액을 취하여 pH meter(HM-30P, DKK-TOA, Japan)로 측정하였다. 총 산도는 pH측정의 시료와 동일한 시료를 3,000 rpm에서 15분간 원심분리한 후 시료액 0.1 mL에 0.9 mL의 증류수를 가하여 10 mL로 정용한 후, 지시약 0.05% phenolphthalein을 사용하여 0.1 N NaOH로 pH 8.3에 도달 할 때까지 적정하였으며, 적정에 소비된 NaOH 소비량을 이용하여 acetic aicd 함량(%)으로 환산하여 총산 함량을 표시하였다. 실험은 3회 반복하였으며 결과는 평균값±표준편차로 나타내었다.

환원당은 dinitrosalicylic acid(DNS)법(16)에 따라 시료 1 mL에 DNS reagent 1 mL을 가하여 15분간 끓인 다음, 냉각한 후 증류수 3 mL을 첨가하여 UV-visible spectrophoto meter를 이용하여 546 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 이때 당의 정량은 glucose를 표준물질로 사용하여 표준곡선으로부터 환산하여 함량을 산출 하였다.

추출물 제조는 상황버섯균 접종 황기를 동결건조 한 것을 사용하여 80% 에탄올 추출물 및 열수추출물을 제조하였다. 80% 에탄올 추출물의 제조는 다음과 같다. 각 배양물 5 g에 80% 에탄올 수용액 100 mL씩 가하여 ultrasonicator (Power Sonic 420, 50/60 HZ, 700W, Hwashin Co., Seoul, Korea)로 1시간 씩 2회 sonication하여 추출한 후 Whatman No. 2 여과지를 이용하여 여과시킨 후, rotary vacuum evaporater(BUCHI, USA)를 이용하여 50℃ 이하에서 감압·농축하였고, 이를 같은 추출용매로 용해하여 본 실험의 분석용 시료로 사용하였다. 열수추출물의 제조는 다음과 같다. 각 배양물 5 g에 끓인 증류수 100 mL을 혼합 후 ultrasonication(Power Sonic 420, 50/60 HZ, 700W, Hwashin Co., Seoul, Korea)으로 1시간 씩 2회 sonication하여 추출한 후 Whatman No. 2 여과지를 이용하여 여과시킨 후, rotary vacuum evaporater를 이용하여 50℃ 이하에서 감압·농축한 뒤, 이를 같은 추출용매로 용해하여 본 실험의 분석용 시료로 사용하였다. 추출수율은 각각의 추출물을 동결 건조시켜서 건조중량을 구한다음 추출물 조제에 사용한 원료 물량에 대한 백분율로 나타내었다.

유리당 분석은 HPLC(Waters 2695, waters Co., Miliford, MA, USA)를 이용하여 분석하였다. 상황버섯균 배양 황기 추출물을 희석하여 0.45 μm PVDF membrane filter를 여과한 것을 시험용액으로 하였고, column은 YMC-PACK Polyamine Ⅱ(5 μm, 4.6 ×250 mm, YMC Co.)을 사용하였으며, mobile phase는 acetonitrile:water 혼합액(75:25, v/v), flow rate는 1.0 mL/min, detector는 RI(Waters 2414, Waters Co.)를 사용하여 분석하였다.

유리아미노산은 80% 에탄올 추출물에 5% TCA 용액을 5배 넣은 후 원심분리(12,000 rpm, 15분)한 다음 상등액을 취하여 n-hexane 혼합하여 비극성 물질을 처리한 후 0.25 μm syringe filter에 통과시킨 후 아미노산 분석기(Hitachi L-8900, Hitachi High Technologies America, Inc., USA)로 분석하였다. 이때 column은 hitachi 4.6×60 mm(seperation), hitachi 4.6×40 mm(ammonia filtering)을 사용하였으며, column 온도는 50℃, mobile phase는 buffer set(PH-SET KANTO), flow rate (mL/min)는 buffer 0.4, ninhydrin 0.35, injection volume은 20 μL였다.

상황버섯균 배양 황기의 80% 에탄올 및 열수 추출물 성분 함량분석은 HPLC(Waters 2695, Waters Co., Miliford, MA, USA)를 이용하여 분석하였다. 각 추출물을 0.45 μm PVDF membrane filter 여과한 것을 시험용액으로 하였고, 분석 조건은 다음과 같다. column은 YMC-Pack Pro C18(5 μm, 4.6×250 mm, YMC Co.), mobile phase 조성은 solvent A water: thrifluoro-acetic acid(99.5:0.5, v/v)와 solvent B Acetonitrile를 사용하였고, flow rate 및 column 온도는 각각 0.8 mL/min, 30℃로 detector는 photodiode array detector (Waters 2699, Waters Co.)를 사용하여 검출하였다. 표준물질은 calycosin-7-o-β-d-glucoside, ononin, calycosin 및 formononetin을 Sigma-Aldrich Co.로부터 구입하였고 HPLC에서 나타난 peak area의 3회 반복 평균값을 취한 후 표준물질의 양과 peak area사이의 상관관계를 도출하여 검량선을 작성하여 계산하였다.

본 실험의 결과는 3회 반복 실험을 실시한 뒤 평균과 표준편차로 나타내었으며, 각 실험결과에 대한 통계분석은 SPSS 22.0 program(Statistical Package for Social Sciences, SPSS Inc, Chicago IL, USA)을 이용하여 ANOVA를 실시한 후 Duncan’s multiple range test 방법을 사용하여 각 처리구간의 유의적 차이를 검증하였다(p<0.05).

상황버섯균을 접종하여 30일간 배양한 황기의 수분함량, pH, 산도 및 환원당 함량을 측정 결과는 Table 1.과 같다. 수분함량 측정 결과 대조구 즉, 상황버섯균 무 접종 황기로 0일차는 52.95%의 함량을 보였고, 배양 10, 20, 30일차 황기배양물은 각각 54.73%, 55.77%, 56.63%로 배양기간이 지남에 따라 서서히 증가하는 경향을 보였으며 전반적으로 균사체 배양 황기의 수분함량은 약 50% 이상으로 대조구보다 높았으며, 배양 30일차 가장 높은 수분함량을 나타내었다. 이는 육안을 통해서 균사체의 증식이 양호한 것을 확인한 바와 같이 배양기간이 지남에 따라 균사체의 생장으로 인해 수분함량이 꾸준히 증가한 것으로 판단된다. pH는 균사체 배양기간이 지남에 따라 0일차 pH 5.84 10, 20일차 5.84, 30일차 5.82로 증가하였다가 감소되는 경향을 보였으나 큰 차이는 보이지 않았다. Kim 등(17)은 pH 4~5범위의 산성에서 담자균의 생장 및 배양이 양호하며, 구름버섯 및 말똥 진흙버섯 배양액이 발효기간이 지남에 따라 계속적으로 pH가 상승하여 pH 6 이상까지 도달하였다는 결과와 유사하였다. 반면 산도는 배양기간이 지남에 따라 유의적으로 감소하는 경향을 보였는데 배양 0일차 0.46%로 총 산도가 가장 높았으며 이후 배양 10, 20, 30일차 각각 0.32%, 0.35%, 0.31%로 초기 산도에 비해 감소하였다. 이러한 결과는 오미자 열매 추출액이 젖산 발효가 진행됨에 따라 pH가 증가하고 적정산도는 감소한 결과와 유사하였으며, 일반적인 젖산발효 양상과 대비 되는 것으로 발효가 진행되면서 산성을 나타내는 유기산의 일부분이 소비되며, 세포내 탈 탄산효소에 의해 다른 물질로 전환되면서 발효물의 산도를 감소시키거나 유지하는 경향을 나타낸다는 연구결과가 보고된바 있다(18). 환원당 함량을 측정한 결과 배양기간에 따른 함량 차이를 나타냈다. 배양 30일차 환원당 함량은 0.61 g/100 g으로 가장 높은 환원당 함량을 나타냈으며 대조구 환원당 함량 0.32 g/100 g에 비해 약 2배 높은 환원당 함량을 나타냈었다. 이는 담자균을 곡물에 배양하여 발효 시 배양기간이 지남에 따라 효소활성이 증가되었고, 이러한 결과는 α-amylase를 생성하는 미생물들이 발효식품 제조에서 전분질 원료를 당화시키는 것으로 알려져 있으며(19)이 더불어 fungamyl 처리한 황기의 환원당 함량이 시간이 지남에 따라 증가하였다는 보고(20)와 본 연구결과는 유사한 결과를 나타냈다.

상황버섯균 접종 황기에 대한 80% 에탄올 용매 및 열수 추출에 대한 추출수율 결과는 Table. 2에 나타내었다. 열수추출물은 40.18~41.99%의 비슷한 수율을 보였고, 그 중 담자균 무접종 황기 즉, 대조구가 41.99%로 높은 수율을 나타냈다. 반면 에탄올 추출물은 28.70~33.18 %로 열수추출물보다 낮은 수율을 보였으며, 배양 30일차의 경우 대조구에 비해 수율이 약 1.2배 증가하였으므로 배양기간이 지남에 따라 수율이 점진적으로 증가하는 결과를 보였다. 이러한 결과는 용매에 따른 추출수율이 상반되는 것으로 사료 되며 Kim 등(21)와 같이 버섯균사체를 이용한 연잎 발효의 경우와 유사한 결과를 가지는 것을 알 수 있었다.

상황버섯균 접종 황기의 추출용매별 유리당 함량을 측정한 결과는 Table 3.과 같다. 80% 에탄올 및 열수 추출물의 유리당은 fructose, sucrose가 함유되어 있는 것으로 나타났으며, 이는 Kim 등(22)의 연구에 따르면 황기에 함유된 유리당은 fructose, glucose와 sucrose 3가지이나 열수 추출물 및 50% 에탄올 추출물에서는 glucose가 검출되지 않았고 75% 에탄올 추출물에서 미량 검출 되었다는 보고와 유리당 조성이 유사한 경향을 나타내었다. 80% 에탄올 추출물의 대조구 경우 fructose 0.58% 및 sucrose 11.40%로 검출되었으며, 전반적으로 배양기간이 지남에 따라 fructose, sucrose 함량이 미미하게 감소하는 경향을 보였다. 열수추출물 또한 대조구의 유리당 함량은 fructose, sucrose 각각 0.51% 및 9.67% 로 80% 에탄올 추출물과 유사한 결과를 나타내었다. 즉, 상황버섯균사체 발효로 인해 에탄올 및 열수 추출물의 유리당 함량은 배양기간이 지남에 따라 감소되었음을 알 수 있었다. 이상의 결과는 본 연구에서 사용된 상황버섯균사체의 가수분해효소 활성에 의하여 단당류 등으로 분해된 후 균사체의 증식에 따른 당 소비로 인해 배양기간이 지남에 따라 감소한 함량을 나타내었으며, 또한 추출 시 극성도가 다른 각 추출용매에 따라 당 용출의 차이로 상이한 유리당 함량 결과를 나타낸 것으로 사료된다.(19-24)

상황버섯균 접종 황기의 80% 에탄올 추출물의 배양기간에 따른 아미노산의 함량변화는 Table 4와 같다. 총 아미노산 함량은 필수아미노산 8종을 포함해서 총 17종이 검출되었다. 아미노산의 총 함량은 배양기간이 지남에 따라 20일까지 소폭 증가하였으나 30일차 감소하는 결과를 보였다. 이는 균사체의 protease활성으로 황기의 단백질이 가수 분해됨으로써 아미노산 생성 증가에 기인하여 함량이 증가하며(25), 시간이 지남에 따라 미생물 증식이 왕성해짐으로써 아미노산의 생성보다 소비 증가로 인해 아미노산 함량이 감소한 것으로 판단된다.(26) 그 중 배양 20일차가 121.47 mg% 으로 다른 배양일차 보다 다소 증가한 함량을 나타냈고, 배양 0일차인 105.68 mg%에 비해 약 1.2배 높은 함량을 나타났다. 즉, 배양 20일차의 경우 arginine이 38.05 mg%로 구성성분 중 가장 높았으며, 그다음으로 alanine이 19.91 mg%, aspartic acid 10.23 mg%, valine 8.94 mg%, leucine 6.04 mg%, serine 5.77 mg%, glycine 4.51 mg%, isoleucine 4.27 mg% 순으로 나타났다. 그 외에도 glutamic acid, cystine, methionine, tyrosine, phenylalanine, lysine, histidine 등이 검출되었다. 반면 0일차의 경우 arginine이 35.02 mg%, alanine이 18.90 mg%, aspartic acid 9.77 mg%, valine 7.19 mg%, leucine 5.21 mg%, serine 4.35 mg%, threonine 4.05 mg%, phenylalanine 3.36 mg% 순으로 나타났으며, 또한 배양 10일차의 경우도 arginine이 37.23 mg%, alanine이 19.88 mg%, aspartic acid 9.80 mg%, valine 8.34 mg%, leucine 6.05 mg%, serine 5.41 mg%, threonine 5.24 mg%, isoleucine 4.20 mg% 순으로 나타났다. 배양 30 일차에서는 arginine이 37.81 mg% alanine이 16.28 mg%, aspartic acid 8.62 mg%, valine 8.16 mg%, threonine 5.90 mg%, leucine 5.63 mg%, serine 5.16 mg%, glycine 3.95 mg% 순으로 나타났으며, 배양기간 동안 아미노산 중에서 tryptophan은 검출 되지 않았다.

이상의 결과에서 상황버섯균 접종 황기의 주요 아미노산은 arginine, alanine, aspartic acid 및 valine 으로 arginine, valine은 약한 쓴맛을 alanine 및 aspartic acid는 감칠맛을 나타내는 것으로 알려져 있다. 이러한 본 연구 결과를 미루어 볼 때 아미노산의 조성과 함량은 균 사용 여부 및 원료 및 발효기간 등의 조건에 기인하며(27) 미생물을 활용한 발효로 다양한 특성을 가진 아미노산의 증가 뿐만(28) 아니라 독특한 향미를 제공할 수 있을 것으로 사료된다.

상황버섯균 무접종 황기와 균 접종 배양한 황기의 추출용매에 따른 성분 함량 측정하기 위해 황기에 존재하는 생리활성 물질로 isoflavonoids 성분인 calycosin-7-o-β-d- glucoside, ononin, calycosin 및 formononetin 4종의 성분을 확인하였으며 구조는 Fig. 1와 같고, HPLC chromatogram은 Fig. 2에 분석결과는 Table 5에 나타냈다. 대조구 즉, 0일차의 80% 에탄올 추출물은 calycosin-7-o-β-d-glucoside 21.58 mg/100 g, ononin 28.93 mg/100 g, calycosin이 16.98 mg/100 g, formononetin이 11.54 mg/100 g의 함량을 나타냈고, 열수추출물은 calycosin-7-o-β-d-glucoside 16.60 mg/100 g, ononin 14.47 mg/100 g, calycosin이 0.45 mg/100 g, formononetin이 0.18 mg/100 g의 함량을 나타내었는데 이는 추출용매의 극성도에 따라 성분 용출에 차이가 나므로 함량이 상이한 것으로 판단된다.(29) 균 접종 황기의 80% 에탄올 추출물을 분석한 결과 배양기간이 지남에 따라 전반적 4종의 성분 함량이 감소하거나 미미한 차이를 나타낸 반면 열수 추출물의 배양 30일차에서 calycosin-7-o-β-d-glucoside은 3.30 mg/100 g, ononin은 2.85 mg/100 g으로 대조구에 비해 각각 5배, 5.1배 감소하였으며, calycosin 및 formononetin 함량은 3.91 mg/100 g, 1.38 mg/100 g으로 대조구에 비해 각각 8.7배와 7.7배 증가한 함량으로 다른 배양일 보다 유의적으로 높은 함량을 나타내었다. 따라서 본 실험의 결과를 토대로 보았을 때 황기에 다량 존재하는 calycosin, formononetin의 배당체형태인 calycosin-7-o-β-d-glucoside 및 ononin (Formononetin-7-O-β-d-glucoside) 성분이 aglycon 형태로 전환이 된 것으로 이는 배양과정 중 Phellinus linteus의 효소 분해 작용으로 인해 유기물을 분해하고 전환시켜 함량이 증가한 것으로 사료된다. 이는 Im 등(30)이 Viscozyme 등의 당분해효소를 처리하여 배당체 형태의 성분을 비배당체 형태로 전환하고, 한약재 추출물을 lactobacillus균로 발효하여 nodakenin을 aglycon인 nodakenitine으로 전환시킨 보고(31)와 유사하였으며, 이러한 균 발효공정을 통한 약용소재 활성성분의 생물전환은 약재의 효능 증가 및 새로운 효능 도출 할 수 있으며, 체내 이용 및 흡수율 증진 시켜 여러모로 식품산업에서 폭넓은 활용이 가능할 것으로 판단된다(32).

Fig. 1. Chemical structure of four compounds from Astragalus membranaceus fermented with Phellinus linteus.

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Fig. 2. HPLC chromatograms of isoflavonoid compounds. A, standard of four isoflavonoid compounds; B, water extract of Control; C, water extract of 30day the Astragalus membranaceus fermented with P. linteus; 1, calycosin-7-O-β-d-glucoside; 2, ononin; 3, calycosin; 4, formononetin.

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