RAW264.7 대식세포에서 Citrus platymamma의 iNOS, COX-2, 염증성 사이토카인 발현 억제 효과

본 실험에 사용된Citrus Platymamma(병귤)는 국립원예 특작과학원 감귤연구소에서 2014년 9월부터 2015년 2월 시료를 채집하여 실험을 수행하였다. 채집된 식물의 시료 는 건조 후 분쇄하여 70% 메탄올로 3회 반복 추출, 농축하 여 본 실험에 사용하였다.

총 폴리페놀 함량 측정은 Folin-Denis(11)법을 이용하여 비색 정량하였다. 추출물 100 μL에 증류수 900 μL를 넣어 total volume이 1 mL가 되도록 희석하였다. 여기에 Folin- Ciocalteu's phenol reagent 100 μL를 첨가하여 실온에서 약 3분간 반응시키고, Na₂CO₃ 용액(7%, w/v) 200 μL를 가하여 혼합한 후 증류수 700 μL를 넣어 실온에서 1시간 반응시켰 다. 흡광도는 SpectraMax^Ⓡ M3 Multi-Mode Microplate Reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하 여 720 nm에서 측정하였고, 총 폴리페놀 함량은 gallic acid 를 표준물질로 작성한 표준검정곡선을 이용하여 추출물의 총 폴리페놀 함량을 나타내었다.

DPPH(1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl) radical scavenging 활성 실험은 Blois 방법(12)을 변형하여 다음과 같이 측정하 였다. 준비된 0.2 mM DPPH와 시료를 섞고 실온에서 10분 간 방치한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료는 3회 반복실험을 실시하여 평균값을 구하였고, ascorbic acid 를 대조구로 사용하였다.

$\text{Scavenging effect(\%)={1-(B-C/A)}×100}$

ABTS[2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)-diammonium salt] radical scavenging 활성은 Re 등의 방법(13)에 따라 측정하였다. 7.4 mM ABTS와 2.6 mM potassium persulfate를 혼합 후 실온 암소에서 15시간 동안 방치하여 radical을 형성시킨 후 사용하였다. 미리 준비한 ABTS 용액 180 μL에 추출물 20 μL를 농도별로 처리하여 실온에서 15분 동안 방치한 다음 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료는 3회 반복하여 실시하였고, 대조구로 는 ascorbic acid를 사용하였다.

$\text{Scavenging effect(\%)={1-(B-C/A)}×100}$

FRAP(ferric reducing antioxidant power)법에 의한 항산화 활성은 Benzie와 Strain(14)의 방법에 따라 실시하였다. 300 mM acetate buffer(pH 3.6), 10 mM TPTZ(2,4,6-tripyridyl -s-triazine)가 용해된 40 mM HCl 용액과 20 mM FeCl₃·6H₂O 를 각각 10:1:1(v/v/v)의 비율로 혼합하여 FRAP 기질액으로 사용하였다. 96 well plate에 다양한 농도의 시료 40 μL, FRAP 기질액 100 μL와 증류수 200 μL를 차례로 혼합하여 37℃에서 4분간 반응시킨 후 593 nm에서 흡광도를 측정하 였다. 각 시료는 3회 반복하여 실시하였고, FeSO₄·7H₂O를 표준물질로 하여 얻은 표준검정곡선을 이용하여 분석하 였다.

본 실험에 사용된 RAW264.7 murine macrophage cell은 Korean Cell Line Bank(KCLB, Seoul, Korea)로부터 분양받 아 배양하여 사용하였다. 세포 배양은 37℃, 5% CO₂ 항온기 에서 1% penicillin/streptomycin과 10% fetal bovine serum (FBS)이 함유하는 Dulbecco’s modified Eagle’s minimal essential medium(DMEM, Gifco BRL, Grand Island, NJ, USA) 배지를 사용하여 배양하였으며, 3일에 한번씩 계대하 여 본 실험에 사용하였다.

항염활성 측정 중 RAW264.7 세포에서의 NO 생성을 확 인하기 위해 24 well plate에 1.5×10⁵ cells/mL으로 분주 후 18시간 배양하여 세포를 준비하였다. 준비된 세포에 1 μ g/mL의 lipopolysaccharide(LPS)와 농도별로 준비된 시료를 처리하여 24시간 배양 후 세포 배양 상등액을 이용하여 NO의 생성을 확인하였다. NO의 생성은 Griess reagent를 사용하여 흡광도 540 nm에서 측정하였다.

RAW264.6 세포를 24 well plate에 1.5×10⁵ cells/mL으로 분주하여 24시간 배양 후 LPS를 1 μg/mL로 처리하여 cytokine의 생성을 자극하였다. cytokine 생성이 자극된 세 포에 농동별로 시료를 처리하여 24시간 배양 후 상등액을 이용하여 cytokine의 억제 활성을 측정하였다. Mouse TNF- α(Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA), IL-1β(R&D System Inc., Minneapolis, MN, USA), IL-6(Invitrogen Co.) ELISA kit를 사용하여 측정하였다.

배양이 끝난 세포를 수집하여 2~3회 PBS(phosphate buffered saline)로 세척한 후 1 mL의 lysis buffer를 첨가하여 30분간 용해(lysis)시킨 후 12,000 rpm에서 20분간 원심 분 리하여 세포막 성분 등을 제거하였다. 단백질 농도는 BSA(bovine serum albumin)를 표준화하여 Bio-Rad Protein Assay Kit를 사용하여 정량하여 20~30 μg의 lysate를 8~12% mini gel SDS-PAGE로 변성 분리하여, 이를 PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane(BIO-RAD, Richmond, CA, USA)에 200 mA로 2시간 동안 transfer 하였다. 그리고 membrane의 blocking은 5% skim milk가 함유된 TTBS(0.1% Tween 20+TBS) 용액에서 상온에서 2시간 동안 실시하였 다. iNOS의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse iNOS(1:1,000)(Calbiochem, La Jolla, CA, USA)를 사용하였 고, COX-2의 발현양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse COX-2(1:1,000)(BD Biosciences Pharmingen, San Jose, CA, USA)을 TTBS 용액에서 희석하여 상온에서 2시간 반응시 킨 후 TTBS로 3회 세정하였다. 2차 항체로는 HRP(horse radish peroxidase)가 결합된 anti-mouse IgG(Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK)를 1:5000으로 희석 하여 상온에서 30분 간 반응시킨 후, TTBS로 3회 세정하여 ECL 기질(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)과 1~3분 간 반응 후 Chemidoc(Fusion solo, VILBER LOURMAT, Detschland, Germany)을 이용하여 단백질 발현정도를 확인 하였다.

세포독성 평가에는 RAW264.7 세포를 24 well plate에 1.5×10⁵ cells/mL으로분주하여24시간배양후LPS를 1 μg/mL 와 시료를 처리하여 다시 24시간 배양 후 세포 독성을 측정 하였다. 24시간 배양된 세포에 WST-1 reagent(Roche Applied Science, Mannheim, Germany)를 10%(v/v)로 첨가 하여 4시간 추가 배양한 후 440 nm에서 흡광도를 측정하였 다.

모든 실험은 3회 이상 반복하여 이루어졌으며, 실험 결과 는 각 항목에 따라 평균과 표준편차로 나타내었다. 실험군 과의 차이는 SAS package(Statistical Analysis Program, version 9.1)을 사용하여 Duncan’s mutiple range test로 평균 을 비교하여 나타내었고, p<0.05 수준에서 통계적 유의성을 검정하였다.

식물계에 널리 분포되어 있는 페놀계 화합물은 다양한 구조와 분자량의 페놀성 화합물의 phenolic hydroxyl기를 통해 항산화, 항암 및 항염 등의 생리활성 기능을 갖는 것으 로 알려져 있으며 폴리페놀 함량이 높을수록 전자공여능이 높은 밀접한 관련이 있다고 알려져 있다(15,16). 시기별 총 폴리페놀 함량을 알아보기 위해 2014년 9월. 12월, 2015년 2월에 채집된 병귤은 과육과 괴피 부분을 분리하여 건조 후 70% 에탄올을 용매로 사용하여 수행하였다. 병귤의 시 기별 추출물인 9월(SCPE), 12월(DCPE), 2월(FCPE) 추출물 에 함유되어 있는 총 폴리페놀 함량 측정을 위해 gallic acid 를 표준물질로 사용하였으며, 그 결과는 Fig. 1에 나타내었 다. CPE의 총 페놀 함량은 시기적으로는 9월, 부위로는 과피에 3.56 g/100 g으로 함량이 가장 높게 나타났으며, SCPE>DCPE>FCPE 순으로 완숙될수록 총 폴리페놀 함량 이 낮아지는 것을 확인할 수 있었다.

Fig. 1. Total polyphenol contents in the flesh and peel of SCPE, DCPE, and FCPE. The data represent the mean±SD of triplicate experiments. *p<0.05, **p<0.01.

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총 폴리페놀 함량과 항산화 활성의 관계를 알아보기 위 해 단순하면서도 간편하게 시료의 전자 공여에 의한 free radical 소거활성을 측정할 수 있는 방법인 DPPH, ABTS free radical 소거활성과 산화 및 환원 반응에 의한 메카니즘 으로 항산화 활성을 측정하게 되는 FRAP를 측정하였다 (Fig. 2). DPPH와 ABTS free radical 소거활성을 측정한 결과 활성이 SCPE에서 가장 높은 항산화 활성을 보였으며 SC50 이 0.48과 0.11 mg/mL로 나타났다. 이는 총 폴리페놀 함량 과 유사하게 시기적으로는 9월과 부위로는 과피에서 가장 활성이 높았고, 산화 환원력을 볼 수 있는 FRAP 측정 결과 역시 SCPE의 과피 추출물에서 469.5 μmol/g의 환원력을 보였다. 환원력은 체내에 생성된 과산화지질 및 활성 산소 를 제거하여 성인병을 예방하는 효과가 있어 환원반응을 통한 체내 향상성을 유지하는 활성이 높을수록 그 이용가치 가 크며, 병귤의 9월 과피 추출물인 SCPE에서 가장 높은 활성을 보여 총 폴리페놀 함량이 높을수록 항산화 활성이 증가하는 비례적 상관관계를 볼 수 있었다.

Fig. 2. DPPH (A) and ABTS (B) radical scaveging activitie of SCPE, DCPE, and FCPE. Results were expressed the radical scavenging activities as inhibition percent. Reducing power (C) of SCPE, DCPE, and FCPE. The data represent the mean±SD of triplicate experiments. *p<0.05, **p<0.01, versus control.

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과도하게 생성되는 Nitric oxide(NO)는 염증을 유발시키 는 매개체가 되는 인자로 마우스 대식세포인 RAW264.7 세포에 LPS로 염증 유발 시 생성량이 급격히 증가한다. LPS로 염증이 유발된 RAW264.6 세포에 시기별 병귤 과피 추출물인 SCPE, DCPE, FCPE를 100과 200 μg/mL로 처리하 였을 때 세포독성 없이 농도 의존적으로 NO의 생성이 억제되는 것을 확인할 수 있었고, 항산화 활성과 같이 SCPE 시료에서 약 40%로 NO의 생성을 억제하는 활성이 가장 높았다(Fig. 3). 또한 대식세포는 LPS로 자극시키면 다양한 염증인자들이 증가되는데 그 중 림프구나 대식세포 등에서 생성되는 미량의 생리활성 물질로 염증 반응에 관여하는 것으로 알려진 염증성 cytokine인 TNF-α, IL-6, IL-1β의 생 성 억제 활성을 측정하였다(Fig. 4). 시료가 처리된 RAW 264.7 cell에서는 농도 의존적으로 TNF-α, IL-6, IL-1β 생성 억제 활성을 보였고, 특히 SCPE를 50, 100, 200 μg/mL로 처리하였을 때 TNF-α의 생성이 30, 60, 75% 이상 억제하는 효과를 보였다. 림프구를 활성화로 항체 생산을 증가시켜 염증성 병변에서 증가되는 것으로 알려진 IL-6 생성억제 효과를 확인하기 위해 CPE 처리시 농도 의존적으로 IL-6의 생성을 억제하였고 SCPE를 200 μg/mL로 처리시 40% 정도 의 억제 활성을 보였다. TNF-α, IL-6와 함께 여러 면역학적 작용들과 연관되어 있는 IL-1β 역시 SCPE 200 μg/mL 처리 시 20% 정도의 억제 활성을 보여 CPE 중 미숙과 시기인 9월의 과피 추출물 SCPE에서 항염 활성이 가장 우수한 것을 확인 할 수 있었다.

Fig. 3. Inhibitory effects of SCPE, DCPS, and FCPE of nitric oxide (NO) in LPS-stimulated RAW264.7 mur ine macrophage cell. RAW264.7 cells were treated with extracts and LPS (1 μg/mL) for 24 hr. NO production was determined by Griess reagent. LPS (-), PBS without LPS; LPS (+), PBS with LPS. The data represent the mean±SD of triplicate experiments. *p<0.05, **p<0.01, versus LPS alone.

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Fig. 4. Inhibitory effects of SCPE, DCPE, and FCPE on the production of TNF-α (A), IL-6 (B), and IL-1β (C) in LPS-stimulated RAW264.7 mur ine macrophage cell. RAW264.7 cells were treated with extracts and LPS (1 μg/mL) for 24 hr. The concentrations of TNF-α , IL-6, and IL-1β were measured by ELISA. LPS(-), PBS without LPS; LPS (+), PBS with LPS. The data represent the mean±SD of triplicate experiments. *p<0.05, **p<0.01, versus LPS alone.

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LPS로 염증이 유발된 RAW264.7 cell에서 염증 유발에 관여하는 단백질인 iNOS와 COX-2의 발현에 미치는 효과 를 Western blotting을 통하여 확인하였다. 시기별 병귤 추출 물 처리군에서는 iNOS 단백질의 발현은 현저히 억제하였 으나 COX-2 단백질의 발현에는 별다른 영향을 미치지 않 는 것으로 보였다. iNOS는 NO의 과잉생산에 관여하여 혈 관 투과성, 부종 등의 염증반응을 촉진 시키고, 염증 매개체 의 생합성을 촉진하여 염증을 심화시키는 것으로 알려져 있다. iNOS 단백질의 발현을 SCPE의 경우 200 μg/mL로 처리하였을 때 세포 독성 없이 80% 이상 억제하였고 시기 적으로 12월 2월로 갈수록 그 활성이 낮아짐을 확인 할 수 있었다(Fig. 5). 그러나 염증반응에서 PGE(prostaglandin) 2의 생성에 관여하는 것으로 알려진 COX-2의 단백질 발현 억제에는 영향을 미치지 못하는 것으로 보인다. 이는 COX-2에 의한 PGE2의 합성 저해 효과 보다는 iNOS의 발현 을 억제하여 염증반응과 관련된 NO의 생성 억제 효과를 나타내는 것으로 여겨진다. 이러한 항염 활성의 차이를 추 출물이 함유하고 있는 성분의 분석으로 알아보고자 HPLC 를 이용하여 병귤 추출물인 SCPE, DCPE, FCPE의 플라보 노이드 성분을 분석하고자 하였다.

Fig. 5. Inhibitory effects of SCPE, DCPE, and FCPE on the expression of inducible nitr ic oxide synthases (iNOS) and COX-2 in LPS-stimulated RAW264.7 murine macrophage cell line. RAW264.7 cells were treated with extracts and LPS (1 μg/mL) for 24 hr. Total protein were resolved by SDS-PAGE and protein expressions were determined by Western blot analysis. LPS (-), PBS without LPS; LPS (+), PBS with LPS.

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CPE의 항염 활성을 측정한 결과 9월 과피 추출물(SCPE) 에서 가장 높았으며 이는 병귤에 함유되어 있는 플라보노이 드 성분에 의한 것으로 여겨진다. CPE의 플라보노이드 성 분 분석은 rutin, narirutin, naringin, hesperidin, neohesperidin, NHDC, quercetin, apignin, naringenin, hesperetin, nobilrtin, tangeretin의 함유량을 분석하였다. 그 결과 모세혈관을 튼 튼하게 하고 출혈을 예방하며, 혈압 조절작용을 하는 것으 로 알려진 rutin(17)이 추출물 100 g 당 4.52 g으로 함량이 가장 높았으며, rutin>hesperidin>narirutin>nobiletin>tangeretin 순으로 함유량이 높은 것을 확인 할 수 있었다(Table 1). 특히 감귤류에 다량 함유되어 있는 polymethoxyflavonoid로 항바이러스, 항암, 항염 등의 활성과, reactive oxygen species(ROS) 또는 염증반응으로부터 피부를 보호하는 역 할을 하는 것으로 알려져 있는 nobiletin(18-21)과 항암 활성 이 있는 것으로 알려진 tangeretin(22,23)의 함량이 SCPE에 서 각각 1.52와 0.76 g%로 높았다. 그러나 일반적으로 과실 이 성숙할 수 록 당도는 높아지고 플라보노이드 함량은 감소하는 것으로 알려져 있는데 특히 polymetoxyflavonoid 인 nobiletin과 tangeretin의 함량이 줄어드는 것을 확인 할 수 있었고(24) 이는 CPE의 항염 활성에도 영향을 미친것으 로 여겨진다. 또한 quercetin, naringenin, hesperetin 등의 비 배당체 플라바논이 다량 함유되어 있어 항산화 활성 역시 높은 것으로 보인다.

따라서 감귤류에만 함유되어 있는 nobiletin과 tangeretin 의 함량이 높은 CPE는 항산화 및 항염 활성이 우수하였으 며, SCPE에서 가장 우수한 활성을 보였다. 이는 병귤을 이용한 항산화 및 항염 활성의 기능성 소재로 개발할 시 9월의 과피를 소재로 활용하면 우수한 천연소재로의 활용 이 가능할 것으로 여겨진다.