건조 구기자의 추출에 따른 항산화 효능 모니터링

본 실험에 사용된 구기자(Lycium chinensis Mill)는 충남 청양군 청양구기자농협에서에서 건조 구기자를 구입하여 시료로 사용하였다. 구기자의 전처리는 건조구기자를 분쇄기(삼성제약기계, Seoul, Korea)로 마쇄하여 20~40 mesh 분말을 추출시료로 사용하였다. 그 외 시약은 Folin-Ciocalteu reagent(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), ABTS[2,2-azino-bis-(3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid)](Sigma-Aldrich, USA), gallic acid (Sigma, USA), ferrozine(Sigma-Aldrich, USA)을 사용하였다. 시료의 흡광도 측정은 분광광도계(UVspectrophotometer UV1601, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 측정하였다.

추출 조건은 환류냉각기에 부착한 250 mL 등근플라스크에 구기자분말 20 g과 추출용매 200 mL를 넣고 70℃에서 일정 시간 추출하였다. 이 때 추출용매의 에탄올 농도와 추출 시간은 중심합성실험계획에 따라 설정하였다.

건조 구기자의 추출조건에 따른 항산화 성분과 ABTS 라디칼 소거능 등 항산화성의 변화를 모니터링하고자 실험계획은 중심합성계획법(10)에 의하여 설계하였고, 반응표면 회귀분석을 위해서는 SAS program(Statistical Analysis System, ver. 8.01, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 사용하였다.

중심합성실험계획에 따라 추출용매로서 에탄올의 농도(0, 20, 40, 60, 80%) 및 추출 시간(1, 2, 3, 4, 5 hr)은 -2, -1, 0, 1, 2 다섯 단계로 부호화 하였으며, 실험계획은 Table 1에 나타내었다. 종속변수로는 갈색도, 총 페놀성 화합물, ABTS 라디칼 소거능 및 Fe²⁺ chelating activity로 하였다.

갈색도를 측정하기 위한 건조 구기자 추출물은 건조 구기자 시료 대비 8배 희석하여 갈색도 측정용 시험용액으로 사용하였다. 갈색도의측정은분광광도계(UV-spectrophotometer UV1601, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다.

페놀성 화합물의 함량은 gallic acid를 표준물질로 하여 Folin-Ciocalteu reagent 발색법(11)으로 분석하였다. 분석시험은 Na₂CO₃(20 g/100 mL) 1.5 mL, Folin-Ciocalteu reagent 500 μL, DIW(deionized water) 6 mL, 시험용액 100 μL를 혼합한 후 상온에서 2시간 반응시킨 후 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질의 제조는 gallic acid를 DIW에 용해하여 100 mg/100 mL으로 만든 후 DIW로 희석하여 검량곡선을 작성 후 시료 100 g 중 μg gallic acid로 나타내었다.

ABTS[2,2-azino-bis-(3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid)] radical 소거능은 ABTS radical cation decolorization assay(12)를 이용하여 측정하였다. 7.4 mM ABTS 용액과 2.6 mM potassium persulphate를 혼합하여 실온의 암소에서 하루 동안 방치하여 양이온(ABTS·⁺)을 형성시킨 다음, phosphate buffered saline(PBS, pH 7.4)로 희석하여 734 nm 에서 흡광도 값이 1.0 이하가 되도록 하였다. 희석된 ABTS·⁺ 용액 150 μL와 건조 구기자 시료 대비 20배 추출 및 희석된 시료를 각각 5 μL씩 혼합하여 실온에서 10분간 반응시킨 후 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS 라디칼 소거능(%)은 1에서 시료 첨가구의 흡광도를 시료 무첨가구의 흡광도로 나눈 수치를 뺀 후 100을 곱하여 나타내었다.

Fe²⁺ chelating activity는 Hus 등(13)의 방법에 의해 측정하였다. 2 mM FeCl₂ 60 μL, 건조구기자 시료 대비 50배 추출 및 희석된 시료 40 μL 및 증류수 700 μL를 혼합한 후 상온에서 약 10분간 반응시켰다. 반응 후 5 mM ferrozine 40 μL를 첨가하여 Fe²⁺-ferrozine complex를 유도하기 위해 상온에서 약 5분간 다시 반응시켰다. 반응 후 562 nm에서 흡광도를 측정하였다. Fe²⁺ chelating activity (%)은 1에서 시료 첨가구의 흡광도를 시료 무첨가구의 흡광도로 나눈 수치를 뺀 후 100을 곱하여 나타내었다.

건조 구기자의 추출에 따른 갈색도의 변화를 관찰해 본 결과, 에탄올 농도 및 추출 시간의 변화에 따른 갈색도의 변화는 0.42~0.80(420 nm에서 흡광도)의 차이를 나타내었다(Table 1). 이를 회귀분석한 결과 갈색도에 대한 모델식의 R²은 0.8903으로 5% 이내 유의수준에서 유의성이 있었다 (Table 2).

건조 구기자의 추출에 따른 갈색도는 에탄올 농도가 증가할수록 비례적으로 증가하는 경향을 나타내었으며, 추출시간의 변화에 따른 수율의 변화는 크지 않았으나 에탄올 농도 50% 이하에서는 추출 시간이 증가할수록 증가하는 경향을 나타내었다. 그러나 에탄올 농도 60% 이상에서 고온 장시간 추출시 다소 감소하는 경향을 나타내었다(Fig. 1). 이러한 현상은 높은 에탄올 농도에서 고온 장시간 추출로 갈색도에 영향을 주는 색소가 변화되기 때문으로 여겨진다. 추출 변수인 에탄올 농도와 추출 시간이 갈색도에 미치는 영향을 알아보고자 회귀분석을 통해 F값을 구해 본 결과 (Table 3), 에탄올 농도의 영향이 가장 높게 나타나 F값이 10.28으로 10%의 유의수준에서 유의성이 인정되었으나, 추출 시간의 영향은 낮게 나타나 F값이 0.83로 유의성이 인정되지 않았다.

Fig. 1. Response surface for brown color intensity of the dr ied Gugija as a function of extraction ethanol concentration and time.

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건조 구기자의 갈색도에 대한 반응표면 형태는 최대점을 나타내었으며, 최소의 수율은 에탄올 농도 2.37%, 추출 시간 2.32 hr에서 0.37을 나타내었다. 그러나 최대의 갈색도는 에탄올 농도 78.10%, 추출 시간 2.38 hr에서 0.75을 나타내었다(Table 4). 건조 및 추출 중 형성된 갈색물질은 주로 Maillard 반응에 의해 형성된 멜라노이딘으로서 고농도의에탄올 용액에 용해되지 않는다. 따라서 건조 구기자의 갈색물질은 구기자 고유의 색소가 대부분인 것으로 여겨진다.

건조 구기자의 추출에 따른 총 페놀성 화합물의 변화를 관찰해 본 결과, 총 페놀성 화합물의 함량이 시료 100 g당 1,296~2,318 μg으로 에탄올 농도와 추출 시간에 따라 큰 차이를 타나내었다(Table 1). 이를 회귀분석한 결과, 총 페놀성 화합물의 R²은 각각 0.8667로 10% 이내 유의수준에서 유의성이 있었다(Table 2).

건조 구기자의 총 페놀성 화합물의 함량은 1시간 추출에서 에탄올 농도가 증가할수록 증가하는 경향을 나타내었다. 그러나 60% 이상의 높은 에탄올 농도에서는 다소 감소하는 경향을 나타내었다. 그리고 에탄올 농도 20% 이하에서는 추출 시간이 증가할수록 증가하는 경향을 나타내었다. 그러나 에탄올 함량이 50% 이상에서는 추출 시간이 증가할수록 페놀성 화합물의 함량이 급격히 줄어드는 것을 볼 수 있었다(Fig. 2). 이러한 현상은 높은 에탄올 농도에서 고온 장시간 추출시 페놀성 화합물이 불용화되거나 분해되는 것으로 여겨진다. 그러나 30% 이하의 낮은 에탄올 농도에서는 시간이 경과할수록 페놀성 화합물이 증가하는 경향이었는데, 이것은 Cho 등(4)이 구기자의 페놀성 화합물인 protocatechuic acid, caffeic acid, chlorogenic acid courmaric acid 등이 60% 에탄올 추출물보다 물 추출물에서 더 많이 추출된다고 한 내용과 일치하는 경향을 보였다. 에탄올 농도와 추출 시간이 총 페놀성 화합물의 변화에 미치는 영향을 알아보고자 회귀분석을 통해 F값을 구해 본 결과(Table 3), 에탄올 농도의 영향이 높게 나타나 F값이 4.40이었으나, 추출 시간의 영향은 상대적으로 낮게 나타나 F값이 1.26으로 조건 변수 모두 유의성이 인정되지 않았다.

Fig. 2. Response surface for total phenolic compounds of the dried Gugija as a function of extraction ethanol concentration and time.

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건조 구기자의 총 페놀성 화합물에 대한 반응표면 형태는 안장점(saddle point)을 나타내었으며, 최소의 총 페놀성 화합물은 에탄올 농도 79.12%, 추출 시간 3.42 hr에서 1,231 μg를 나타내었다. 그러나 최대의 총 페놀성 화합물은 에탄올 농도 30.17%, 추출 시간 4.94 hr에서 2,355 μg를 나타내었다(Table 4). 건조 구기자의 총 페놀 화합물의 추출을 위해서는 30%의 에탄올로 5시간 정도 추출하는 것이 더 많은 총 페놀성 화합물을 얻을 수 있는 것으로 여겨진다.

건조 구기자의 추출에 따른 ABTS 라디칼 소거능 변화를 관찰해 본 결과, 시료 대비 20배 희석된 시험용액의 ABTS 라디칼 소거능이 6.88~12.85%로 에탄올 농도와 추출 시간에 따라 차이를 타나내었다(Table 1). 이를 회귀분석한 결과 ABTS 라디칼 소거능의 R²은 각각 0.8486로 10% 이내 유의수준에서 유의성이 있었다(Table 2).

건조 구기자의 ABTS 라디칼 소거능 변화는 총 페놀성 화합물 함량과 유사한 반응표면을 나타내었다. 추출 시간 1시간에서는 에탄올 농도가 증가할수록 비례적으로 증가하는 경향을 나타내었으며, 에탄올 농도 50% 까지는 추출시간 또한 증가할수록 크게 증가하는 경향을 나타내었다(Fig. 3). 그러나 총 페놀성 화합물과 마찬가지로 에탄올 농도 60% 이상에서는 추출 시간이 경과할수록 서서히 감소하는 경향을 나타내었다(Fig. 3). ABTS 라디칼 소거능은 총 페놀성 화합물의 영향을 크게 받는 것으로 여겨지며, 페놀성 화합물이 ABTS 라디칼 소거능을 나타내는 주요 항산화 성분으로 여겨진다. 충분한 시간 동안 추출할 경우에는 물 또는 낮은 에탄올 농도에서 추출한 추출물이 ABTS 라디칼 소거능이 가장 높은 반응표면을 형성하였는데, 이것은 Cho 등(4)이 구기자 추출물의 ABTS 라디칼 소거능이 60% 에탄올 추출물보다 물 추출물이 더 높다는 연구 결과와 일치하였다. 에탄올 농도와 추출 시간이 ABTS 라디칼 소거능 변화에 미치는 영향을 알아보고자 회귀분석을 통해 F값을 구해 본 결과(Table 3), 에탄올 농도의 영향이 상대적으로 낮게 나타나 F값이 4.06으로 유의성이 인정되지 않았으나, 추출 시간의 영향은 낮게 나타나 F값이 4.93로 10%의 유의수준에서 유의성이 인정되었다.

Fig. 3. Response surface for ABTS radical scavenging activity of the dried Gugija as a function of extraction ethanol concentration and time.

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건조 구기자의 ABTS 라디칼 소거능에 대한 반응표면은 안장점(saddle point)의 형태를 나타내었으며, 최소의 ABTS 라디칼 소거능은 에탄올 농도 76.62%, 추출 시간 3.81 hr에서 5.31%를 나타내었다. 그러나 최대의 ABTS 라디칼 소거능은 에탄올 농도 16.21%, 추출 시간 4.61 hr에서 13.83%를 나타내었다(Table 4). 최대 ABTS 라디칼 소거능이 낮게 나타났지만 시료 대비 20배 희석된 시험용액의 ABTS 라디칼 소거능임을 감안한다면 아주 높은 항산화 효과를 나타내었음을 알 수 있다. ABTS 라디칼 소거능이 총 페놀성 화합물의 추출조건인 낮은 에탄올 농도에서 긴 시간 추출할 경우 높게 나타나는 패턴과 일치하고 있어 총 페놀성 화합물이 ABTS 라디칼 소거능에 영향을 미치는 중요한 항산화 성분으로 여겨진다. 따라서 에탄올 농도 10~30%에서 4~5시간 추출하는 것이 항산화 효과가 높은 페놀성 화합물 등을 항산화 성분을 많이 추출할 수 있을 것으로 판단된다.

건조 구기자의 항산화 효과를 모니터링하고자 에탄올 농도 및 추출 시간에 따른 Fe²⁺ chelating activity의 변화를 관찰해 본 결과, 시료 대비 50배로 추출 및 희석한 구기자 추출물의 Fe²⁺ chelating activity는 27.40~59.36%로 에탄올 농도에 따라 큰 차이를 타나내었다(Table 1). 이를 회귀분석한 결과 Fe²⁺ chelating activity의 R²은 각각 0.9214로 5% 이내 유의수준에서 유의성이 있었다(Table 2).

건조 구기자의 Fe²⁺ chelating activity는 에탄올 농도가 증가할수록 급격히 감소하고 추출 시간이 증가함에 따라 다소 증가하는 반응표면 패턴을 나타내었다(Fig. 4). Fe²⁺ chelating activity는 에탄올 함량이 적은 조건에서 추출되는 수용성 성분으로 추측할 수 있으나, 갈변물질과는 완전히 정반대의 반응표면을 나타내고 있으며, 총 페놀성 화합물의 반응표면과도 다른 패턴을 보여 갈변물질이나 페놀성 화합물의 영향은 아주 낮으며, lactic acid, malic acid, oxalic acid 등(14) 구기자 유래 유기산이 킬레이트 활성에 크게 관여하는 것으로 여겨진다. 에탄올 농도와 추출 시간이 Fe²⁺ chelating activity의 변화에 미치는 영향을 알아보고자 회귀분석을 통해 F값을 구해 본 결과(Table 3), 에탄올 농도의 영향이 상대적으로 높게 나타나 F값이 15.54으로 5%의 유의수준에서 유의성이 인정되었으나, 추출 시간의 영향은 낮게 나타나 F값이 0.11로 유의성이 인정되지 않았다.

Fig. 4. Response surface for Fe²⁺ chelating activity of the dried Gugija as a function of extraction ethanol concentration and time

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건조 구기자의 Fe²⁺ chelating activity에 대한 반응표면은 안장점(saddle point)의 형태를 나타내었으며, 최소의 Fe²⁺ chelating activity는 에탄올 농도 79.55%, 추출 시간 3.30 hr에서 25.41%를 나타내었다. 그러나 최대의 Fe²⁺ chelating activity는 에탄올 농도 0.76%, 추출 시간 3.39 hr에서 58.54% 를 나타내었다(Table 4). 최대점에서의 Fe²⁺ chelating activity가 58.54%로 상대적으로 크지 않으나 사용된 시험용액이 시료 대비 50배나 희석한 시험용액을 사용하여 측정된 수치이므로 chelating activity가 아주 크게 나타났음을 알 수 있다.

항산화 효과가 우수한 항산화 성분의 최적 추출조건을 얻고자 갈색도, 총 페놀성 화합물, ABTS 라디칼 소거능 및 Fe²⁺ chelating activity에 대한 등고선도를 겹쳐 그려 최적조건을 설정하였다.(Fig. 5).

Fig. 5. Superimposed contour map of optimized condition for brown color intensity, total phenolic compounds, ABTS radical scavenging activity and Fe²⁺ chelating activity of the dried Gugija as a function of extraction ethanol concentration and time.

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항산화 성분인 총 페놀성 화합물이 많이 추출되는 조건은 에탄올 농도가 상대적으로 낮은 10~20%에서 4~5 hr 추출하는 것으로 설정되었으며, 항산화 성분인 페놀성 화합물이 높게 추출되고 ABTS 라디칼 소거능 및 Fe²⁺ chelating activity가 높은 조건으로 등고선도가 겹쳐지는 부분을 최적 조건으로 설정하여 임의의 최적 조건(에탄올 농도 15% 및 추출 시간 5 hr)으로 항산화성이 높은 구기자 추출물을 얻었다.

임의의 최적 추출조건에서 추출된 추출물의 총 페놀성 화합물이 2,397 μg, ABTS 라디칼 소거능이 15.62% 그리고 Fe²⁺ chelating activity가 54.78%로서 증류수로 1시간 추출한 대조구(총 페놀성 화합물이 1,293 μg, ABTS 라디칼 소거능이 4.77% 그리고 Fe²⁺ chelating activity 43.82%)에 비해 증가된 항산화 성분 및 항산화 효과를 나타내었다.

이상의 연구 결과를 종합해 볼 때 항산화 효과가 우수한 총 페놀성 화합물, 금속 킬레이트 등 항산화 성분을 충분하게 추출하기 위해서는 에탄올 10~20%에서 4~5시간 추출하는 것이 적당한 것으로 여겨진다.