4 kGy로 감마선 살균처리된 환자용 균형영양식의 유전독성 평가

본 연구에서는 모델 식품으로 식품공전의 식품유형 중 환자용 균형영양식의 규격 기준에 부합하도록 분말 원료들 과 미네랄 및 비타민 분말이 혼합된 분말 조제품을 ㈜이롬 으로부터 공급받아 사용하였다(Table 1). 즉, 제품 1,000 kcal 당 단백질, 칼슘, 철, 아연, 비타민 A, B1, B2, B6, C, D, E, 나이아신 및 엽산 등이 일일 영양소 기준치의 50% 이상 함유하도록 영양소를 강화하였으며, 예비실험을 통해 10 kGy의 흡수선량으로 감마선 조사처리 시료의 영양성분 이 규격 기준 이상 함유하도록 첨가량을 조정하였다. 제조 된 최종 제품 40 g을 각각 LDPE(low density polyethylene) 포장지에 넣어 포장한 후 Co-60 감마선 조사시설(IR-70 gamma irradiator, MDS Nordian, Montreal, Canada)에서 2, 4, 6, 8 및 10 kGy의 흡수선량(선량률 10 kGy/h)이 되도록 20℃의 실온조건 하에서 감마선 조사처리하였다. 시료가 실제 흡수한 선량의 확인을 위해 alanine dosimeter(Bruker BioSpin GmbH, Rheinstetten, Germany)를 조사처리 전 포장 지에 부착하였으며, 조사처리 후 electron para-magnetic resonance analyzer(e-scan^TM alanine dosimeter reader, Bruker BioSpin GmbH)로 분석하였다. 이 dosimetry 시스템은 국제 원자력기구의 절차에 따라 표준화한 후 사용하였으며, 측 정된 흡수선량의 오차는 목표선량의 5% 이내였다.

감마선 흡수선량에 따른 시료의 총호기성세균, 효모 및 곰팡이, Bacillus cereus, Clostridium perfringens, 대장균군 생균수를 측정하였다. 즉, 시료 10 g에 대하여 멸균된 0.1% 의 peptone수 90 g을 가하여 1분간 Stomacher Lab Blender(Model 400, Tekmar Co., Cincinati, OH, USA)을 이 용하여 균질화한 후 10진 희석법으로 희석하였다.

단계별로 희석된 시료 100 μL를 각각의 배지에 도말하였 고 총호기성세균은 plate count agar(PCA, Difco Co., Detroit, MI, USA), 효모 및 곰팡이는 potato dextrose agar(PDA, Difco Co.), B. cereus는 mannitol egg yolk polymyxin agar(MYP, Difco Co.), Cl. perfringens는 tryptose sulfite cycloserine agar(TSC, Oxoid, Basingstoke, England), 대장균 군은 3M 건조필름 배지(3M Co., St. Paul, MN, USA)를 사용하였다. 건조필름, PCA, MYP 배지는 incubator (MIR-262, SANYO Electric Biomedical Co., Ltd., Ozu, Japan) 를 이용하여 35℃에서 24-48시간, PDA 배지는 25℃에서 3-5일간 호기적 조건에서 배양하였으며, TSC는 CO₂ 발생 가스팩을 개봉하여 anaerobic jar(BD GasPak^TM EZ, BD Diagnostics, Saparks, MD, USA)에 같이 넣어 미호기적 환경 을 조성한 후 35℃에서 48시간 배양하였다. 각각의 배지에 서 집락을 계수하여 시료 1 g당 colony-forming unit(CFU)으 로 나타내었으며, 대장균군은 배양한 건조필름 배지에서 생성된 붉은 집락중 주위에 기포를 형성한 집락수를 계산하 였다. 미생물 검출을 위한 최소 한계치는 101 CFU/g이었다.

모델식품에 대한 복귀돌연변이원성 시험은 OECD guideline TG 471(13)에 따라 수행하였다. 시험에 사용된 균주는 Salmonella Typhimurium LT2를 친주로 하는 S. Typhimurium TA98, TA100, TA1535, TA1537로 국립보건 연구원(Osong, Korea)으로부터 분양받아 계대 보존하여 사 용하였다. 이들 균주는 사용에 앞서 histidine 요구성, crystal violet 감수성, ampicillin 내성, spontaneous 복귀변이 수 등 을 확인하였다. 시험물질 제조를 위해 열수 추출물은 시료 10 g에 물 100 mL을 넣어 95℃ 항온 수조에서 24시간 동안 진탕 추출하였고 메탄올 추출물은 시료 10 g에 95% 메탄올 100 mL를 넣어 실온(24℃) 항온수조에서 2시간 동안 진탕 추출하였다. 각각의 추출물은 여과지(Whatman No. 2, Kent, UK)에 여과한 후 회전진공농축기(EYELA Co., Tokyo, Japan)로 24시간 건조하였다. 부형제로 열수 추출물은 멸균 증류수, 메탄올 추출물은 dimethyl sulfoxide(DMSO)를 사 용하였다. 예비실험을 통해 침전이 없고 세포독성을 나타 내지 않은 5,000 μg/plate를 최대 농도로 설정하였고 공비 2로 희석하여 5단계의 농도군을 설정하였다. 균주를 nutrient broth에 하룻밤 동안 배양하여 대수기(2×109 cells/mL) 상태에 이르도록 한 다음 배양액 0.1 mL에 단계별 로 희석된 시험물질 0.1 mL을 첨가하였다. 대사활성계 적용 군에는 S9 mixture(20%, v/v) 0.5 mL을 첨가하였고 비적용 군에는 phosphate buffered saline(pH 7.4) 0.5 mL을 혼합하 여 37℃에서 30분간 pre-incubation 하였다. 이후 혼합된 시 료를 histidine/biotin을 함유한 top agar 2 mL에 투입한 후 minimal glucose agar 배지에 부어 굳히고 37℃에서 48시간 동안 배양하여 복귀돌연변이 집락을 계수하였다. 음성대조 물질로는 멸균 증류수 또는 DMSO를, 양성대조물질로는 sodium azide(SA), 4-nitroquinoline N-oxide(4NQO), acridine mutagen ICR-191(ICR-191), benzopyrene(BP) 및 2- aminoanthracene(2-AA) 등을 각 시험 균주의 특성에 맞추어 사용하였다.

환자용 균형영양식의 염색체 이상 시험은 OECD guideline TG 473(14)에 따라 Chinese hamster lung(CHL) fibroblast 세포주를 이용하여 실시하였다. 배지는 minimal essential medium에 fetal bovine serum(FBS)을 5% 되도록 첨가하여 사용하였으며, 음성대조물질로는 시험물질의 용 매인 멸균 증류수와 DMSO를, 양성대조물질로는 대사 활 성 조건하에서는 BP를 DMSO에 용해시켜 사용하였으며, 대사 활성 부재 하에서는 mitomycin C(MMC)를 멸균 증류 수에 용해시켜 사용하였다. 예비시험에서 실험물질을 처리 하여 세포증식 억제 여부를 관찰한 결과 최고농도를 5,000 μg/mL로 설정하였으며, 공비를 2로 하여 5단계(0, 625, 1,250, 2,500, 5,000 μg/mL)로 희석하여 본 실험을 실시하였 다. S9 mixture, 시험물질 및 양성대조물질이 포함된 배양액 으로 6시간 배양한 다음 보통의 배양액으로 교환하여 16시 간 동안 더 배양한 후 colcemid를 0.2 μg/mL이 되도록 처리 한 다음 2시간 경과 후 0.05% trypsin-ethylene diamine tetra-acetic acid를 첨가하여 원심분리(150 ×g, 5분)하였다. 상등액을 제거한 후 저장액(0.075 M KCl) 4 mL로 현탁하고 37℃ 수조에서 20분간 방치하였으며, 고정액(methanol: acetic acid=3:1, v/v)으로 3회 고정시킨 후 공기 건조법으로 슬라이드를 제조하여 5% Giemsa로 30분간 염색하였다. 제 작된 슬라이드는 광학현미경 하에서 1,000배의 배율로 각 시험군당 100개의 잘 퍼진 분열 중기 상에 대하여 동원체수 및 염색체 이상의 유무를 관찰하고, 이상의 종류와 수를 기록하였다.

실험동물은 ICR 마우스(수컷, 7주령)를 사용하여 온도 22±3℃, 상대습도 50±20%, 환기횟수 10-15회, 조명주기 12 시간, 조도 150-300 lux의 환경조건으로 설정된 호서대학교 안전성평가센터의 청정 동물 사육실에서 약 1주일간의 순 화기간을 거친 후 4 kGy로 감마선 조사처리한 환자용 균형 영양식을 경구 투여하였다. 예비시험으로 환자용 균형영양 식 분말을 멸균 증류수에 현탁하여 경구 투여가 가능한 최고 농도인 2,000 mg/kg body weight를 투여하여 관찰한 결과 모든 동물에서 특별한 육안적 이상 소견이 관찰되지 않았다. 이에 2,000 mg/kg를 본 시험의 고용량으로 설정하 고, 공비를 2로 하여 총 4단계의 농도군(0, 500, 1,000, 2,000 mg/kg bw)에 대하여 각각 5마리의 ICR 마우스에 주사기로 1회 경구 투여하였다. 양성대조물질인 cyclophosphamide monohydrate(CPA)는 투여용량이 80 mg/kg bw이 되도록 corn oil에 용해하여 마우스의 복강에 투여하였다. 시험물질 의 투여 후 24시간이 경과한 다음 Schmid(15)의 방법에 따라 골수 검체를 제작하였다. 즉, 마우스의 대퇴골에서 골수를 적출하여 FBS로 현탁하였다. 마우스당 2,000개의 다염성적혈구(polychromatic erythrocyte, PCE)를 관찰하여 그 중 소핵을가진다염성적혈구(micronucleated polychromatic erythrocyte, MNPCE)의 수를 계수하였다. 또한 총 적혈구 (PCE+normochromatic etythrocyte(NCE)) 중 PCE값(PCE/ (PCE+NCE))을 산출하여 세포독성 여부를 확인하였다. 본 실험은 호서대학교 안전성평가센터의 동물실험윤리위원 회에 의해 승인을 받아 진행되었다(HTRC-15-01).

모든 측정 결과는 평균값±표준편차로 나타내었으며, Statistical Package for the Society Science(SPSS, windows ver 22.0, IBM, Armonk, NY, USA)을 이용하여 각 시료간의 유의성을 검증한 후 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test로 사후검정을 실시하였다.

모델식품의 미생물학적 오염도와 흡수선량에 따른 생균 수 변화 측정 결과를 Table 2에 나타내었다. 비조사구의 경우 총 호기성세균과 진균류가 각각 2.6, 2.7 log CFU/g로 나타났고B. cereus와 대장균군이 각각 2.5와 2.6 log CFU/g 으로 검출되었다. 식품공전 중 모델식품의 제품유형인 환 자용 균형영양식의 미생물학적 기준은 총 호기성세균이 103 CFU/g이하, B. cereus가 10² CFU/g 이하, 대장균군이 음성이여야 한다. 따라서 모델식품의 경우 총호기성세균에 대한 규격을 만족하고 있으나, B. cereus에 대한 기준치 초 과와 대장균군의 검출로 인하여 추가적인 살균 공정이 필요 한 것으로 사료된다.

흡수선량에 따른 모델식품의 생균수 변화를 측정한 결 과, 2 kGy 조사처리구에서 진균류를 제외한 나머지 시험항 목에 있어 모두 1 log CFU/g의 검출한계 이하로 나타났고 4 kGy 이상의 흡수선량으로 감마선 조사처리 시 모든 항목 에서 검출한계 이하였다. 2 kGy 조사처리구 역시 식품공전 의 미생물 규격 기준을 만족하고 있으나, 원재료 내 미생물 오염 수준의 변화에 대한 미생물학적 안전성을 확보하기 위하여 4 kGy의 흡수선량을 모델식품의 위생화를 위한 살 균처리 선량으로 설정하였다.

감마선 조사처리(4 kGy)된 모델식품의 복귀돌연변이 유 발능 평가 결과를 Table 3에 나타내었다. 시험에 사용된 모든 시험균주(S. Typhimurium TA 98, TA 100, TA 1535, TA 1537)에 대하여 열수 및 메탄올 추출물 모두 대사활성계 존재 유무와 상관없이 음성대조군과 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다. 반면 열수 추출물과 메탄올 추출물 각각에 대한 양성대조군의 경우 음성대조구와 유의적인 차이를 나타내었다(p<0.05). 일반적으로 돌연변이원성의 판정은 음성대조군 복귀변이 집락 수의 2배 이상인 경우를 양성으로 한다. 본 연구의 결과를 통해 4 kGy의 흡수선량으 로 감마선 살균처리된 환자용 균형영양식의 열수 및 메탄올 추출물은 본 시험조건 하에서 사용한 모든 시험균주에 대하 여 복귀돌연변이를 유발하지 않는 것으로 판단하였다. 이 와 같은 결과는 감마선 조사된 닭고기가 복귀돌연변이를 유발하지 않는다는 Kwak 등(16)의 보고와 일치하였다.

감마선 조사처리된 모델식품의 염색체 이상 유발능 평가 결과를 Table 4에 나타내었다. 대사활성계 존재시의 양성대 조군으로 사용된 B[α]P의 경우 77개의 중기상 세포만이 정상을 나타내어 양성의 염색체 이상 유발능을 나타내었으 나, 열수 추출물과 메탄올 추출물 모두 시험 구간내에서 99개 이상의 중기상 세포가 정상으로 나타났다. 또한 대사 활성계 부재시의 양성대조군으로 사용된 MMC의 경우 역 시 75개의 중기상 세포만이 정상으로 나타나 염색체 이상 양성을 나타내었으나, 시험물질 모두 농도와 상관없이 98 개 이상의 정상세포인 것으로 나타났다. CHL 세포의 경우 통상 자연발생의 염색체 이상을 가진 중기세포 출연율은 3%를 초과하는 일이 거의 없으므로 5% 미만의 평균 이상 중기상 출연율을 음성으로 판정하며, 10% 이상의 염색체 이상이 나타날 경우 양성으로 판단한다(17). 따라서 본 연구 결과는 4 kGy의 흡수선량으로 조사처리된 환자용 균형영 양식의 염색체 이상 유발성이 없다는 것을 의미하며, 30 kGy로 감마선 조사처리된 돈육이 염색체 이상을 유발하지 않았다는 Kang 등(18)의 연구와도 일치하였다.

감마선 조사처리된 모델식품의 소핵 유발능과 세포독성 평가 결과를 Table 5에 나타내었다. 개체 당 2,000개의 다염 성적혈구(PCE)를 대상으로 소핵을 가지는 다염성적혈구 (MNPCE)의 발현빈도는 전 시험용량 단계를 걸쳐 음성대 조군(멸균 증류수)과 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 한편 양성대조물질인 cyclophosphamide monohydrate 80 mg/kg bw을 투여한 양성대조군에서는 음성대조군에 비해 소핵 발현빈도가 45배 높게 나타나 유의적인 차이가 있었 다(p<0.05). 시험물질의 세포독성 지표인 총 적혈구(PCE+ NCE) 중 PCE의 비율은 모든 용량처리군에서 0.51% 수준인 음성대조군에 비해 유의적인 차이가 없었다. 소핵의 생성 은 마우스 골수 내에서 erythroblast가 최종 분열한 후 탈핵 과정을 거쳐 미성숙 적혈구인 PCE가 되는데, 이때 핵이 있는 erythrocyte 상태에서 시험물질이 돌연변이를 유발하 는 특성이 있다면 염색체 변이가 발생하여 더 이상 분화하 지 못하고 파편으로 남아 PCE 내에 존재할 때 발생된다. 소핵 시험의 양성 평가는 PCE/(PCE+NCE) 비율이 0.1 이상 인 경우 시험 수행이 적절한 것으로 하고 MNPCE의 빈도가 통계학적으로 유의하며, 용량 의존적으로 증가하거나 하나 이상의 용량에서 재현성 있는 양성 반응을 나타낼 때 이루 어진다(19). 본 실험결과 PCE/(PCE+NCE) 비율이 0.1 이상 이고 최대 실험 농도인 2,000 mg/kg bw 이하에서 모두 소핵 유발빈도가 음성대조군에 비해 유의적인 차이가 없었으므 로 4 kGy의 흡수선량으로 감마선 조사처리된 환자용 균형 영양식은 소핵 유발능이 없는 것으로 판단하였으며, 10 kGy 이하로 감마선 조사처리한 과메기의 섭취가 마우스 골수 세포에 소핵을 유발하지 않는다는 Yook 등(20)의 결과 와 일치하였다.