초미세 분쇄한 삼백초(Saurus chinensis) 추출물의 미용 활성

본 실험에서 사용된 시료는 건조시킨 삼백초를 10 L 용량의 초미세 분쇄 장치(MKFS10-1, Koen 21 Co., Ansan, Korea) 를 이용하여 시간당 20 kg의 grinding 속도로 normal grinding(125 μm ISO mesh size, ASTM 40 mesh: 이상 사이즈), fine grinding(125 μm ISO mesh size, ASTM 140 mesh: 초과 사이즈)과 ultrafine grinding(125 μm ISO mesh size, ASTM 140 mesh: 미만 사이즈)으로 나누어 분쇄하여 사용하였다.

시료 1 g에 증류수 200 mL를 넣고 액이 100 mL가 될 때까지 가열한 후 냉각하고 에탄올 추출물은 시료에 100 mL의 50% ethanol을 가하고 homogeniger로 20,000 rpm에서 1분간 균질화 시킨 후 24시간 동안 교반 추출하였으며, 추출액은 whatman No. 1 filter paper로 여과한 후 필요에 따라 rotary vacuum evaporator(Eyela NE, Tokyo, Japan)에서 농축하여 시료로 사용하였다.

Phenol성 화합물의 정량은 Folin과 Denis(20)의 방법으로 측정하였으며, 시료 1 mL에 95% ethanol 1 mL와 증류수 5 mL를 첨가하고 1 N Folin-ciocalteu reagent 0.5 mL를 넣어 잘 섞어주고, 5분간 방치한 후, 5% Na₂CO₃ 1 mL를 가한 후, 흡광도 725 nm에서 1시간 이내에 측정하여 gallic acid를 이용한 표준곡선으로부터 양을 환산하였다.

Tyrosinase 저해활성 측정은 Yagi 등의 방법(21)에 따라 측정하였다. 반응구는 0.175M sodium phosphate buffer(pH 6.8) 0.5 mL에 10 mM L-DOPA를 녹인 기질액 0.2 mL 및 시료용액 0.1 mL의 혼합액에 mushroom tyrosinase(110 U/mL) 0.2 mL을 첨가하여 25℃에서 2분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA chrome을 475 nm에서 측정하였다. Tyrosinase 저해율(%)은 1-(반응구의 흡광도/대조구의 흡광도)×100으로 나타내었다.

Elastase 저해활성 측정은 James 등의 방법(22)에 따라 측정하였다. 기질로서 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide를 사용하여 37℃ 에서 20분간 기질로부터 생성되는 p-nitroanilide 의 생성량을 445 nm에서 측정하였다. 즉, 각 시험용액을 일정 농도가 되도록 조제하여 0.5 mL씩 시험관에 취하고, 50 mM tris-HCl buffe(pH 8.6)에 녹인 porcine pancreas elastase(2.5 U/mL)용액 0.5 mL을 가한 후 기질로 50 mM tris-HCl buffer(pH 8.6)에 녹인N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide (0.5 mg/mL)을 첨가하여 20분간 반응시켜 측정하였다. Elastase 저해율(%)은 1-(시료첨가군의 흡광도/대조구의 흡광도)×100으로 나타내었다.

Astringent 활성 측정은 Lee 등의 방법(10)에 따라 측정하였다. 피부 단백질과 유사한 혈액 단백질(hemoglobin)을 사용하여, 원심분리관 용기에 각각의 시료용액과 헤모글로빈용액을 1:1로 넣어서 진탕 혼합한 다음 1,500 rpm에서 3분간 원심분리 후 576 nm에서 흡광도를 측정하였다. Astringent 활성은 1-(시료첨가군의 흡광도/대조구의 흡광도)×100으로 나타내었다.

실험 결과는 3번 이상 반복하여 측정한 후 평균값으로 나타내었으며, 실험결과의 통계분석은 SAS(Statistical Analysis System, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)의 Duncan’s test를 이용하여 평균값간의 유의성 검정(p<0.05) 을 하였다.

초미세 분쇄기술은 해당 물질의 표면적을 극대화시켜 분해가 어려운 물질의 용해도를 증가시키며 유용물질의 추출 수율을 높이는 장점을 가진 기술로 기능성 물질의 효율적인 추출을 위한 가공방법이다. 최근 초미세 분쇄를 적용하여 기능성을 확인하는 다양한 연구가 진행되고 있으며, Cho(23)는 삼백초 잎으로 일반분쇄, 미세분쇄 및 초미세 분쇄 추출 등 추출방법을 달리하여 phenolic compounds의 용출량을 알아본 결과 물 추출물에서 일반분쇄 6.2 mg/g, 미세분쇄 11.0 mg/g, 초미세 분쇄 12.9 mg/g으로 보고하여, 일반 분쇄에 비해 초미세 분쇄 시 생리활성 물질의 추출수율이 증가하는 것을 입증하였으며, 추출수율이 입자 크기가 작아질수록 생리활성물질인 phenolic compounds의 추출수율이 높아져 약 2.5배 높은 추출수율을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 이상의 결과를 바탕으로 본 연구에서는 초미세 분쇄가 삼백초 추출물의 미백활성에 미치는 영향을 확인하였다.

사람의 피부색은 멜라닌(melanin)이나 카로틴(carotene) 과 같은 색소 성분 등에 의해서 좌우된다. 멜라닌이 피부색을 결정하는 가장 중요한 요소로 국소적으로 과도하게 합성되거나, 멜라닌 생성에 이상이 생기면 melanoma, freckle 및 hyperpigmentation을 유발하게 된다(24). 따라서 멜라닌 합성의 기질인 tyrosine을 분해하는 tyrosinase를 저해함으로서 멜라닌의 합성을 억제하여 미백효과를 직접적으로 확인할 수 있으므로 많은 연구자들에 의해 tyrosinase 억제효과를 검토함으로서in vitro상에서의 미백효과를 검정하고 있다(25,26,27,28,29,30,31). Tyrosinase 억제물질에 의한 산업적인 적용은 최근 Vitamin C, kojic acid, arbutin 및 hydroquinone 등의 천연 및 합성 미백제가 개발 연구되어 미백 화장품에 응용되고 있다. 그러나 Vitamin C, kojic acid와 같이 제한적인 물질들만 상용화 되고 있어 상업적으로 이용 가능한 천연물을 활용한 미백활성을 가지는 물질에 대한 연구, 검토가 필요하였다. 이에 따라 미세 분쇄와 초미세 분쇄된 삼백초의 미백활성 검증을 측정한 결과, Table 1에서와 같이 미세분쇄 하지 않은 삼백초 물 추출물의 경우 tyrosinase 억제 효과가 나타나지 않았지만 ethanol 추출물의 경우 미세 분쇄한 삼백초에서 10% 미만의 저해효과를 나타냈으며, 초미세 분쇄의 경우에는 20% 이상의 미백활성 효과를 나타내어 삼백초를 초미세분쇄 시 용출조건이 달라지면서 해당물질의 표면적을 극대화시킴으로서 분해가 어려운 물질들의 용해도를 높이고, 상대적으로 유용성 물질의 추출 수율을 높여서 추출 또한 용이하게 됨으로서 tyrosinase 저해물질이 추출됨을 알 수 있었다.

Tyrosinase는 Cu²⁺와 결합한 효소로 동․식물, 미생물 및 사람 등에 널리 분포되어 있는 polyphenol oxidase로 멜라닌 합성 과정에서 속도를 제한하는 등 멜라닌 합성의 주요한 조절적 단계를 나타내는 효소이다(28). Melanin 합성의 주효소인 tyrosinase는 tyrosine을 3,4-dihydroxyphenyl-alanine (DOPA)으로 전환시키는데 관여하는 tyrosine hydroxylase 활성과, DOPA를 DOPA quinone으로 산화시키는 DOPA oxidase 활성을 가지고 있어 산화를 촉진한다(29). 그러므로 미백 성분의 소재의 melanin 생합성 과정의 특정 단계나 여러 과정을 동시에 저해하거나 차단시킴으로 인해 최종적으로 미백효과를 기대할 수 있으며, 본 연구에서는 melanin 생합성에 관여하는 주요 효소인 tyrosinase에 대한 저해활성을 in vitro 상에서 측정하여 미백활성을 확인하였다. 초미세 분쇄한 삼백초 ethanol 추출물의 phenolic compounds 농도를 100~1,000 ppm으로 조절하여 tyrosinase inhibition test한 결과 Fig. 1에서와 같이 삼백초 추출물의 경우에는 500 ppm 에서 16.0%의 저해효과를 나타내었으며, 1,000 ppm에서는 100% 가까운 tyrosinase 저해 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다. Jee(30)은 상백피 추출물을 1,000 μg/mL 농도로 첨가하여 tyrosinase 저해효과를 살펴본 결과 ethanol 추출물에서 93%의 저해활성을 확인하였다고 보고한 것과 유사한 결과를 나타내었으나, Lee 등(31)이 가죽나무 잎 추출물을 2,000 μg/mL의 농도로 조절하여 저해효과를 측정한 결과 16%의 tyrosinase 저해 활성을 나타내었다고 보고한 결과와 비교하면 삼백초 추출물의 미백효과가 월등히 우수함을 확인할 수 있었다.

Fig. 1. Effects of phenolic concentration of Saururus chinensis on tyrosinase. The data were expressed as the mean±SD (n=6). Means with different superscripts (a~c) are significantly different at p<0.05 by Duncan's test.

Download Original Figure

최근 생명공학의 발달로 인해 미백 소재의 개발을 위한 여러 가지 연구가 제시되고 있으며, melanin 생합성 과정에 직접적인 영향을 주는 tyrosinase 활성 저해 측정을 비롯하여 melanin 합성 후 전이 과정에 관여하는 신호전달체계를 생물학적 기법으로 확인하는 다양한 연구를 실시하고 있다(32,33,34). 본 연구에서는 초미세 분쇄가 삼백초 ethanol 추출물의 미백 활성을 증대시키는 것을 확인하였으며, 향후 미백 화장품 소재로 활용을 위한 연구 개발의 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

인체의 중성구 과립구내에 존재하는 elastase는 진피 내 피부탄력을 유지하는데 주요한 기질 단백질인 엘라스틴을 분해하는 효소이며, 다른 중요한 기질 단백질인 콜라겐을 분해할 수 있는 비특이적 가수분해 효소이다(35). 따라서 elastase 저해제는 피부 주름개선하는 작용을 나타내며, ursolic acid 등이 elastase 저해제로 이용되고 있다. 피부의 주름 증가와 탄력감소, 색소 침착 등이 노화의 대표적인 형태로, 그 중 가장 대표적인 노화의 현상은 바로 주름이다. Dewitt 등(36)은 이러한 주름을 생성하는 가장 대표적인 두 가지 요인은 자외선, 공해 등 외적인 환경요인과 나이가 들면서 발생하는 피부 조직의 내적요인이라고 하였다. Elastase는 피부조직내의 elastin을 분해함으로서 피부의 탄력성이나 싱싱함을 잃게 하고 주름과 거칠어짐을 발생하여 피부의 노화를 촉진한다. 따라서 elastase 저해활성은 주름개선의 효과와 상관있으며, elastase의 활성을 억제함으로서 피부노화를 지연시킬 수 있음을 알 수 있다.

미세 분쇄와 초미세 분쇄된 삼백초의 주름개선 효과를 측정한 결과, Table 2에서와 같이 미세분쇄 하지 않은 삼백초 물 추출물의 경우 elastase 억제 효과가 11.4%에서 초미세 분쇄의 경우에는 17.2%로 증가하였으며, ethanol 추출물의 경우 일반 분쇄한 삼백초의 9.6%에서 미세분쇄, 초미세분쇄로 분쇄 입자의 크기가 작아질수록 10.3%, 16.3%로 높아지는 것을 확인할 수 있었다. 이는 tyrosinase 억제양상에서와 같이 다양한 분쇄조건에 따라 용출조건이 달라지면서 해당 물질의 용해도를 높이고, 상대적으로 유용성 물질의 추출 수율이 높아져서 나타나는 현상으로 판단하였다.

Elastase는 체내의 엘라스틴을 분해하는 백혈구 과립 효소 중의 하나로 이상조직에서는 그 효소의 활성이 극히 높아 조직 파괴에 직접적인 원인이 되어 피부주름 및 탄력성 소실을 유발한다고 하였다(37). 초미세 분쇄한 삼백초의 phenolic compounds의 농도를 100~1,000 ppm으로 조절하여 elastase 저해활성 측정한 결과 Fig. 2에서와 같이 삼백초 추출물의 첨가농도가 1,000 ppm의 농도에서 물 추출물과 ethanol 추출물에서 각각 34.0%와 30.0%의 저해효과를 나타내었다.

Fig. 2. Effects of phenolic concentration from Saururus chinensis on elastase. A, water extracts; B, ethanol extracts. The data were expressed as the mean±SD (n=6). Means with different superscripts (a~b) are significantly different at p<0.05 by Duncan's test.

Download Original Figure

수렴작용이란 피부 단백질이 고분자 phenolic compound 와 가교결합을 형성하여 피부와 모공이 수축되는 현상을 말한다(38). 수렴제는 피부와 점막 혈관 등을 수축시키는 작용이 있고, 세포간극 및 림프간극을 막아 점액의 분비를 억제시키는 효과가 있다(39). 또한 수렴제는 단백질과 결합하는 성질을 가지기 때문에 일반적으로 헤모글로빈의 단백질이 추출물과 결합하는 정도에 따라서 수렴효과를 측정할 수 있다. Lee 등(39)은 이러한 수렴작용에는 피부와 점막의 표면에 난용성의 피막을 형성하여 구조를 보호하거나, 조직을 조밀하게 하여 세포막의 투과성을 감소시키는 효과가 있다고 하였다.

초미세 분쇄 삼백초 물 추출물에서는 수렴효과가 관찰되지 않았으며, ethanol 추출물의 phenolic 농도를 100~1,000 ppm으로 조절하여 수렴성을 측정한 결과 Fig. 3에서와 같이 250 ppm이상에서 70% 이상의 좋은 효과를 보였으며, 1,000 ppm의 농도에서는 100%에 가까운 astringent 효과를 나타내었다. Lee 등(39)은 브로콜리 ethanol 추출물을 5,000 ppm 의 농도로 조절하여 astringent 효과를 측정한 결과 적색광 하에서 51.6%의 수렴효과를 나타내었다고 보고하였다. 또한 Lee 등(10)은 함초 추출물 10,000 ppm에서 50.0%의 astringent 효과를 나타냈다고 보고한 것과 비교하였을 때 낮은 농도에서도 70% 이상의 효과를 나타낸 초미세 분쇄 삼백초 추출물의 수렴효과가 더 우수한 것이 확인되어 모공축소 화장품에 적용이 가능할 것으로 판단되었다.

Fig. 3. Effects of phenolic concentration from Saururus chinensis on astringent. The data were expressed as the mean±SD (n=6). Means with different superscripts (a~b) are significantly different at p<0.05 by Duncan's test.

Download Original Figure